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. 2020 Oct 13;115(4):630–636. [Article in Portuguese] doi: 10.36660/abc.20190231
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Atorvastatina Reduz o Acúmulo de Células Musculares Lisas Vasculares para Inibir a Hiperplasia Intimal pela Inibição de Via p38 MAPK em um Modelo de Enxerto de Veia em Ratos

Tianshu Chu 1, Molin Huang 1, Zhiwei Zhao 1, Fei Ling 1, Jing Cao 1, Jianjun Ge 1,✉
PMCID: PMC8386959  PMID: 33111860

Resumo

Fundamento:

A taxa de falha de enxerto de veia safena um ano após a cirurgia de revascularização do miocárdio varia de 10% a 25%. O objetivo deste estudo foi de investigar se a atorvastatina pode reduzir o acúmulo de células musculares lisas vasculares para inibir a hiperplasia intimal por meio da inibição da via p38 MAPK.

Métodos:

Quarenta e cinco ratos Sprague-Dawley foram randomizados em três grupos. Trinta ratos foram submetidos à cirurgia de enxerto de veia e randomizados para tratamento com veículo ou atorvastatina; quinze ratos foram submetidos à cirurgia sham. Detectamos a hiperplasia intimal por meio de coloração com hematoxilina-eosina e a expressão de proteínas relacionadas por meio de análise imuno-histoquímica e Western blot. Foram realizadas as comparações por análise de variância de fator único e pelo teste da diferença mínima significativa de Fisher, com p < 0,05 considerado significativo.

Resultados:

A íntima analisada pela coloração com hematoxilina-eosina era dramaticamente mais espessa no grupo controle que no grupo atorvastatina e no grupo sham (p < 0,01). Os resultados da coloração imuno-histoquímica de α-SMA demonstraram que a porcentagem de células positivas para α-SMA no grupo controle era mais alta que no grupo atorvastatina (p < 0,01). Nós também avaliamos α-SMA, PCNA, p38 MAPK e fosforilação de p38 MAPK após o tratamento com estatina por meio de análise de Western blot e os resultados indicaram que a atorvastatina não levou à redução de p38 MAPK (p < 0,05); no entanto, resultou na inibição da fosforilação de p38 MAPK (p < 0,01) e reduziu significativamente os níveis de α-SMA e PCNA, em comparação com o grupo controle (p < 0,01).

Conclusão:

Nós demonstramos que a atorvastatina pode inibir o acúmulo de células musculares lisas vasculares por meio da inibição da via p38 MAPK e é capaz de inibir a hiperplasia intimal em modelos de enxerto de veia em ratos.

Palavras-chave: Atorvastatina, Miócitos de Músculo Liso, Hiperplasia, Modelos Animais, Quinases de Proteína Quinase Ativadas por Mitógenos, Revascularização do Miocárdio, Ratos

Introdução

A doença arterial coronariana e as complicações relacionadas ainda são as principais causas de mortalidade em todo o mundo, embora tenha havido muitos avanços na terapia médica. Diversos estudos e diretrizes clínicas mostram que a cirurgia de revascularização do miocárdio (CRM) reduz a morbimortalidade de pacientes com doença triarterial ou doença principal esquerda, com fração de ejeção reduzida em comparação com a intervenção coronária percutânea.1 Notavelmente, um ano após a CRM, a taxa de falha do enxerto de veia safena (EVS) pode ser de 10% a 25%; no período de 1 a 5 anos, a taxa aumentará de 1% a 2% por ano.2,3 Além disso, em 6 a 10 anos, a taxa de bloqueio aumenta de 4% a 5% por ano, devido à aterosclerose.4 O mecanismo da reestenose de EVS inclui trombose, hiperplasia intimal (HI) e aterosclerose. A proliferação e a migração das células endoteliais e das células musculares lisas vasculares (CMLVs) são fundamentais à HI e a HI é a causa principal da reestenose de EVS.5 Porém, o mecanismo da HI não é claro e ainda não se sabe qual método de prevenção e terapia seria mais eficaz.

Uma quantidade substancial de evidência sugere que o tratamento com estatina reduza o risco cardiovascular; portanto, quando os níveis de colesterol de lipoproteína de baixa densidade são superiores a 100 mg/dL, a terapia com estatinas é recomendada para os pacientes com doença arterial coronariana.6 Muitas observações indicam que o tratamento pré-operatório com estatina pode reduzir a morbidade, a mortalidade pós-operatória e as complicações. Evidências recentes indicam que o tratamento com estatina após CRM pode reduzir a taxa de doença de EVS por meio da inibição de HI, indicando que o tratamento otimizado com estatina é crucial para a avaliação do benefício de longo prazo da CRM.7–9 É amplamente aceita a hipótese de “resposta à injúria” proposta por Russell Ross; esta hipótese afirma que, após a arterialização, o EVS instantaneamente sofre lesões (por exemplo, isquemia, hipóxia, estresse de cisalhamento ou trauma cirúrgico), provocando um evento que inicia a resposta inflamatória, seguida por alterações morfológicas e funcionais levando a HI, como resultado do acúmulo de CMLVs e da disfunção das células endoteliais.10 A disfunção, proliferação e migração destas células são estimuladas pela fosforilação de p38 proteínas quinases ativadas por mitógeno (p38 MAPKs), quinases reguladas por sinal extracelular (ERK), c-Jun e quinases N-terminais.11 Estudos têm demonstrado que a inibição de p38 MAPK pode reduzir a resposta imune inata e, consequentemente, inibir a HI após a arterialização do EVS.12,13

Com base nesses estudos em HI, formulamos a hipótese de que a atorvastatina poderia reduzir o acúmulo de CMLVs para inibir HI por meio da supressão da via p38 MAPK. Nós testamos a nossa hipótese utilizando um modelo de enxerto de veia com tratamento com estatina em ratos para detectar HI por meio de coloração com hematoxilina-eosina e expressão de proteína correlacionada por meio de análise imuno-histoquímica e de Western blot. Verificamos que a atorvastatina era capaz de inibir a fosforilação de p38 MAPK para reduzir o acúmulo de CMLVs e, adicionalmente, inibir a HI.

Materiais e Métodos

Animais Experimentais e Procedimento Cirúrgico

Todos os experimentos com os animais neste estudo foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional para Uso e Cuidado de Animais de Laboratório. Quarenta e cinco ratos machos Sprague-Dawley, de 8 a 10 semanas de idade, livres de patógenos, pesando de 200 a 220 g, foram fornecidos pelo Centro de Pesquisa do Laboratório de Animais de Anhui e identificados pelo Comitê de Ética Médica da Universidade Médica de Anhui. Foram randomizados (desenho completamente randomizado) em 3 grupos, contendo 15 ratos cada, e alimentados durante 4 semanas após a operação. Trinta ratos receberam o enxerto de veia, conforme previamente descrito;14 o método foi utilizado para construir modelos de enxerto de veia jugular direita na artéria carótida comum, e os ratos foram randomizados para serem tratados com veículo (grupo controle, administrado com água destilada continuamente por gavagem durante 4 semanas) ou atorvastatina (grupo atorvastatina, 15 mg/kg, dissolvido em água destilada). Quinze ratos receberam uma cirurgia sham (grupo sham), definida como simulação do processo operatório, sem arterialização venosa e intervenção médica.

Coleção de Amostras

Coletamos o enxerto de veia de cada rato na quarta semana após a operação. Os ratos foram totalmente anestesiados, fixados na mesa de operação, heparinizados como antes e operados da mesma forma, pela mesma abordagem. Para análise histológica, os enxertos venosos foram colocados em microtubos com paraformaldeído e fixados a 4 °C durante 24 horas. Os enxertos venosos com Western Blot foram colocados em microtubos sem solvente e, subsequentemente, armazenados a −80 °C. Os ratos foram sacrificados por deslocamento cervical e devidamente manuseados.

Análise Histológica e Imuno-histoquímica

Foi realizada a análise morfométrica da íntima por coloração com hematoxilina-eosina, utilizando um kit de coloração de hematoxilina e eosina (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). Foi utilizado um sistema de aquisição de imagem microscópica Olympus para coletar imagens das seções (lentes objetivas ×40, ×100 e ×200) e medir a espessura da íntima. Dois pesquisadores independentes realizaram as medidas e a análise dos dados. Nós selecionamos seções das veias enxertadas; subsequentemente, medimos 16 pontos de espessura intimal e calculamos a média. As seções de tecido foram testados para proliferação celular utilizando um kit para análise imuno-histoquímica para α-actina de músculo liso (α-SMA) (R&D Systems, Bio-Techne, Minnesota, EUA), a proteína específica das CMLVs. Todas as imagens (lentes objetivas ×100 e ×200) foram obtidas utilizado um sistema de aquisição de imagem microscópica Olympus (Olympus, Japan) e processadas com o software Image-J 1.48u (National Institutes of Health, Bethesda, EUA). Um total de 10 observações foram aplicadas para calcular a porcentagem média de células positivas para α-SMA de cada rato.

Análise de Western Blot

Quatro semanas após a operação, quantidades equivalentes de proteínas dos enxertos venosos dos três grupos foram submetidas à eletroforese em dodecil sulfato de sódio/gel de 10% e transferidas para membranas de PVDF (Sigma-Aldrich, EUA). As membranas foram, subsequentemente, incubadas com anticorpos anti-fosfo-específicos de p38 MAPK, anticorpos anti-não-fosforilados de p38 MAPK, anticorpos anti-não-fosforilados de α-SMA e anticorpos anti-não-fosforilados de antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), seguido por incubação com IgG-peroxidase anti-rato. Foi realizado o Western blotting conforme previamente descrito.15 Os anticorpos (p38, p-p38, α-SMA, PCNA e β-actin) foram adquiridos da R&D Systems (Bio-Techne, Minnesota, EUA).

Análise Estatística

Foram realizadas as análises estatísticas utilizando SPSS 17.0. Os dados são expressos como média ± desvio padrão. Considerando que os dados apresentavam distribuição normal, foram realizadas as comparações entre múltiplos grupos por análise de variância de fator único e as comparações entre dois pelo teste da diferença mínima significativa de Fisher. Foram considerados estatisticamente significativos os valores de p < 0,05.

Resultados

Os ratos sobreviveram bem 4 semanas após a operação

Para simular as alterações fisiopatológicas da CRM, nós utilizamos o método de cuff aperfeiçoado para construir modelos de enxerto de veia jugular na artéria carótida em um lado; após o enxerto, as veias transplantadas estavam bem preenchidas e os vasos sanguíneos tinham bom pulso (Figura 1). Foram diariamente verificados o estado vital dos ratos e a incisão. Todos os ratos sobreviveram e se recuperaram bem, com pulso bom nas veias enxertadas. Todos os ratos foram sacrificados 4 semanas após a operação. Notavelmente, apenas um rato apresentou oclusão venosa no grupo controle e o fluxo sanguíneo nas veias enxertadas estava sem obstrução. Novo tecido de granulação estava presente nas veias do grupo controle, mostrando tubos mais espessos, edema e rigidez leve. Porém, as veias no grupo atorvastatina apresentavam poucos tecidos novos, sem expansão óbvia e eram facilmente separados.

Figura 1. Processo de construção do modelo. Procedimento operacional: Foi utilizado hidrato de cloral 10% para anestesiar os ratos via injeção intraperitoneal. Foi injetada heparina (700 UI/kg) na veia caudal para induzir a heparinização. Foi feita uma incisão vertical de aproximadamente 1 cm no meio do pescoço (desviada para o lado da operação) e as veias foram dissociadas de um lado (A e B). Epitheca de 1 a 2 mm foram obtidas com uma agulha de punção arterial 20G vermelha (BD Company), usada como cânula. A artéria carótida foi isolada até os ramos. Em seguida, duas linhas de sutura e hemoclips foram colocados em ambas extremidades da artéria para bloquear o fluxo sanguíneo (C). O meio da artéria foi isolado e cuidadosamente virado para 1 a 1,2 mm acima da cânula para trazer a íntima para fora (D). Foi usada uma sutura de seda 6/0 para nó e fixação; a veia estava subsequentemente entre artérias isoladas e foi possível abrir os grampos vasculares (E e F). A incisão foi suturada depois que verificamos que o pulso no enxerto de veia estava normal e que não houve sangramento.

Figura 1

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A Atorvastatina Reduziu o Espessamento Intimal do Enxerto de Veia

Para avaliar o efeito da atorvastatina na HI, realizamos coloração com hematoxilina-eosina 4 semanas após a cirurgia. Subsequentemente, foi utilizado um sistema computadorizado de análise de imagens para analisar a HI. Os resultados mostraram que a íntima do grupo controle foi significativamente mais espessa do que aquela do grupo atorvastatina e do grupo sham (249,3 ± 14,5 versus 95,1 ± 3,6, 32,3 ± 1,7, p < 0,01; Figura 2A e B). O resultado indicou que a atorvastatina pode inibir a HI no enxerto de veia.

Figura 2. A atorvastatina reduziu o espessamento intimal do enxerto de veia. O tecido dos vasos foi coletado 4 semanas após a operação, fixado com formalina, cortado em seções de tecido de 4 μm e colorido com H&E. As imagens (lente objetivo ×40, ×100 e ×200) foram coletadas e analisadas usando um sistema de aquisição de imagem microscópica Olympus. A íntima do grupo controle foi significativamente mais espessa do que aquela do grupo atorvastatina e do grupo sham (249,3 ± 14,5 versus 95,1 ± 3,6, 32,3 ± 1,7, p < 0,01). *O grupo controle apresentou uma diferença óbvia em relação aos outros dois grupos.

Figura 2

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A Atorvastatina Reduziu a Proliferação Celular na Íntima do Enxerto de Veia

Realizamos análise imuno-histoquímica de α-SMA e Western blot de α-SMA e PCNA, um indicador do estado de proliferação celular, com a finalidade de investigar os componentes celulares e a proliferação de HI. Além disso, conforme demonstrado na Figura 3, os resultados da coloração imuno-histoquímica de α-SMA mostraram que a porcentagem de células positivas para α-SMA foi significativamente mais alta no grupo controle do que no grupo atorvastatina e no grupo sham (40,5% ± 3,1% versus 19,6% ± 1,4%, 4,7% ± 0,9%, p < 0,01; Figura 3A e B). A atorvastatina significativamente diminuiu os níveis de α-SMA e PCNA, em comparação com o grupo controle (p < 0,01; Figura 4C e D). Estes resultados indicam que as CMLVs são o componente celular principal da HI e que a atorvastatina pode inibir a proliferação das CMLVs e reduzir a HI.

Figura 3. A atorvastatina reduziu a proliferação celular na íntima do enxerto de veia. O tecido dos vasos foi coletado 4 semanas após a operação, fixado com formalina, cortado em seções de tecido de 4 μm e colorido o anticorpo primário anti-α-SMA. As imagens (lente objetivo ×100 e ×200) foram coletadas e analisadas usando um sistema de aquisição de imagem microscópica Olympus. O grupo controle apresentava uma porcentagem de células positivas para α-SMA foi significativamente mais alta do que o grupo atorvastatina e o grupo sham (40,5% ± 3,1% versus 19,6% ± 1,4%, 4,7% ± 0,9%, p < 0,01). *O grupo controle apresentou uma diferença óbvia em relação aos outros dois grupos.

Figura 3

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Figura 4. A atorvastatina reduziu a expressão de α-SMA, PCNA e fosforilação de p38 MAPK. O tecido dos vasos coletado 4 semanas após a operação foi colocado em microtubos sem solvente, armazenados a −80 °C e utilizado para detecção de Western blot. A atorvastatina não reduziu o nível de p38 MAPK significativamente (p > 0,05, A). No entanto, inibiu a fosforilação de p38 MAPK (p < 0,01, B) e significativamente reduziu os níveis de α-SMA e PCNA, em comparação com o grupo controle (p < 0,01; C e D). *O grupo controle apresentou uma diferença óbvia em relação aos outros dois grupos.

Figura 4

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A Atorvastatina Reduziu a Fosforilação de p38 MAPK

Realizamos Western blot de p38 MAPK e fosforilação de p38 MAPK com a finalidade de investigar a relação entre a atorvastatina e a via p38 MAPK. Os efeitos da atorvastatina em p38 MAPK e na fosforilação de p38 MAPK são apresentados na Figura 4A e B. A atorvastatina inibiu a fosforilação de p38 MAPK (p < 0,01, Figura 4B) mas sem redução significativa de p38 MAPK (p > 0,05, Figura 4A). Estes resultados indicam que a atorvastatina foi capaz de reduzir a HI por meio da inibição da fosforilação de p38 MAPK.

Discussão

Os resultados deste estudo indicam que a atorvastatina foi capaz de reduzir o acúmulo de CMLVs e inibir a HI suprimindo a via de p38 MAPK. Outros estudos mostraram que, com auxílio da angiotensina II, o tratamento com estatina induziu a fosforilação de p38 MAPK e ERK 1/2 em CMLVs em cultura;16 porém, o mecanismo de ação da HI após a CRM ainda não foi esclarecido e não tem sido verificado experimentos em animais. Nos nossos experimentos de reestenose de ponte de veia em ratos, demonstramos que, após o tratamento com atorvastatina, a expressão da proteína de fosforilação de p38 MAPK, α-SMA e PCNA foi reduzida, e houve uma redução significativa na espessura média da HI, bem como uma diminuição significativa na proliferação de α-SMA.

As estatinas têm sido capazes de melhorar os desfechos clínicos dos pacientes com doença cardíaca coronariana, especialmente após intervenção coronariana transluminal percutânea e CRM, devido aos efeitos pleiotrópicos, anti-ateroscleróticos, de inflamação crônica e à inibição da disfunção endotelial.17 No entanto, estudos sobre o efeito das estatinas na reestenose do enxerto vascular após CRM são raros. No presente estudo, utilizando coloração com hematoxilina-eosina, verificamos que a atorvastatina foi capaz de inibir a HI de enxertos de veias. Os nossos achados estão de acordo com nosso trabalho anterior, que sugeriu que ratos tratados com sinvastatina apresentavam aumento significativo da área média dos vasos do lúmen em um modelo de acesso vascular em ratos.18 Além disso, detectamos a densidade de α-SMA por análise imuno-histoquímica e a expressão de α-SMA e PCNA por Western blot. Estes resultados indicam que a atorvastatina foi capaz de reduzir o acúmulo de CMLVs para inibir HI. Yiguan Xu et al. relataram que a atorvastatina pode inibir neo-HI e promover apoptose de CMLV nas camadas neointimais após injúria da artéria carótida em ratos.19 É a primeira vez que observamos o mesmo fenômeno em um modelo de enxerto de veia em rato. Por meio de um mecanismo de ação específico, a atorvastatina levou ao alívio dos danos causados pela injúria do endotélio vascular.

O mecanismo da reestenose inclui trombose, HI e aterosclerose tardia. A proliferação, migração e secreção de células endoteliais e de CMLVs são cruciais à HI, causa principal da reestenose.20 Em um estudo prévio, demonstramos que a p38 MAPK é fosforilada em um modelo de enxerto venoso arterializado em ratos, seguido pela ativação da resposta imune inata (inflamação), e um inibidor de p38 MAPK seria capaz de reduzir a proliferação celular induzida por arterialização e diminuir a resposta inflamatória precoce que segue a injúria vascular.19 Portanto, testamos a expressão de α-SMA, PCNA, p38 MAPK e fosforilação de p38 MAPK após o tratamento com estatina e os resultados mostraram que a atorvastatina não reduziu o nível de p38 MAPK significativamente (p > 0,05). No entanto, inibiu a fosforilação de p38 MAPK (p < 0,01), e os níveis de α-SMA e PCNA mostraram uma redução significativa, em comparação com o grupo controle (p < 0,01). Conforme relatado por Antonio G. et al. o tratamento com estatina foi capaz de inibir a proliferação das CMLVs em cultura pela via MAPK. No entanto, os experimentos em células que eles realizaram foram apenas in vivo, sem a validação de experimentos in vitro em animais, e não associaram este mecanismo à HI de reestenose vascular.16 O ponto forte principal do nosso estudo foi que realizamos experimentos em ratos, com a construção de um modelo altamente complexo, a fim de verificar se as estatinas foram capazes de reduzir o acúmulo de CMLVs e, ainda, de inibir HI por meio da supressão da via p38 MAPK.

Dessa maneira, os achados de nosso estudo contribuirão para trabalhos clínicos futuros, e deveremos nos concentrar mais na aplicação das estatinas em pacientes submetidos à CRM. Neste estudo, conduzimos apenas experimentos em animais in vivo, sem experimentos com células in vitro; estudos futuros com investigação mais direta em relação ao mecanismo de ação serão necessários para elucidar o mecanismo de ação no nível molecular. Considerando que a atorvastatina pode reduzir o acúmulo de CMLVs para inibir HI por meio da supressão da via p38 MAPK em modelos de ratos, especulamos que as estatinas também podem ter um efeito preventivo em pacientes após CRM, mas isso ainda precisa ser investigado em estudos futuros. Nossa equipe está atualmente realizando ensaios clínicos controlados sobre os efeitos da aplicação de estatinas na taxa de patência vascular após CRM.

Em conclusão, temos demonstrado que a atorvastatina pode inibir o acúmulo das CMLVs por meio da inibição de via p38 MAPK, levando à inibição da HI. Verificamos este mecanismo pela primeira vez em um modelo de enxerto de veia em ratos. Os resultados desta pesquisa estabelecerão uma base para pesquisa clínica sobre o uso de estatinas na prevenção de reestenose venosa.

Funding Statement

O presente estudo foi financiado pelo National Nature Science Foundation of China (No. 81470530).

Footnotes

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi financiado pelo National Nature Science Foundation of China (No. 81470530).

Vinculação Acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Referências

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Arq Bras Cardiol. 2020 Oct 13;115(4):630–636. [Article in English]

Atorvastatin Reduces Accumulation of Vascular Smooth Muscle Cells to Inhibit Intimal Hyperplasia via p38 MAPK Pathway Inhibition in a Rat Model of Vein Graft

Tianshu Chu 1, Molin Huang 1, Zhiwei Zhao 1, Fei Ling 1, Jing Cao 1, Jianjun Ge 1,✉

Abstract

Background:

The rate of saphenous vein graft failure one year after coronary artery bypass grafting ranges from 10% to 25%. The aim of this study was to explore whether atorvastatin can reduce accumulation of vascular smooth muscle cells to inhibit intimal hyperplasia via p38 MAPK pathway inhibition.

Methods:

Forty-five Sprague-Dawley rats were randomized to three groups. Thirty rats received a vein graft operation, and they were randomized to be treated with vehicle or atorvastatin; fifteen rats received a sham operation. We detected intimal hyperplasia by hematoxylin-eosin staining and related protein expression by immunohistochemical and Western blot analysis. Comparisons were analyzed by single-factor analysis of variance and Fisher's least significant difference test, with p < 0.05 considered significant.

Results:

The intima analyzed by hematoxylin-eosin staining was dramatically thicker in the control group than in the atorvastatin group and sham group (p < 0.01). The outcomes of immunohistochemical staining of α-SMA demonstrated that the percentage of α-SMA-positive cells in the control group was higher than in the atorvastatin group (p < 0.01). We also evaluated α-SMA, PCNA, p38 MAPK, and phosphorylation of p38 MAPK after statin treatment by Western blot analysis, and the results indicated that atorvastatin did not lead to p38 MAPK reduction (p < 0.05); it did, however, result in inhibition of p38 MAPK phosphorylation (p < 0.01), and it significantly reduced α-SMA and PCNA levels, in comparison with the control group (p < 0.01).

Conclusion:

We have demonstrated that atorvastatin can inhibit accumulation of vascular smooth muscle cells by inhibiting the p38 MAPK pathway, and it is capable of inhibiting intimal hyperplasia in a rat vein graft model.

Keywords: Atorvastatin; Myocytes Smooth Muscle; Hyperplasia; Models, Animal; Mitogen Activated Protein Kinases; Myocardial Revascularization, Rats

Introduction

Coronary artery disease and related complications are still the main causes of mortality around the world, although there have been many advances in medical therapy. Many studies and clinical guidelines have shown that coronary artery bypass grafting (CABG) surgery reduces morbidity and mortality of patients with three-vessel disease or left main disease, with reduced ejection fraction compared to percutaneous coronary intervention.1 Notably, one year after CABG, the rate of saphenous vein graft (SVG) failure can be 10% to 25%, and in 1 to 5 years, the rate will be increased by 1 % to 2% per year.2,3 Moreover, in 6 to 10 years, the failure rate will increase at a rate of 4% to 5% every year, due to atherosclerosis.4 The mechanism of SVG restenosis includes thrombosis, intimal hyperplasia (IH) and atherosclerosis. The proliferation and migration of endothelial cells and vascular smooth muscle cells (VSMCs) are crucial to IH, and IH is the main cause of SVG restenosis.5 However, the mechanism of IH is not clear, and it is still not known which prevention method and therapy would be most effective.

A substantial amount of evidence suggests that statin treatment reduces cardiovascular risk; therefore, when low-density lipoprotein cholesterol levels are higher than 100 mg/dL, statin therapy is recommended for patients with coronary artery disease.6 Many observations have indicated that preoperative statin treatment could reduce morbidity, postoperative mortality, and complications, and recent evidence has indicated that statin treatment after CABG can reduce the rate of SVG disease by inhibiting IH, indicating that optimal statin treatment is crucial to the assessment of the long-term benefit of CABG.7–9 The “response-to-injury” hypothesis proposed by Russell Ross is widely accepted; this hypothesis states that, following arterialization, SVGs instantly undergo injury (e.g. ischemia, hypoxia, shear stress, or surgical trauma), leading to an initiating event in the inflammatory response, followed by morphological and functional changes leading to IH, as the result of accumulation of VSMCs and endothelial cell dysfunction.10 The dysfunction, proliferation and migration of these cells are stimulated by phosphorylation of p38 mitogen activated protein kinases (p38 MAPKs), extracellular signal-regulated kinases (ERK), c-Jun and N-terminal kinases.11 Studies have demonstrated that inhibition of p38 MAPK could reduce the innate immune response and consequently inhibit IH following SVG arterialization.12,13

Based on these studies on IH, we hypothesized that atorvastatin could reduce the accumulation of VSMCs to inhibit IH by suppressing the p38 MAPK pathway. We verified our hypothesis by using a rat vein graft model with statin treatment to detect IH by hematoxylin-eosin staining and correlated protein expression by immunohistochemical and Western blot analysis. We found that atorvastatin was able to inhibit phosphorylation of p38 MAPK to reduce accumulation of VSMCs and, furthermore, inhibit IH.

Materials and Methods

Experimental Animals and Surgical Procedure

All animal experiments in this study were performed according to protocols approved by the Institutional Committee for Use and Care of Laboratory Animals. Forty-five male, pathogen-free, 8- to 10-week-old Sprague-Dawley rats, weighing 200 to 220 g were provided by the Anhui Lab Animal Research Center and identified by the Medical Ethics Committee of Anhui Medical University. They were randomized (completely randomized design) to 3 groups, containing 15 rats each, and fed for 4 weeks after operation. Thirty rats received a vein graft as described previously;14 the method was used to construct rat models of right jugular vein grafts on common carotid artery, and the rats were randomized to be treated with vehicle (control group, administered with distilled water continuously by gavage for 4 weeks) or atorvastatin (atorvastatin group, 15 mg/kg, dissolved in distilled water). Fifteen rats received a sham operation (sham group), defined as simulation of the operation process, without venous arterialization and medical intervention.

Sample Collection

We collected each rat's vein graft at the fourth week after operation. Fully anaesthetized rats were fixed on the operating table, heparinized as before and operated in the same way, through the same approach. For histological analysis, vein grafts were placed in microtubes with paraformaldehyde, and fixed at 4 °C for 24 hours. Vein grafts with Western-Blot were placed in solvent-free microtubes and then stored at −80 °C. Rats were euthanized by cervical dislocation and handled properly.

Histologic and Immunohistochemical Analysis

Morphometric analysis of intima was performed by hematoxylin-eosin staining, using a hematoxylin and eosin staining kit (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). An Olympus microscope image acquisition system was used to collect images of sections (×40, ×100, and ×200 objective lens) and measure intimal thickness. Two independent researchers performed the measurements and data analysis. We selected sections of grafted veins; subsequently, we measured 16 points of intimal thickness and calculated the mean. Tissue sections were tested for cell proliferation using an immunohistochemistry analysis kit for α-smooth muscle actin (α-SMA) (R&D Systems, Bio-Techne, Minnesota, USA), the specific protein of VSMCs. All images (×100 and ×200 objective lens) were captured using an Olympus microscope image acquisition system (Olympus, Japan) and processed with Image-J 1.48u software (National Institutes of Health, Bethesda, USA). A total of 10 observation views were applied to calculate the average percentage of α-SMA-positive cells for each rat.

Western Blot Analysis

Four weeks after the operation, equivalent amounts of vein graft proteins from the three groups were electrophoresed in sodium dodecyl sulfate/10% polyacrylamide gel and blotted onto PVDF membranes (Sigma-Aldrich, USA). The membranes were subsequently incubated with anti-phospho-specific p38 MAPK antibodies, anti-non-phosphorylated p38 MAPK antibodies, anti-non-phosphorylated α-SMA antibodies, and anti-non-phosphorylated proliferating cell nuclear antigen (PCNA) antibodies, followed by incubation with an anti-mouse IgG-peroxidase. Western blotting was performed as previously described.15 The antibodies (p38, p-p38, α-SMA, PCNA and β-actin) were acquired from R&D Systems (Bio-Techne, Minnesota, USA).

Statistical Analysis

Statistical analyses were performed using SPSS 17.0. Data are shown as mean ± standard deviation. As the data showed normal distribution, comparisons between multiple groups were analyzed by single-factor analysis of variance (ANOVA), and comparisons between two groups were made by Fisher's least significant difference test. P values < 0.05 were considered statistically significant.

Results

Rats Survived Well 4 Weeks After Operation

To simulate the pathophysiological changes of CABG, we used the improved cuff method to construct rat models of jugular vein graft on carotid artery in one side; after grafting, the transplanted veins were well filled, and the blood vessels had good pulse (Figure 1). Rats’ vital status and incision were checked every day, and all rats survived and recovered well with good pulse in the grafted veins. All rats were euthanized 4 weeks after operation. Notably, only one rat had venous occlusion in the control group, and blood flow in other grafted veins was unobstructed. New granulation tissue was present in the veins of the control group, showing thickened tubes, edema, and mild stiffness. However, veins in the atorvastatin group had few fresh tissues with no obvious expansion, and they were easily separated.

Figure 1. Model construction process. Operating procedure: 10% chloral hydrate was used to anaesthetize rats via intraperitoneal injection. Heparin (700 IU/kg) was injected through the caudal vein to induce heparinization. A vertical incision of approximately 1 cm was made in the middle of the neck (deflected to the operation side) and the veins were dissociated on one side (A and B). Epitheca of 1 to 2 mm were taken using 20G red arterial puncture needle (BD Company), used as cannula. The carotid artery was isolated until the branches. Then, two suture traction lines and hemoclips were placed at both ends of the artery to block blood flow (C). The middle of the artery was isolated and turned carefully to 1 to 1.2mm above the cannula to bring intima outside (D). 6/0 silk suture was used for knot and fixation; the vein was subsequently between isolated arteries, and we were able to open vascular clamps (E and F). The incision was sutured after we had verified that pulse in the vein graft was normal and that there was no bleeding.

Figure 1

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Atorvastatin Reduced Intimal Thickening of the Vein Graft

To evaluate the effect of atorvastatin on IH, we performed hematoxylin-eosin staining 4 weeks after surgery. Subsequently, a computer image analysis system was used to analyze IH. The results showed that the intima of the control group was significantly thicker than that of the atorvastatin group and the sham group (249.3 ± 14.5 versus 95.1 ± 3.6, 32.3 ± 1.7, p < 0.01; Figure 2A and 2B). The result indicated that atorvastatin is able to inhibit IH in the vein graft.

Figure 2. Atorvastatin reduced intimal thickening of the vein graft. The vessel tissue was collected 4 weeks after operation, fixed with formalin, sliced to 4 μm tissue sections, and stained with H&E. Images (×40, ×100, and ×200 objective lens) were collected and analyzed on an Olympus microscope imaging system. The intima of the control group was significantly thicker than that of atorvastatin group and the sham group (249.3 ± 14.5 versus 95.1 ± 3.6, 32.3 ± 1.7, p < 0.01). *The control group had an obvious difference with the other two groups.

Figure 2

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Atorvastatin Reduced Cell Proliferation in Intimal of The Vein Graft

We performed immunohistochemistry analysis of α-SMA and Western blot of α-SMA and PCNA, an indicator of cell proliferation status, in order to explore the cellular components and proliferation of IH. Furthermore, as shown in Figure 3, the results of immunohistochemical staining of α-SMA showed that the percentage of α-SMA-positive cells was significantly higher in the control group than in the atorvastatin group and the sham group (40.5% ± 3.1% versus 19.6% ± 1.4%, 4.7% ± 0.9%, p < 0.01; Figure 3A and B). Atorvastatin significantly decreased α-SMA and PCNA levels, in comparison with control group (p < 0.01; Figure 4C and D). These results indicate that VSMCs are the main cellular component of IH and that atorvastatin can inhibit the proliferation of VSMCs and reduce IH.

Figure 3. Atorvastatin decreased cell proliferating of the vein graft. The vessel tissue was collected 4 weeks after operation, fixed with formalin, sliced to 4 μm tissue sections, and stained with the primary antibody anti-α-SMA. Images (×100 and ×200 objective lens) were collected and analyzed on an Olympus microscope imaging system. The control group had a significantly higher percentage of α-SMA-positive cells than the atorvastatin group and the sham group (40.5% ± 3.1% versus 19.6% ± 1.4%, 4.7% ± 0.9%, p < 0.01). *The control group had an obvious difference the other two groups.

Figure 3

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Figure 4. Atorvastatin reduced the expression of α-SMA, PCNA and phosphorylation of p38 MAPK. The vessel tissue collected 4 weeks after operation was placed in solvent-free microtubes, stored at −80 °C, and used for Western blot detection. Atorvastatin did not significantly reduce the level of p38 MAPK (p > 0.05, A). However, it inhibited phosphorylation of p38 MAPK (p < 0.01, B) and significantly reduced α-SMA and PCNA levels, in comparison with the control group (p < 0.01; C and D). *The control group had an obvious difference the other two groups.

Figure 4

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Atorvastatin Reduced Phosphorylation of p38 MAPK

We performed Western blot of p38 MAPK and phosphorylation of p38 MAPK in order to explore the relation between atorvastatin and the p38 MAPK pathway. The effects of atorvastatin on p38 MAPK and phosphorylation of p38 MAPK are shown in Figure 4A and B. Atorvastatin inhibited phosphorylation of p38 MAPK (p < 0.01, Figure 4B) but without significantly reducing p38 MAPK (p > 0.05, Figure 4A). These results indicate that atorvastatin was able to reduce IH by inhibiting phosphorylation of p38 MAPK.

Discussion

The results of this study indicate that atorvastatin was able to reduce the accumulation of VSMCs and inhibit IH by suppressing the p38 MAPK pathway. Other studies have shown that, with the help of angiotensin II, statin treatment induced phosphorylation of p38 MAPK and ERK 1/2 in cultured VSMCs;16 however, the action mechanism of IH after coronary artery bypass has not been made clear, and it has not been verified in animal experiments. In our experiments of vein bridge restenosis in rats, we demonstrated that, after atorvastatin treatment, the protein expression of phosphorylation of p38 MAPK, α-SMA, and PCNA was reduced, and there was a significant reduction in the average thickness of IH, as well as a significant decrease in proliferation of α-SMA.

Statins have been able to improve clinical outcomes of patients with coronary heart disease, especially after percutaneous transluminal coronary intervention and CABG, due to pleiotropic, anti-atherosclerotic, and chronic inflammation effects, as well as inhibition of endothelial dysfunction.17 However, studies about the effect of statins on vascular graft restenosis after CABG are rare. In the current study, using hematoxylin-eosin staining, we found that atorvastatin was able to inhibit IH of vein grafts. Our findings are in agreement with our previous work, which has suggested that rats treated with simvastatin showed significant growth in the mean lumen vessel area in a rat model of vascular access.18 Furthermore, we detected α-SMA density by immunohistochemistry and the expression of α-SMA and PCNA by Western blot. These results indicated that atorvastatin was able to reduce accumulation of VSMCs to inhibit IH. Yiguan Xu et al. reported that atorvastatin can inhibit neo-IH and promote VSMC apoptosis in neointimal layers after carotid artery injury in rats.19 This is the first time that we have observed the same phenomenon in a rat model of vein graft; namely, through a specific action mechanism, atorvastatin led to alleviation of the damage caused by vascular endothelial injury.

The mechanism of restenosis includes thrombosis, IH, and late atherosclerosis. Proliferation, migration, and secretion of endothelial cells and VSMCs are crucial to IH, the leading cause of restenosis.20 In a previous study, we showed that p38 MAPK is phosphorylated in a model of arterialized vein grafts followed by activation of the innate immune response (inflammation), and a p38 MAPK inhibitor could reduce arterialization-induced cell proliferation and downregulate the early inflammatory response that follows vascular injury.19 Hence, we tested the expression of α-SMA, PCNA, p38 MAPK, and phosphorylation of p38 MAPK after statin treatment, and the results showed that atorvastatin did not significantly reduce the level of p38 MAPK (p > 0.05). However, it inhibited phosphorylation of p38 MAPK (p < 0.01), and the α-SMA and PCNA levels showed a significant decrease, in comparison with the control group (p < 0.01). As reported by Antonio G. et al, statin treatment was able to inhibit proliferation of VSMCs in culture via the MAPK pathway. However, the cell experiments they completed were only in vivo, without validation of in vitro animal experiments, and they did not link this mechanism to IH of vascular restenosis.16 The main strength of our study is that we performed our experiments in rats, with the construction of a highly complex model, in order to verify that statins were able to reduce accumulation of VSMCs and, furthermore, inhibit IH by suppressing p38 MAPK pathway.

Therefore, the findings from our study will contribute to future clinical work, and we should focus more on the application of statins in patients with CABG. In this study, we conducted only animal experiments in vivo, without in vitro cell experiments; future studies with more direct action mechanism research are needed to elucidate the action mechanism at the molecular level. As atorvastatin could reduce the accumulation of VSMCs to inhibit IH by suppressing the p38 MAPK pathway in rat models, we speculate that statins may also have a preventive effect in patients after CABG, but this still needs to be investigated in future studies. Our team is currently carrying out controlled clinical trials on the effects of statin application on the vascular patency rate after CABG.

In conclusion, we have demonstrated that atorvastatin can inhibit the accumulation of VSMCs by inhibiting the p38 MAPK pathway, leading to IH inhibition. We have verified this mechanism for the first time in a rat model of vein graft. These research results will lay a foundation for basic and clinical research on statin use for prevention of venous restenosis.

Funding Statement

This study was funded by National Nature Science Foundation of China (No. 81470530).

Footnotes

Sources of Funding

This study was funded by National Nature Science Foundation of China (No. 81470530).

Study Association

This study is not associated with any thesis or dissertation work.

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