Abstract
目的
了解瑞巴派特(rebamipide)在预防尿酸盐晶体诱导的大鼠痛风性关节炎急性发作中的作用。
方法
42只雄性大鼠按随机表法分为3组(n=14)，以尿酸盐晶体制备大鼠急性痛风性踝关节炎模型，A组口服瑞巴派特治疗，B组口服秋水仙碱治疗，C组口服安慰剂治疗，观察各组踝关节的临床表现及病理变化，检测大鼠血清中白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α水平。
结果
C组大鼠关节炎的临床评分、肿胀指数在24 h达到最大值，后逐渐下降，72 h基本恢复正常。造模24 h后，C组的临床评分明显高于A组和B组[2 (1~3) vs.0 (0~1) vs.1 (0~2)]，差异有统计学意义(P=0.008)；C组的肿胀指数明显高于A组和B组[0.36 (0.16~0.52) vs. 0.11 (0~0.20) vs. 0.12 (0~0.16)]，差异有统计学意义(P=0.005)；组织学上，C组的滑膜组织中有大量中性粒细胞浸润[5分量表评分为4 (2~4)]，A组[1 (0~2)]与B组[1 (0~2)]未见明显炎性细胞浸润，差异有统计学意义(P < 0.001)。造模24 h后，C组大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平明显高于A组和B组[IL-1β：(41.86±5.72) vs. (27.35±7.47) vs. (27.76±5.28) ng/L；IL-6：(1 575.55±167.11) vs. (963.53±90.22) vs. (964.08±99.31) ng/L；IL-10：(37.96±3.76) vs. (21.68±4.83) vs. (16.20±2.49) ng/L；TNF-α：(21.32±1.34) vs. (15.82±2.54) vs. (17.35±7.47) μg/L]，差异均有统计学意义(P < 0.001)。
结论
瑞巴派特在大鼠痛风模型中对痛风性关节炎急性发作起预防保护作用。
Keywords: 痛风性关节炎, 瑞巴派特, 动物模型, 大鼠
Abstract
Objective
To investigate the role of rebamipide in the treatment of acute gout arthritis rats induced by monosodium urate (MSU) crystal.
Methods
Forty-two male rats were randomly divided into three groups (n=14). Group A was treated with oral rebamipide, group B with oral colchicine, and group C with oral placebo. The rats were monitored for the induction of arthritis with clinical manifestations and pathological changes, and the levels of interleukin (IL)-1β、IL-6、IL-10, and tumor necrosis factor (TNF)-α in serum were measured.
Results
In group C, the clinical score and swelling index reached the maximum in 24 h, and then gradually decreased to 72 h. After 24 h of model induced, the clinical scores in group C were significantly higher than those in group A and group B [2 (1-3) vs. 0 (0-1) vs. 1 (0-2), P < 0.01], the swelling indexes in group C were significantly higher than those in group A and group B [0.36 (0.16-0.52) vs. 0.11 (0-0.20) vs. 0.12 (0-0.16), P < 0.01]. Histologically, after 24 h of model induced, there was a large number of neutrophil infiltration in the synovium of group C [scale score: 4 (2-4)], and there was no significant inflammatory cell infiltration in group A [1 (0-2)] and group B [1 (0-2)], the difference was statistically significant (P < 0.001). After 24 h of model induced, the levels of IL-1β, IL-6, IL-10, and TNF-α in serum of group C were significantly higher than those in group A and B [IL-1β: (41.86±5.72) vs. (27.35±7.47) vs. (27.76±5.28) ng/L, IL-6: (1 575.55±167.11) vs. (963.53±90.22) vs. (964.08±99.31) ng/L, IL-10: (37.96±3.76) vs. (21.68±4.83) vs. (16.20±2.49) ng/L, TNF-α: (21.32±1.34) vs. (15.82±2.54) vs. (17.35±7.47) μg/L, P < 0.001].
Conclusion
Rebamipide has a protective effect on acute gout arthritis rats induced by MUS crystals.
Keywords: Gouty arthritis, Rebamipide, Animal models, Rats
痛风是血尿酸升高、尿酸盐(monosodium urate，MSU)结晶沉积在关节中引起关节肿痛的炎症性疾病，主要临床表现为反复发作的急性痛风性关节炎，发作时患者会出现剧烈疼痛，严重影响生活质量。近30年来我国高尿酸血症和痛风的发生率急剧升高[1]，目前我国痛风患病率为1%~3%，且逐年上升，痛风已成为严重危害人们身体健康的常见疾病。国内外对痛风性关节炎急性发作时的治疗主要是使用非甾体抗炎药、秋水仙碱、糖皮质激素[2]，临床中长期痛风的患者常合并肾功能不全、代谢性疾病、消化道溃疡等，随着我国人口老龄化加剧，老年痛风性关节炎患者越来越多，但上述三种药物的使用却受到限制。
瑞巴派特(rebamipide)作为一种治疗消化道溃疡、急慢性胃炎、急性加重期胃黏膜病变的药物，已于临床应用20余年，安全性、耐受性良好。体外研究表明，胃黏膜保护剂瑞巴派特可以通过调节氧化应激与Caspase-1抑制尿酸盐晶体诱导的白细胞介素(interleukin，IL)-1β的产生[3]。以往研究显示，瑞巴派特通过抑制炎症因子、氧化应激等机制，对骨关节炎[4]和干燥综合征[5]等炎症性疾病有治疗作用，但对于急性痛风性关节炎这种细胞因子在发病机制中起重要作用的炎症性疾病，瑞巴派特的作用尚不明确，本研究的目的是通过动物实验探讨瑞巴派特在痛风性关节炎急性发作中的作用。
1. 材料与方法
1.1. 实验动物
42只雄性Sprague-Dawley大鼠购自安徽医科大学实验动物中心，大鼠体质量(240±20) g。实验开始前，大鼠在中国科技大学附属第一医院动物房中进行5~7 d的驯化，温度25 ℃，湿度50%，12 h光暗交替周期。实验过程中所有大鼠均喂食标准的实验室饲料，本研究动物实验方案经中国科技大学附属第一医院动物管理与使用委员会批准。
1.2. 分组及给药
实验开始前对大鼠进行称重和标记，使用Excel软件创建随机表，42只大鼠按随机表法分为3组，每组14只。A组为口服瑞巴派特，B组为口服秋水仙碱，C组为口服安慰剂(生理盐水)。瑞巴派特的剂量为每日200 mg/kg，以生理盐水配制成9 mL溶液，每隔8 h灌胃3 mL。秋水仙碱的剂量为每日1 mg/kg，以生理盐水配制成6 mL溶液，分两次灌胃。痛风性关节炎造模6 h前，三组分别以各自相应药物3 mL灌胃一次，造模后，A组每隔8 h以瑞巴派特溶液3 mL灌胃一次，B组每隔8 h灌胃一次，第一次与第三次给予秋水仙碱溶液3 mL，第二次给予生理盐水3 mL，C组每隔8 h以生理盐水3 mL灌胃一次。
1.3. 制备大鼠急性痛风性关节炎模型
将MSU晶体(Sigma，St.Louis，MO，USA)混合在10%(体积分数)Tween-80溶液中，0.9%(质量分数)生理盐水，10%(体积分数)氯仿麻醉下，用1 mL注射器抽吸50 μL(内含5 mg MSU)以针尖45°注入大鼠右踝关节。观察0、6、12、24、48、72 h各时间点大鼠踝关节的临床表现，分别于0、48、72 h每组各处死2只大鼠，于24 h时每组处死8只大鼠。用毛细采血管眼眶静脉穿刺采集血样，室温下凝结30 min，10 000 r/min离心5 min，将上清转移到1.5 mL微量离心管中，-80 ℃保存。
1.4. 急性痛风性关节炎的评估
通过临床评分或肿胀指数[使用宽条(2~3 mm)和卡尺测量右踝关节肿胀]来监测大鼠的关节炎诱导情况。踝关节评分[6]：0=正常；1=踝关节轻度肿胀和发红，可见体表骨性标志，轻度跛行；2=踝关节明显肿胀和发红局限于踝关节，体表骨性标志消失，明显跛行；3=踝关节外肢体肿胀，脚完全离地，三足步态。各时间点于处死大鼠前观察踝关节的临床表现，测量右踝关节周长，肿胀指数=(测量时间点的关节周长-初始周长)/初始周长[6]。
取大鼠血清标本，用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒(R & D Systems，Minnesota，USA)检测血清中IL-1β、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α水平。使用微板读取器在450 nm处读取光密度值。
1.5. 组织学检查
分离大鼠踝关节，以10%(体积分数)甲醛溶液固定，脱钙液脱钙过夜，从矢状面切开，石蜡包埋，制成2 μm切片，苏木精-伊红染色。采用手动计数计算中性粒细胞的滑膜浸润，并使用5分量表进行评估[7]：0=正常，1=最小浸润，2=轻度浸润，3=中度浸润，4=强浸润。
1.6. 统计学分析
采用SPSS 23.0软件，计量资料以x±s表示，等级资料以中位数(最小值~最大值)表示，组间两两比较采用单因素方差分析，等级资料采用非参数检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. MSU诱发急性痛风性关节炎的临床和组织学表现
实验过程中所有实验动物生长良好，24 h时，C组剩余12只大鼠中有3只未出现典型的关节炎，造模成功率75%。C组的临床评分12 h高于6 h，24 h达到最大值，48和72 h持续下降，肿胀指数在24 h达到峰值，后逐渐下降，到72 h基本恢复正常(图 1)。A组和B组的临床评分和肿胀指数随时间推移未见显著变化(图 2)。
图 1.
尿酸盐晶体诱导的痛风性关节炎急性发作大鼠模型
Rat model of acute gout arthritis induced by monosodium urate crystals
图 2.
痛风性关节炎模型诱导后5个时间点各组大鼠的临床评分和肿胀指数
Clinical score and swelling index of the three rat groups at the five time points after model induced
造模24 h时，C组的临床评分[2 (1~3)]明显高于A组[0 (0~1)]和B组[1 (0~2)]，差异有统计学意义(P < 0.01，表 1)；C组的肿胀指数[0.36 (0.16~0.52)]也明显高于A组[0.11 (0~0.20)]和B组[0.12 (0~0.16)]，差异有统计学意义(P < 0.01，表 1)。
表 1.
造模24 h后三组大鼠血清细胞因子、临床表现、组织学变化的比较
Comparison of serum cytokines, clinical manifestations and histological changes in three rat groups at 24 h after modeling
| Items | Rebamipide group | Colchicine group | Placebo group | F value | P value |
| Comparison between the rebamipide group and the colchicine group, the P value >0.05; Comparison between the rebamipide group and the placebo group, or the colchicine group and the placebo group, the P value < 0.01. Data are presented as x±s or median (minimum-maximum). IL, interleukin; TNF, tumor necrosis factor. | |||||
| IL-1β/(ng/L) | 27.35±7.47 | 27.76±5.28 | 41.86±5.72 | 14.06 | < 0.001 |
| IL-6/(ng/L) | 963.53±90.22 | 964.08±99.31 | 1 575.55±167.11 | 65.18 | < 0.001 |
| IL-10/(ng/L) | 21.68±4.83 | 16.20±2.49 | 37.96±3.76 | 35.60 | < 0.001 |
| TNF-α/(μg/L) | 15.82±2.54 | 17.35±7.47 | 21.32±1.34 | 15.63 | < 0.001 |
| Clinical score | 0 (0-1) | 1 (0-2) | 2 (1-3) | 0.008 | |
| Swelling index | 0.11 (0-0.20) | 0.12 (0-0.16) | 0.36 (0.16-0.52) | 0.005 | |
| Infiltration of inflammatory cells | 1 (0-2) | 1 (0-2) | 4 (2-4) | < 0.001 | |
造模24 h时，C组滑膜组织中有大量中性粒细胞浸润[5分量表评分为4 (2~4)]，A组[1 (0~2)]与B组[1 (0~2)]未见明显炎性细胞浸润(图 3)。C组的中性粒细胞浸润评估明显高于A组和B组，差异有统计学意义(P < 0.001, 表 1)。
图 3.
各组大鼠不同时间点踝关节滑膜中炎性细胞的浸润(HE ×400)
The infiltration of inflammatory cells in ankle joint synovium at the different time points of the three rat groups (HE ×400)
2.2. 三组大鼠血清炎症因子的变化
C组大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的水平呈先升高后下降的趋势，A组和B组各因子的水平无明显变化规律(图 4)。
图 4.
造模后4个时间点三组大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平的变化
Changes of serum IL-1β, IL-6, IL-10, and TNF-α levels in three rat groups at the 4 time points after induced by MSU crystals
IL, interleukin; TNF, tumor necrosis factor.
造模24 h后，C组大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平明显高于A组和B组, 差异均有统计学意义(P < 0.001，表 1)。
3. 讨论
急性痛风性关节炎发作时，沉积的MSU晶体可诱导大量炎症细胞(如中性粒细胞和单核细胞)渗入关节滑膜，伴有剧烈的红肿热痛和血管通透性增加[8]，症状在发病12~24 h内达高峰，通常在1~2周内缓解[9]。既往的急性痛风性关节炎的动物模型研究显示，通过大鼠右踝关节注射MSU后成功诱导了急性痛风性关节炎发作[4]。本研究中观察到安慰剂对照组大鼠右踝关节注射MSU后的临床表现和炎症细胞浸润与痛风患者急性发作的表现一致，炎症反应在造模后24 h前后最为明显，表明本研究使用MUS晶体成功诱导了痛风性关节炎的急性发作。
急性痛风性关节炎作为一种炎症性疾病，细胞因子在其发病机制中起重要作用，目前认为，IL-1β是诱导急性痛风性关节炎发病的主要细胞因子，甚至有研究提出急性痛风性关节炎是IL-1β炎性疾病的原型[10]。Caspase-1可以激活促炎细胞因子IL-1和IL-8，在一种胶原蛋白实验性关节炎的小鼠模型中，Caspase-1抑制剂抑制了IL-1β的产生，改善了疾病的严重程度和进程[11]。氧化应激是痛风性关节炎急性发作的另一重要因素，有研究表明，抑制活性氧生产和减少氧化应激可以预防和缓解痛风性关节炎的急性发作[12]。
瑞巴派特的主要作用机制是诱导前列腺素合成、激活生长因子、抑制氧化应激介导的炎症[13]，同时通过抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)转录因子的激活，抑制IL-1β、TNF-α和IL-8的产生[14-15]。一项使用瑞巴派特治疗环磷酰胺诱导的大鼠膀胱炎的动物模型研究显示，瑞巴派特抑制了大鼠体内的髓过氧化物酶、IL-1β、IL-6和TNF-α的表达[16]。一项小鼠骨关节炎动物模型的研究也显示，瑞巴派特下调了IL-1β、TNF-α和NF-κB等的mRNA表达[17]。人类细胞系体外实验中，瑞巴派特通过抑制Caspase-1与氧化应激，有效抑制了由MSU晶体介导的IL-1β的激活和释放[3]。既往研究结果提示，瑞巴派特可能具有预防痛风关节炎急性发作的作用。
本研究发现，在安慰剂组中，MSU晶体诱导的痛风性关节炎大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的水平呈现先升高后下降的趋势，于造模后24 h达到高峰，而瑞巴派特组和秋水仙碱组大鼠血清中各因子水平随时间推移无明显变化，与安慰剂组相比差异有统计学意义(P < 0.01)，瑞巴派特组和秋水仙碱组间差异无统计学意义(P>0.05)，提示瑞巴派特和秋水仙碱均可抑制MSU晶体诱导的痛风性关节炎大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的产生，瑞巴派特抑制炎症因子产生的效果与秋水仙碱相当。
秋水仙碱是临床广泛使用的治疗、预防痛风性关节炎急性发作的首选药物之一[2]。本研究显示，在提前给予秋水仙碱和瑞巴派特口服的大鼠组，右踝关节注射MSU晶体后未观察到明显的痛风性关节炎急性发作的临床表现，关节组织病理也未见明显的炎性细胞浸润，而在给予安慰剂对照的大鼠组，我们观察到了典型的痛风性关节炎急性发作的临床过程，关节滑膜组织中可见大量炎性细胞浸润。在关节炎临床评分、肿胀指数、中性粒细胞浸润程度等方面，安慰剂对照组都明显高于秋水仙碱组和瑞巴派特组(P < 0.01)，瑞巴派特组和秋水仙碱组间差异无统计学意义(P>0.05)，提示瑞巴派特和秋水仙碱成功预防了MUS晶体诱导的痛风性关节炎的急性发作，且两者之间的疗效相当。
综上所述，本研究通过在大鼠踝关节注射MSU晶体成功诱导了大鼠痛风性关节炎急性发作，大鼠造模前提前给予瑞巴派特和秋水仙碱可以抑制MSU晶体诱导的痛风性关节炎急性发作，同时抑制关节滑膜炎性细胞浸润，抑制血清中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α等炎性细胞因子产生。
Funding Statement
安庆市医疗卫生科技计划项目(2018Z2003)
Supported by the Anqing Medical Technology Project (2018Z2003)
References
- 1.路 杰, 崔 凌凌, 李 长贵, et al. 原发性痛风流行病学研究进展. 中华内科杂志. 2015;54(3):244–247. doi: 10.3760/cma.j.issn.0578-1426.2015.03.020. [DOI] [Google Scholar]
- 2.中华医学会风湿病学分会 2016中国痛风诊疗指南. 中华内科杂志. 2016;55(11):892–899. doi: 10.3760/cma.j.issn.0578-1426.2016.11.019. [DOI] [Google Scholar]
- 3.Kim SK, Choe JY, Park KY. Rebamipide suppresses monosodium urate crystal-induced interleukin-1β production through regulation of oxidative stress and Caspase-1 in THP-1 cells. Inflammation. 2016;39(1):473–482. doi: 10.1007/s10753-015-0271-5. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 4.Moon SJ, Woo YJ, Jeong JH, et al. Rebamipide attenuates pain severity and cartilage degeneration in a rat model of osteoarthritis by downregulating oxidative damage and catabolic activity in chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage. 2012;20(11):1426–1438. doi: 10.1016/j.joca.2012.08.002. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.Kohashi M, Ishimaru N, Arakaki R, et al. Effective treatment with oral administration of rebamipide in a mouse model of Sjögren's syndrome. Arthritis Rheum. 2008;58(2):389–400. doi: 10.1002/art.23163. doi: 10.1002/art.23163. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 6.Coderre TJ, Wall PD. Ankle joint urate arthritis (AJUA) in rats: an alternative animal model of arthritis to that produced by Freund's adjuvant. Pain. 1987;28(3):379–393. doi: 10.1016/0304-3959(87)90072-8. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 7.Park JS, Oh Y, Park O, et al. PEGylated TRAIL ameliorates experimental inflammatory arthritis by regulation of Th17 cells and regulatory T cells. J Control Release. 2017;267:163–171. doi: 10.1016/j.jconrel.2017.10.004. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 8.Hartmann P, Szabó A, Eros G, et al. Anti-inflammatory effects of phosphatidylcholine in neutrophil leukocyte-dependent acute arthritis in rats. Eur J Pharmacol. 2009;622(1/3):58–64. doi: 10.1016/j.ejphar.2009.09.012. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 9.Tramontini N, Huber C, Liu-Bryan R, et al. Central role of complement membrane attack complex in monosodium urate crystal-induced neutrophilic rabbit knee synovitis. Arthritis Rheum. 2004;50(8):2633–2639. doi: 10.1002/art.20386. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 10.Martinon F. Mechanisms of uric acid crystal-mediated autoinflammation. Immunol Rev. 2010;233(1):218–232. doi: 10.1111/j.0105-2896.2009.00860.x. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.Zhang Y, Zheng Y. Effects and mechanisms of potent caspase 1 inhibitor VX765 treatment on collagen-induced arthritis in mice. Clin Exp Rheumatolm. 2016;34(1):111–118. [PubMed] [Google Scholar]
- 12.Jhang JJ, Lu CC, Yen GC. Epigallocatechin gallate inhibits urate crystals-induced peritoneal inflammation in C57BL/6 mice. Mol Nutr Food Res. 2016;60(10):2297–2303. doi: 10.1002/mnfr.201600106. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 13.Zhang S, Qing Q, Bai Y, et al. Rebamipide helps defend against nonsteroidal anti-inflammatory drugs induced gastroenteropathy: A systematic review and meta-analysis. Dig Dis Sci. 2013;58(7):1991–2000. doi: 10.1007/s10620-013-2606-0. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 14.Choe JY, Park KY, Lee SJ, et al. Rebamipide inhibits tumor necrosis factor-α-induced interleukin-8 expression by suppressing the NF-κB signal pathway in human umbilical vein endothelial cells. Inflamm Res. 2010;59(12):1019–1026. doi: 10.1007/s00011-010-0221-5. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 15.Kim H, Seo JY, Kim KH. Inhibition of lipid peroxidation, NFkappaB activation and IL-8 production by rebamipide in Helicobacter pylori-stimulated gastric epithelial cells. Dig Dis Sci. 2000;45(3):621–628. doi: 10.1023/A:1005474013988. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 16.Funahashi Y, Yoshida M, Yamamoto T, et al. Intravesical application of rebamipide suppresses bladder inflammation in a rat cystitis model. J Urol. 2014;191(4):1147–1152. doi: 10.1016/j.juro.2013.11.026. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 17.Suzuki Y, Hasegawa M, Matsui Y, et al. Intra-articular injection of rebamipide prevents articular cartilage degeneration in murine post-traumatic osteoarthritis models. Mod Rheumatol. 2020;30(4):765–772. doi: 10.1080/14397595.2019.1641912. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]