Efeito do Diterpeno Manool sobre a Pressão Arterial e Reatividade Vascular em Ratos Normotensos e Hipertensos

Ariadne Santana e Neves Monteiro; Debora Ribeiro Campos; Agnes Afrodite Sumarelli Albuquerque; Paulo Roberto Barbosa Evora; Luciana Garros Ferreira; Andrea Carla Celotto

doi:10.36660/abc.20190198

. 2020 Oct 13;115(4):669–677. [Article in Portuguese] doi: 10.36660/abc.20190198

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Efeito do Diterpeno Manool sobre a Pressão Arterial e Reatividade Vascular em Ratos Normotensos e Hipertensos

Ariadne Santana e Neves Monteiro ¹, Debora Ribeiro Campos ¹, Agnes Afrodite Sumarelli Albuquerque ¹, Paulo Roberto Barbosa Evora ^1,^✉, Luciana Garros Ferreira ¹, Andrea Carla Celotto ¹

PMCID: PMC8386962 PMID: 33111868

Resumo

Fundamento:

Diversos estudos têm mostrado que as classes de diterpenos exercem efeito significativo no sistema cardiovascular. Os diterpenos, em particular, estão entre os principais compostos associados às propriedades cardiovasculares, como a propriedade vasorrelaxante, inotrópica, diurética e a atividade hipotensora. Embora o mecanismo de vasorrelaxamento do manool seja visível, seu efeito sobre a pressão arterial (PA) ainda é desconhecido.

Objetivo:

Avaliar o efeito hipotensor in vivo do manool e verificar o efeito de vasorrelaxamento ex vivo em anéis aórticos de ratos.

Métodos:

Os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos: normotensos e hipertensos. O grupo normotenso foi submetido à cirurgia sham e adotou-se o modelo 2R1C para o grupo hipertenso. Realizou-se monitoramento invasivo da PA para testes com manool em diferentes doses (10, 20 e 40 mg/kg). Foram obtidas curvas de concentração-resposta para o manool nos anéis aórticos, com endotélio pré-contraído com fenilefrina (Phe) após incubação com Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) ou oxadiazolo[4,3-a]quinoxalina-1-ona (ODQ). Os níveis plasmáticos de óxido nítrico (NOx) foram medidos por ensaio de quimioluminescência.

Resultados:

Após a administração de manool, a PA se reduziu nos grupos normotenso e hipertenso, e esse efeito foi inibido pelo L-NAME em animais hipertensos apenas na dose de 10 mg/kg. O manool ex vivo promoveu vasorrelaxamento, inibido pela incubação de L-NAME e ODQ ou remoção do endotélio. Os níveis plasmáticos de NOx aumentaram no grupo hipertenso após a administração de manool. O manool induz o relaxamento vascular dependente do endotélio na aorta de ratos, mediado pela via de sinalização NO/cGMP e redução da PA, e também pelo aumento plasmático de NOx. Esses efeitos combinados podem estar envolvidos na modulação da resistência periférica, contribuindo para o efeito anti-hipertensivo do diterpeno.

Conclusão:

Esses efeitos em conjunto podem estar envolvidos na modulação da resistência periférica, contribuindo para o efeito anti-hipertensivo do diterpeno.

Palavras-chave: Doenças Cardiovasculares, Hipertensão, Diterpeno, Manool, Reatividade, Plantas Medicinais, Óxido Nítrico, Ratos

Introdução

Os diterpenos são uma ampla classe de metabólitos químicos, amplamente distribuídos no reino vegetal, com mais de 12.000 compostos conhecidos.¹^,² Eles podem ser divididos em dois tipos: diterpenos de metabolismo especializado (secundário) e diterpenos de metabolismo geral (primário). Os diterpenos secundários podem ter funções nas interações ecológicas das plantas com outros organismos e benefícios em fármacos, perfumes, resinas e outros bioprodutos industriais com grande relevância econômica.¹^,² Diversos metabólitos secundários, como terpenos, ácidos fenólicos, polifenóis, flavonoides e antocianinas, foram relatados em espécies de sálvia. Essas espécies são vistas como excelentes fontes de diterpenos.³ De acordo com os achados quimiotaxonômicos, o manool foi relatado anteriormente nas seguintes espécies de sálvia: S. sclarea, S. pubescens, S. lavandulifolia, S. hypoleuca, S. miltiorrhizae. Também está presente em outras espécies, como na Pinuscaribaea (Pinaceae), Lourteigiastoechadifolia (Asteraceae) e Halocarpusbiformis (Podocarpaceae). No entanto, o manool é o principal diterpeno das várias espécies de sálvia, sendo encontrado em maior concentração na Salvia officinalis.⁴

A biossíntese das unidades estruturais de isopreno de uma ampla variedade de terpenos, incluindo os diterpenos, ocorre pela via da desoxilulose. Essa via aumenta e evolui para dois produtos distintos: isopentenildifosfato (IPP) e dimetilalildifosfato (DMAPP). Mais especificamente, o manool, cuja composição química é C₂₀H₃₄O, é um diperteno do tipo labdano bicíclico. Sua estrutura se baseia em um esqueleto carbonado do tipo 2E, 6E, 10E-geranilgeranilpirofosfato (GGPP).⁵^–⁷

A descoberta de novas substâncias com atividade anti-hipertensiva, baixo custo e poucos efeitos adversos é ainda um aspecto desejável e de importância para a utilização clínica.⁸ Porém, várias dificuldades são encontradas para esse fim, como a escolha do modelo experimental, obtenção de extratos padronizados e a dificuldade de obtenção, isolamento e identificação das substâncias ativas.⁹^,¹⁰ A opção de conduzir pesquisas, a partir da indicação de plantas utilizadas pelas comunidades, encurta o percurso de desenvolvimento de um novo fármaco, pois os pesquisadores dispõem, antes mesmo de se iniciarem estudos científicos, de uma indicação de qual atividade biológica esta droga poderia apresentar.¹¹^,¹²

Os diterpenos, em particular, estão entre os principais compostos com ligação às propriedades cardiovasculares, tais como vasorrelaxante, inotrópica, diurética e hipotensiva. A ação vascular exercida por esses compostos parece envolver múltiplos mecanismos, como endotélio dependente e endotélio independente, aumento de prostaciclina e bloqueio de canais de cálcio dependentes de voltagem.¹³^–¹⁷

Conforme descrito anteriormente na revisão da literatura, o manool — C₂₀H₃₄O — é um diterpeno do tipo labdano, comumente encontrado em diversas famílias de plantas, é o principal diterpeno de várias espécies de sálvia, e está presente em concentrações mais elevadas na Salvia officinalis (Figura 1).¹^,³^,¹⁸^,¹⁹ É uma espécie da família Lamiaceae (Labiateae), originária do sul da Europa. Apresenta hábito de crescimento herbáceo ou arbustivo de pequeno porte, é planta perene que floresce no Hemisfério Sul entre os meses de agosto e dezembro.²⁰

Li et al.,²¹ constaram que embora o manool possua atividades desconhecidas do ponto de vista cardiovascular, ele deve ser considerado como fator crucial nos estudos a serem realizados. Além disso, pode ser visto como um novo condutor para o tratamento de doenças cardíacas, merecendo mais investigação.⁴^,²¹^,²² O protocolo experimental incluiu observações sobre os níveis plasmáticos de óxido nítrico (NOx) em animais hipertensos e o impacto da manool na BP de animais após a administração de diferentes doses do composto.

Sabendo que o manool pertence à classe dos compostos diterpênicos, com potencial uso no tratamento da hipertensão, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o possível efeito vasodilatador e os mecanismos celulares envolvidos na resposta de relaxamento de anéis aórticos de ratos. Portanto, o objetivo foi avaliar o efeito hipotensor in vivo do manool e verificar o efeito vasorrelaxamento ex vivo em anéis aórticos de ratos.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética e Animais

As políticas de manejo de animais e procedimentos experimentais foram analisadas e aprovadas pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (n. 060/210), seguindo as orientações da Diretiva 2010/63 UE da Comissão Europeia. Trinta e quatro ratos Wistar machos (180–220 g) foram acondicionados em condições laboratoriais padrão (ciclo claro/escuro de 12 horas a 21 °C) com livre acesso à água e ração. Os animais foram divididos aleatoriamente em cinco grupos de 7 animais para protocolos de pressão arterial normotensa e hipertensa (veículo normotenso, manool normotenso; veículo hipertenso, manool hipertenso e manool hipertenso + L-NAME). Os animais alocados nos grupos normotensos foram sham-operados, enquanto os animais alocados nos grupos hipertensos foram submetidos ao procedimento cirúrgico 2R1C (dois rins-um-clipe hipertensos) para indução da hipertensão. Utilizou-se um outro grupo de 6 animais que não realizaram nenhum procedimento (intactos) para estudos de reatividade vascular ex vivo.

Fármacos

Manool, acetilcolina (ACh), 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalina-1-ona (ODQ) e fenilefrina (Phe), da Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, EUA); éster metílico de Nω-nitro-L-arginina (L-NAME), obtido na Calbiochem (San Diego, CA, EUA); Vetec Química Fina Ltda forneceu isoflurano da Abbott e todos os sais usados para a preparação da solução de Krebs. Quase todos os fármacos foram preparados com água destilada, sendo o manool solubilizada em dimetilsulfóxido (50 uL) e diluído em etanol/água (2:10, volume total 200 uL). Para os experimentos de reatividade vascular, 100 uL foram diluídos em 900 uL de água, formando o estoque (10⁻³). A partir desse estoque, preparou-se a curva. O volume usado a partir dessa curva foi de 10 uL em uma cuba de 10 ml. Portanto, após tantas diluições, o veículo não promove nenhum efeito na reatividade vascular.

Indução da Hipertensão

Após anestesia intraperitoneal com cetamina (50 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), a artéria renal foi exposta. Os grupos hipertensos apresentaram constrição parcial da artéria renal esquerda principal com clipe de prata com abertura de 0,10 mm (2R1C), enquanto os grupos normotensos tiveram a artéria renal esquerda principal isolada, mas não receberam o clipe (sham). Para monitorar o desenvolvimento da hipertensão, a pressão arterial sistólica (PAS) foi medida de forma não invasiva por meio da pletismografia de cauda, uma vez por semana. (Kent Scientific Corporation, Connecticut, EUA). Os ratos 2R1C foram considerados hipertensos com PAS de cauda ≥ 160 mmHg na 3ª semana após os procedimentos cirúrgicos. Os ratos 2R1C com PAS <160 mmHg na 3ª semana foram eutanasiados. Menos de 10% dos animais apresentaram PAS <160 mmHg. Os ratos que foram sham-operados foram incluídos no grupo normotenso.

Efeito do Manool na Pressão Arterial

Três semanas após a indução da hipertensão, os animais foram anestesiados, e a artéria e veia femoral foram canuladas, respectivamente, para medição contínua da pressão arterial sistólica (PAS) e administração de medicamentos. Após anestesia (uretano, 2 mg/kg, intraperitoneal), canulação vascular e período de estabilização (20 minutos) com registro contínuo da pressão arterial sistólica (PAS) em tempo real, três doses de manool (10, 20 e 40 mg/kg) ou veículo (dimetilsulfóxido — DMSO — e água+etanol) foram administrados aos ratos normotensos e hipertensos. Cada dose foi administrada em bolus intravenoso de 200 µL e o intervalo entre cada dose consecutiva foi de 6 minutos. Os animais que receberam veículo não receberam manool. Para cada animal, a variação na pressão arterial sistólica (ΔPAS) foi calculada subtraindo a média dos valores mais baixos de PAS imediatamente após a administração de manool da média dos valores basais de PAS antes do manool ou bolus do veículo. A pressão arterial média foi medida por meio do MP System 100 A (BioPac System, Inc., Santa Bárbara, CA, EUA).

Reatividade Vascular

Os experimentos foram realizados em anéis aórticos de ratos normotensos. Seis ratos Wistar machos (280–300 g) foram anestesiados com isoflurano inalatório, seguido de exsanguinação da aorta abdominal e toracotomia para retirada da aorta torácica. A aorta torácica foi cuidadosamente dissecada, confirmada como livre de tecido conjuntivo e imediatamente imersa em solução de Krebs. A solução de Krebs era composta por NaCl (118,0 mM), KCl (4,7 mM), CaCl2 (2,5 mM), KH2PO4 (1,2 mM), MgSO4 (1,66 mM), glicose (11,1 mM) e NaHCO3 (25,0 mM); a solução tinha pH 7,4. A aorta torácica imersa em solução de Krebs foi cortada em anéis de 4 a 5 mm de comprimento. Para os testes, o anel com endotélio desnudado foi removido esfregando-se suavemente o vaso da superfície interna com uma haste de aço fina. Esse procedimento remove efetivamente o endotélio, mas não afeta a capacidade do músculo liso vascular de se contrair ou relaxar. Os anéis aórticos foram colocados em 10 mL de banho orgânico para tecido isolado contendo solução de Krebs, a 37 °C, e 95% O₂/5% CO₂ (pH 7,4) para medir a força isométrica por meio do equipamento Grass FT03 (Grass Instrument Company, Quincy, MA, EUA). Cada anel foi alongado até o ponto ótimo de estiramento-tensão de 2,0 g, determinado em um estudo piloto, e permaneceram sob esta tensão por 60 min. Durante esse tempo, os tecidos foram lavados a cada 15 minutos. O endotélio foi considerado presente (E+) registrando-se o relaxamento de 80% induzido por Ach (10⁻⁶ M) após a pré-contração com Phe (10⁻⁷ M). O endotélio foi considerado ausente (E−) quando a resposta de relaxamento não ocorreu. Em seguida, cada anel foi lavado e reestabilizado por 30 min. Os anéis aórticos foram contraídos com Phe (10⁻⁷ M) depois que um platô estável foi atingido e as curvas de dose-resposta de manool foram obtidas. Os ensaios de concentração-resposta nos banhos orgânicos foram realizados na presença ou ausência de: L-NAME (2x10⁻⁴ M), um inibidor não específico da óxido nítrico sintase e ODQ (10⁻⁴ M), um inibidor da guanililciclase.²⁰ As preparações foram incubadas com os inibidores por 30 min. Não realizamos curvas de dose-resposta com um veículo porque a diluição foi realizada em água. A solução inicial 1 M (50 uL de DMSO + 30 uL de etanol + 120 uL de água) sofreu diluição em série para 10⁻¹ M em água.

Medições Plasmáticas Indiretas de NO

Coletou-se amostras de sangue (1 ml) da artéria femoral após a última curva dose-resposta em veículo normotenso e manool hipertenso, sendo colocadas em tubos heparinizados. Após centrifugação do sangue (3000×g, 10 minutos, 4 °C), o plasma foi imediatamente imerso em nitrogênio líquido e mantido a −70 °C até a dosagem de nitrito e nitrato (NOx). As amostras foram analisadas em duplicata para NOx por ensaio de quimioluminescência à base de ozônio. As amostras plasmáticas foram brevemente tratadas com etanol frio (1 volume de plasma: 2 volumes de etanol por 30 minutos a −20 °C) e centrifugadas (4000×g, 10 minutos). Os níveis de NOx foram medidos pela injeção de 25 μL de sobrenadante em recipiente de purga de vidro contendo 0,8% de vanádio (III) em HCl (1 N) a 90 °C, que reduz o NOx a óxido nitroso. Uma corrente de nitrogênio foi borbulhada através do recipiente de purga contendo vanádio (III), em seguida através de NaOH (1 N), e então em um analisador de NO (Sievers® Nitric Oxide Analyzer 280, GE Analytical Instruments, Boulder, CO, EUA).

Análise Estatística

Os dados são apresentados como média ± erro-padrão da média. Realizamos análises estatísticas com o teste T de Student, análise de variância simples (ANOVA), pós-teste de Bonferroni, e ANOVA de duas vias com medidas repetidas, com o pós-teste de Bonferroni para detectar possíveis diferenças entre os valores do estudo. Para cada figura, a legenda descreve qual teste foi realizado para análise. Considerou-se significativo um p<0,05 (Prism 5.0, GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). Um tamanho de amostra de (N = 5–7) por grupo forneceu 95% de poder com um nível de significância de 0,05% em protocolos de medição da pressão arterial in vivo. Além disso, um tamanho de amostra de (N = 6–8) animais por grupo forneceu 95% de poder com um nível de significância de 0,05 para detectar uma redução relativa de 10% na contração máxima em vasos pré-contraídos. O número de animais foi escolhido com base na literatura.²⁰^,²³^,²⁴

Resultados

Antes dos procedimentos cirúrgicos, não havia diferenças na PA entre os grupos normotenso e hipertenso. Porém, após a indução da hipertensão, da 1ª à 3ª semana, a PA mostrou-se significativamente mais elevada nos ratos hipertensos (130,6 mmHg versus 193,0 mmHg) (Figura 2).

A avaliação do peso corporal mostrou que, na primeira semana, os grupos apresentavam cargas semelhantes. Porém, ao final de três semanas, o grupo de hipertensos apresentou valores significativamente menores em relação ao grupo de normotensos (Tabela 1).

Tabela 1. Evolução temporal do peso corporal de animais normotensos e hipertensos.

Evolução do peso corporal (g)
Grupos	Inicial	Final
Normotenso	233,4±7,1	480,2±10,2
Hipertenso	239,4±7,7	404,8±18,2^*

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Cada valor representa a média ± erro-padrão da média.

p<0,05 indica diferença significativa entre o grupo hipertenso e o grupo normotenso. Teste t de Student.

Na análise da PAS in vivo, apenas a cirurgia (2R1C) foi capaz de alterar o sangue (veículo normotenso versus veículo hipertenso). O manool promoveu resposta dose-dependente na PAS, reduzindo significativamente a pressão a partir da dose de 20 mg/kg no grupo normotenso, não havendo diferença entre 20 e 40 mg/kg neste grupo para o manool. No grupo hipertenso, apenas uma dose menor de manool (10 mg/kg) reduziu a PAS em comparação ao grupo controle (veículo hipertenso), e a administração prévia de L-NAME preveniu o efeito manool. No grupo hipertenso, o efeito manool não foi dose-dependente (Figura 3).

O NOx plasmático fica um pouco alto no grupo normotenso após a administração de manool, mas não é significativo. Porém, no grupo hipertenso, o manool promoveu aumento nos níveis plasmáticos de NOx (Figura 4).

Sobre os experimentos de reatividade vascular, o manool promoveu um relaxamento dose-dependente em anéis intactos (Figura 5), pré-contraídos com Phe. A incubação com L-NAME ou ODQ bloqueou o relaxamento induzido por manool em anéis com endotélio intacto da mesma forma que a remoção do endotélio (Figuras 6A e 6B).

Discussão

Pesquisas anteriores mostraram que diterpenos labdanos têm uma ampla gama de efeitos farmacológicos, como a capacidade de inibir a replicação do vírus HIV, prevenir resfriados comuns, ação antimalárica, antibacteriana, anti-inflamatória, anti-hiperglicêmica, evitar a disenteria, além de suprimir diversas células cancerosas.⁶^,¹³ Já em aspecto cardiovascular, evidenciaram: significativa redução de estenose em artérias ateroscleróticas, associada à redução das taxas de reestenose após angioplastia em coelhos; redução da agregação plaquetária in vitro e ação anti-hipertensiva em ratos.¹³^,¹⁵^–¹⁷^,²⁵ São, portanto, vistos como fonte promissora de novos protótipos para a descoberta e desenvolvimento de novos agentes terapêuticos cardiovasculares.

Os diterpenos, em particular, estão entre os principais compostos com ligação às propriedades cardiovasculares, como a propriedade vasorrelaxante, inotrópica, diurética e atividade hipotensora.²⁶ A ação vascular exercida por esses compostos parece envolver múltiplos mecanismos, como endotélio dependente e endotélio independente, aumento de prostaciclinas e bloqueio de canais de cálcio dependentes de voltagem.

No presente estudo, utilizamos o modelo 2R1C para investigar o possível efeito anti-hipertensivo do manool. Esse modelo produziu resultados satisfatórios para a indução de hipertensão, com aumento significativo da pressão arterial em animais, após três semanas da cirurgia. Mesmo na primeira semana após a cirurgia, a PAS de 2R1C foi maior que em um animal normotenso. A PAS encontrada em animais hipertensos está de acordo com outros autores que avaliaram um modelo semelhante.²³^,²⁷^,²⁸

Os resultados obtidos após a administração de 3 doses crescentes de manool mostraram que este composto foi capaz de reduzir a PA em ratos normotensos e hipertensos. Em animais normotensos, o manool apresenta efeito dose-resposta positivo. Esse achado difere de outros compostos naturais, incluindo o ácido rosmarínico, que reduziu a PA apenas em animais hipertensos.²³ Esse perfil de resposta não é observado em animais hipertensos, onde o aumento da dose não representa um efeito mais significativo. A ΔPAS é a mesma após 10, 20 e 40 mg/kg de manool em animais hipertensos; em outras palavras, independentemente das doses, a pressão arterial máxima era de cerca de 40–50 mmHg. Porém, como no grupo com veículo hipertenso houve redução da PAS, apenas 10 mg/kg foi capaz de reduzir efetivamente a pressão.

Nossa hipótese para esse efeito anti-hipertensivo da manool baseou-se em estudos recentes sobre a atividade vasodilatadora de diterpenos mediada por NO.¹³^,¹⁵^,¹⁶^,²⁶ Demonstrou-se que a hipertensão tem forte associação com a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs).²⁹ Consequentemente, a inativação do NO pelo superóxido induz o desenvolvimento de disfunção endotelial em doenças cardiovasculares.³⁰ A propriedade de alguns compostos de aumentar o NO pode ser atraente para reduzir a disfunção endotelial da hipertensão. Nossos achados indicam que o efeito anti-hipertensivo do manool pode ser parcialmente mediado pelo NO, uma vez que a administração de L-NAME antes da injeção de manool bloqueia a redução da PAS em animais hipertensos apenas na dose de 10 mg/kg. Corroborando esses achados, a concentração plasmática de NOx aumentou significativamente apenas nos animais hipertensos que receberam manool. Alguns estudos de NOx no modelo 2R1C mostram que a hipertensão pode reduzir esses níveis, mas nosso achado está em desacordo com esses dados, talvez por causa do tempo da cirurgia 2R1C.³¹^,³² Embora o efeito anti-hipertensivo total do manool permaneça desconhecido, outras hipóteses podem ser levantadas, como inibição e modulação da ECA (enzima de conversão da angiotensina).³³ Demonstrou-se que, no modelo 2R1C, há aumento na atividade da ECA plasmática e alguns peptídeos naturais de arroz, terpenos, fitoestrogênio e compostos polifenólicos podem reduzir a atividade da ECA,²⁰^,³⁴^,³⁵ o que poderia caracterizar esse mecanismo como complementar ao NO na manutenção da PA.

Seria possível atribuir o efeito anti-hipertensivo do manool a um efeito direto na reatividade vascular que não inclui o aumento do NO sistêmico. O presente estudo mostrou que o manool induz o relaxamento aórtico em ratos apenas na presença de endotélio e pré-incubação dos anéis aórticos com inibidores da sintase de óxido nítrico (NOS) ou guanilato ciclase (GC). As propriedades cardiovasculares do diterpeno estão relacionadas ao bloqueio dos canais de Ca²⁺ e ativação de NO/GMPc (guanosina monofosfato cíclica).¹³ O endotélio produz vasodilatadores potentes, como o fator relaxante derivado do endotélio (EDRF, NO), prostaciclina e fator de hiperpolarização derivado do endotélio (EDHF). O NO é o mediador predominante na condutância e nas grandes artérias, enquanto o EDHF e a prostaciclina são mais prevalentes nas artérias menores, como os vasos mesentéricos, artérias coronárias e vasos de resistência periférica.³⁶ Corroborando nossos achados, alguns têm-se relatos de que alguns diterpenos, como o 14-desoxi-11,12-dihydroandrographolide e 14-desoxyandrographolide dilatam anéis aórticos. O composto 14-desoxi-11,12-dihydroandrographolide teve um efeito hipotensor em ratos anestesiados. Ambos os compostos exercem sua atividade vasorrelaxante pela liberação de NO e ativação da via da guanilateciclase, bem como pelo bloqueio do influxo de Ca²⁺ por meio de canais de Ca²⁺ operados por voltagem e por receptor.¹³^,³⁷^–³⁹ No presente estudo, também sugerimos que o manool tem um efeito vasorrelaxante dependente do endotélio operando através da via NO/GMPc.

Conclusão

Em resumo, o manool induz relaxamento vascular dependente do endotélio na aorta de ratos mediado pela via de sinalização NO/GMPc e redução da PA também pelo aumento plasmático de NOx. Esses efeitos em conjunto podem estar envolvidos na modulação da resistência periférica, contribuindo para o efeito anti-hipertensivo desse diterpeno.

Footnotes

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi financiado pelo FAEPA e CNPq.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Ariadne Santana e Neves Monteiro pela Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.

Referências

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Effect of Diterpene Manool on the Arterial Blood Pressure and Vascular Reactivity in Normotensive and Hypertensive Rats

Ariadne Santana e Neves Monteiro ¹, Debora Ribeiro Campos ¹, Agnes Afrodite Sumarelli Albuquerque ¹, Paulo Roberto Barbosa Evora ^1,^✉, Luciana Garros Ferreira ¹, Andrea Carla Celotto ¹

Abstract

Background:

Many studies have shown that the diterpenoid classes exert a significant effect on the cardiovascular system. Diterpenes, in particular, are among the main compound links to cardiovascular properties such as vasorelaxant, inotropic, diuretic and hypotensive activity. While the manool vasorelaxation mechanism is visible, its effect on blood pressure (BP) is still unknown.

Objective:

To evaluate the in vivo hypotensive effect of manool and check the ex vivo vasorelaxation effect in rat aortic rings.

Methods:

The animals were divided randomly into two groups: normotensive and hypertensive. The normotensive group was sham-operated, and the 2K1C model was adopted for the hypertensive group. Invasive BP monitoring was performed for manool tests at different doses (10, 20 and 40 mg/kg). Concentration-response curves for manool were obtained in the aorta rings, with endothelium, pre-contracted with phenylephrine (Phe) after incubation with Nω-nitro-L-arginine methyl ester(L-NAME) or oxadiazole [4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ). Nitric oxide (NOx) plasma levels were measured by chemiluminescence assay.

Results:

After manool administration, BP was reduced in normotensive and hypertensive groups, and this effect was inhibited by L-NAME in hypertensive animals only in 10 mg/kg dose. Ex vivo manool promoted vasorelaxation, which was inhibited by L-NAME and ODQ incubation or endothelium removal. NOx plasma levels increased in the hypertensive group after manool administration. Manool elicits endothelium-dependent vascular relaxation in rat aorta mediated by the NO/cGMP signaling pathway and BP reduction, also by NOx plasma increase. These combined effects could be involved in modulating peripheral resistance, contributing to the antihypertensive effect of diterpene.

Conclusion:

These effects together could be involved in modulating peripheral resistance, contributing to the antihypertensive effect of diterpene.

Keywords: Cardiovascular Diseases, Hypertension, Diterpenes, Manool, Reactivity, Nitric Oxide, Rats

Introduction

Diterpenes is a broad class of chemical metabolites, which are widely distributed in the flora, with more than 12,000 known compounds.¹^,² They can be divided into two types: specialized (secondary) metabolism diterpenes and general (primary) metabolism diterpenes. Secondary diterpenes can have functions in the ecological interactions of plants with other organisms and benefits in pharmaceuticals, perfumes, resins and other industrial bioproducts with great economic relevance.¹^,² Several secondary metabolites, such as terpenes, phenolic acids, polyphenols, flavonoids and anthocyanins, have been reported from Salvia species. These species are seen as excellent sources of diterpenes.³ According to chemotaxonomic findings, manool was previously reported in the following Salvia species: S. sclarea, S. pubescens, S. lavandulifolia, S. hypoleuca, S. miltiorrhizae. It is also present in other species, such as Pinuscaribaea (Pinaceae), Lourteigiastoechadifolia (Asteraceae) and Halocarpusbiformis (Podocarpaceae). However, manool is the main diterpene of the various species of Salvia, and it is found in higher concentration in Salvia officinalis.⁴

The biosynthesis of the isoprene structural units of a wide variety of terpenes, including diterpenes, occurs by the deoxyxylulose pathway. This pathway rises to two distinct products: isopentenyl diphosphate (IPP) and dimethylallyl diphosphate (DMAPP). More specifically, manool, whose chemical composition is C₂₀H₃₄O, is a bicyclic labdane diterpene. Its structure is based on a 2E, 6E, 10E-geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) carbon skeleton.⁵^–⁷

The discovery of new substances with antihypertensive activity, with low cost and few adverse effects, is still desirable and important to clinical use.⁸ However, several difficulties are encountered for this purpose, such as the choice of experimental model, obtaining standardized extracts and the difficulty of obtaining, isolating and identifying the active substances.⁹^,¹⁰ The option to conduct research, from the indication of plants used by communities, shortens the route of developing a new drug, as researchers have, before starting scientific studies, a hint of which biological activity this medication might present.¹¹^,¹²

Diterpenes, in particular, are among the primary compound links to cardiovascular properties, such as vasorelaxant, inotropic, diuretic and hypotensive activity. The vascular action exerted by these compounds appears to involve multiple mechanisms. Such mechanisms are either independent or endothelium-dependents, prostacyclin, and increased blocking of voltage-dependent calcium channels.¹³^–¹⁷

As previously described in the literature review, manool — C₂₀H₃₄O — is a labdane-type diterpene, commonly found in various plant families, it is the main diterpene of several species of Salvia, and is present in higher concentrations in Salvia officinalis (Figure 1).¹^,³^,¹⁸^,¹⁹ It is a species of the family Lamiaceae (Labiateae), originating in southern Europe. It presents a habit of herbaceous growth or small shrub; it is a perennial plant that flourishes in the Southern Hemisphere between August and December.²⁰

Li et al.²¹ found that although manool possesses cardiovascular activity that is still unknown, it must be considered a crucial factor to be investigated. Moreover, it can be seen as a new driver for the treatment of heart disease and deserves further research.⁴^,²¹^,²² The experimental protocol included observations on plasma levels of nitric oxide (NO) in hypertensive animals and the impact of manool on the BP of animals following the administration of different doses of the compound.

Knowing that manool belongs to the class of diterpene compounds, with potential use in the treatment of hypertension, the present investigation was designed to assess the possible vasodilator effect and the cellular mechanisms involved in the relaxation response of aortic rings of rats. Therefore, the aim was to evaluate the in vivo hypotensive effect of manool and check the ex vivo vasorelaxation effect in aortic rings of rats.

Material and Methods

Ethics Statement and Animals

Animal handling policies and experimental procedures were reviewed and approved by the Institutional Committee for Animal Care from Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo (n. 060/210), following the directions of the European Commission's Directive 2010/63/EU. Thirty-four male Wistar rats (180–220 g) were housed under standard laboratory conditions (12 h light/dark cycle at 21 °C) with water and food ad libitum. The animals were allocated randomly into five groups of 7 animals for normotensive and hypertensive blood pressure protocols (normotensive vehicle, normotensive manool; hypertensive vehicle, hypertensive manool and hypertensive manool + L-NAME). The animals allocated to the normotensive groups were sham-operated, while animals allocated to the hypertensive groups underwent the surgical procedure 2K1C (two-kidney-one-clip hypertensive rats) for hypertensive induction. Another group of 6 animals that did not undergo any procedure (intact) was used for ex vivo vascular reactivity studies.

Drugs

Manool, acetylcholine (ACh), 1H-[1,2,4]oxadiazole[4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ), and phenylephrine (Phe) were from Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA); Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) was obtained from Calbiochem (San Diego, CA, USA); Vetec Química Fina Ltda furnished isoflurane from Abbott and all the salts used for Krebs solution preparation. Almost all the drugs were prepared with distilled water, and manool was solubilized in dimethyl sulfoxide (50 uL) and diluted in ethanol/water (2:10, total volume 200 uL). For vascular reactivity experiments, 100 uL was diluted in 900 uL of water, making the stock (10⁻³). From this stock, the curve was prepared. The volume used from this curve was 10 uL in a 10 ml cube. Therefore, after so many dilutions, the vehicle does not promote any effect on vascular reactivity.

Induction of Hypertension

After i.p. anesthesia with ketamine (50 mg/kg) and xylazine (10 mg/kg), the renal artery was exposed. The hypertensive groups had partial constriction of the main left renal artery with a silver clip of 0.10 mm gap (2K1C), while the normotensive groups had the main left renal artery isolated but did not receive the clip (sham). To monitor hypertension development, systolic blood pressure (SBP) was noninvasively measured using a tail-cuff, once a week. (Kent Scientific Corporation, Connecticut, USA). The 2K1C rats were considered hypertensive with tail SBP ≥ 160 mmHg at the 3^rd week after the surgical procedures. The 2K1C rats with SBP < 160 mmHg at the 3^rd week were euthanatized. Less than 10% of animals had SBP < 160 mmHg. The sham-operated rats were included in the normotensive group.

Manool Effect on Systolic Blood Pressure

Three weeks after hypertension induction, the animals were anaesthetized, and the femoral artery and vein were respectively cannulated for continuous measurement of systolic blood pressure (SBP) and drugs administration. After anesthesia (urethane, 2 mg/kg, intraperitoneal), vascular cannulation and stabilization period (20 minutes) with continuous real-time SBP recording, three doses of manool (10, 20 and 40 mg/kg) or vehicle (Dimethyl sulfoxide — DMSO — and water+ethanol) were administered to the normotensive and hypertensive rats. Each dose was given in a 200 µL intravenous bolus, and the interval between each consecutive dose was 6 minutes. The animals that received vehicle did not receive manool. For each animal, the variation in systolic blood pressure (ΔSBP) was calculated subtracting the mean of the lowest SBP values immediately after manool administration from the average of the baseline SBP values before manool or vehicle bolus. Mean blood pressure was measured using MP System 100 A (BioPac System, Inc., Santa Barbara, CA, USA).

Vascular Reactivity

Experiments were conducted in aortic rings from normotensive rats. Six male Wistar rats (280–300 g) were anaesthetized with inhalational isoflurane, followed by abdominal aorta exsanguinations and thoracotomy for thoracic aorta harvesting. The thoracic aorta was carefully dissected, confirmed to be free of connective tissue, and immediately immersed in Krebs solution. The Krebs solution was composed of NaCl (118.0 mM), KCl (4.7 mM), CaCl2 (2.5 mM), KH2PO4 (1.2 mM), MgSO4 (1.66 mM), glucose (11.1 mM), and NaHCO3 (25.0 mM); the solution had pH 7.4. The thoracic aorta immersed in Krebs solution was cut into rings that were 4–5 mm in length. For tests, the endothelium-denuded ring was removed by gently rubbing the internal surface vessel with a thin steel rod. This procedure effectively removes the endothelium, but it does not affect the ability of the vascular smooth muscle to contract or relax. The aortic rings were placed in 10 mL isolated organ bath containing Krebs solution, at 37 °C, and 95% O₂/5% CO₂ (pH 7.4) to measure the isometric force with Grass FT03 equipment (Grass Instrument Company, Quincy, MA, USA). Each ring was stretched to the optimal 2.0 g length-tension, determined in a pilot study, and was allowed to equilibrate for 60 min. During this time, tissues were washed every 15 min. The endothelium was considered to be present (E+) recording the Ach-induced 80% relaxation (10⁻⁶ M) after pre-contraction with Phe (10⁻⁷ M). Endothelium was considered absent (E−) when the relaxation response did not occur. Next, each ring was washed and re-equilibrated for 30 min. The aortic rings were precontracted with Phe (10⁻⁷ M) after a stable plateau was reached, and dose-response curves of manool were obtained. The concentration-response assays in the organ baths were carried out in the presence or absence of: L-NAME (2x10⁻⁴ M), a nonspecific nitric oxide synthase inhibitor and ODQ (10⁻⁴ M), a guanylyl cyclase inhibitor.²⁰ The preparations were incubated with the inhibitors for 30 min. We did not perform dose-response curves with a vehicle because the dilution was performed in water. The initial solution 1 M (50 uL DMSO + 30 uL ethanol + 120 uL water) suffered serial dilution for 10⁻¹ M in water.

Indirect Plasma Measurements of NO

Blood samples (1 ml) were collected from the femoral artery, after the last dose-response curve from a normotensive vehicle and hypertensive manool, and placed in heparinized tubes. After blood centrifugation (3000×g, 10 minutes, 4 °C), the plasma was immediately immersed in liquid nitrogen and kept at −70 °C until nitrite and nitrate (NOx) measurements. Samples were analyzed in duplicates for NOx by ozone-based chemiluminescence assay. The plasma samples were briefly treated with cold ethanol (1 volume of plasma: 2 volumes of ethanol for 30 minutes at −20 °C) and centrifuged (4000×g, 10 minutes). The NOx levels were measured by injecting 25 μL of the supernatant in a glass purge vessel containing 0.8% of vanadium (III) in HCl (1 N) at 90 °C, which reduces NOx to NO gas. A nitrogen stream was bubbled through the purge vessel containing vanadium (III), then through NaOH (1 N), and then into a NO analyzer (Sievers® Nitric Oxide Analyzer 280, GE Analytical Instruments, Boulder, CO, USA).

Statistical Analysis

The data are presented as mean ± standard error of the mean (SEM). We performed statistical analyses with Student's T-test, one-way (ANOVA), Bonferroni post-test and two-way repeated-measures of variance (ANOVA) with the Bonferroni post-test to detect potential differences between the values in the study. For each figure, the legend describes which test was performed for analysis. P<0.05 was considered significant (Prism 5.0, GraphPad Software, San Diego, CA, USA). A sample size of (N = 5–7) per group provided 95% power with a 0.05% significance level in protocols of in vivo blood pressure measurement. Moreover, a sample size of (N = 6–8) animals per group provided 95% power with a 0.05 significance level to detect a relative 10% reduction in the maximal contraction in precontracted vessels. The number of animals was based on the literature.²⁰^,²³^,²⁴

Results

Before surgical procedures, there were no differences in the BP between normotensive and hypertensive groups. However, after hypertension induction, from the 1^st to the 3^rd week, the BP was significantly higher in the hypertensive rats (130,6 mmHg versus 193,0 mmHg) (Figure 2).

The evaluation of body weight showed that, in the first week, the groups had similar loads. However, at the end of three weeks, the hypertensive group showed significantly lower values compared to the normotensive group (Table 1).

Table 1. Time evolution of body weight normotensive and hypertensive animals.

Evolution of body weight (g)
Groups	Initial	Final
Normotensive	233.4±7.1	480.2±10.2
Hypertensive	239.4±7.7	404.8±18.2^*

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Each value represents mean ± SEM.

p<0.05 indicates significant difference between the hypertensive group and the normotensive group. Student's T-test.

In the in vivo SBP analysis, only the surgery (2K1C) was able to change the blood (normotensive vehicle versus hypertensive vehicle). Manool promoted a dose-dependent response on SBP, reducing the pressure significantly from the dose of 20 mg/kg in the normotensive group, and there is not any difference between 20 and 40 mg/kg in this group for manool. In the hypertensive group, only a lower dose of manool (10 mg/kg) reduced the SBP compared to the control (hypertensive vehicle) group, and the previous administration of L-NAME prevented the manool effect. In the hypertensive group, the manool effect was not dose-dependent (Figure 3).

The plasma NOx is a little high in the normotensive group after manool administration, but it is not significant. However, in the hypertensive group, manool promoted an increase in plasma NOx levels (Figure 4).

About vascular reactivity experiments, manool promoted a dose-dependent relaxation only in intact rings (Figure 5), precontracted with Phe. Incubation with either L-NAME or ODQ blocked the relaxation induced by manool in endothelium-intact rings in the same way of endothelium removal (Figures 6A and 6B).

Discussion

Previous research has shown that labdane diterpenes have a wide range of pharmacological effects, such as the ability to inhibit HIV replication, prevent common colds, it is antimalarial, antibacterial, anti-inflammatory, antihyperglycemic, prevents dysentery, besides suppressing various cancerous cells.⁶^,¹³ On the cardiovascular side, they showed: significant reduction of stenosis in atherosclerotic arteries, associated with the fewer restenosis rates after angioplasty in rabbits; reduction of ex vivo platelet aggregation, and antihypertensive action in rats.¹³^,¹⁵^–¹⁷^,²⁵ They are thus seen as a promising source of new prototypes for the discovery and development of new agents of cardiovascular therapeutics.

Diterpenes, in particular, are among the significant compounds with binding to cardiovascular properties, such as vasorelaxant, inotropic, diuretic and hypotensive activity.²⁶ The vascular action exerted by these compounds seems to involve multiple mechanisms, such as dependent and independent endothelium, increase of prostacyclin and blockade of voltage-dependent calcium channels.

In the present study, we used the 2K1C model for investigating the possible antihypertensive effect of manool. This model produced satisfactory results, for hypertension induction, with a significant increase in blood pressure in animals, after three weeks of surgery. Even the first week post-surgery, the 2K1C SBP was higher than in a normotensive animal. SBP found in hypertensive animals agree with other authors who evaluated a similar model.²³^,²⁷^,²⁸

The results obtained after administration of 3 increasing doses of manool showed that this compound was able to reduce BP in both normotensive and hypertensive rats. In normotensive animals, manool presents a positive dose-response effect. This finding is different from other natural compounds, including Rosmarinic acid, which reduced BP only in hypertensive animals.²³ This response profile is not observed in hypertensive animals, where the dose increase does not represent a more significant effect. ΔSBP is the same after 10, 20 and 40 mg/kg of manool in hypertensive animals; in other words, regardless of the doses, maximum blood pressure was about 40–50 mmHg. However, as in the hypertensive vehicle group there was a reduced SBP, only the 10 mg/kg was able to effectively reduce the pressure.

Our hypothesis to this antihypertensive effect of manool was based on recent studies about the vasodilator activity of diterpenes mediated by NO.¹³^,¹⁵^,¹⁶^,²⁶ It has been demonstrated that hypertension has a strong association with the formation of reactive oxygen species (ROS).²⁹ Consequently, inactivation of NO by superoxide induces the development of endothelial dysfunction in cardiovascular diseases.³⁰ The property of some compounds to increase NO can be attractive to reducing the endothelial dysfunction of hypertension. Our findings indicate that the antihypertensive effect of manool can be partially mediated by NO once L-NAME administration before manool injection blocks SBP reduction in hypertensive animals only at a dose of 10 mg/kg. Corroborating these findings, the plasma NOx concentration was increased significantly only in the hypertensive animals that received manool. Some NOx studies in the 2K1C model show that hypertension can reduce these levels, but our finding is in disagreement with this data, perhaps because of the time of 2K1C surgery.³¹^,³² Though the full antihypertensive effect of manool remains unknown, other hypotheses can be raised, such as ACE (angiotensin-converting enzyme) inhibition and modulation.³³ It was demonstrated that, in the 2K1C model, there is an increase in plasma ACE activity and some natural peptides from rice, terpenes, phytoestrogen and polyphenol compounds can reduce this ACE activity,²⁰^,³⁴^,³⁵ which could characterize this mechanism as complementary to NO on BP maintenance.

It would be possible to attribute the antihypertensive effect of manool to a direct effect on vascular reactivity that does not include an increase of systemic NO. The present study showed that manool induces relaxation in rat aorta only in the presence of endothelium and pre-incubation of the aortic rings with nitric oxide synthase (NOS) or guanylyl cyclase (GC) inhibitors. The cardiovascular properties of diterpene are related to Ca²⁺ channels blockade and NO/cGMP (cyclic guanosine monophosphate) activation.¹³ The endothelium produces potent vasodilators, such as the endothelium-derived relaxing factor (EDRF, NO), prostacyclin, and endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF). NO is the predominant mediator in conductance and large arteries, whereas EDHF and prostacyclin are more prevalent in smaller arteries, such as the mesenteric vessels, coronary arteries and peripheral resistance vessels.³⁶ Corroborating our findings, some diterpenes, such as 14-deoxy-11,12-dihydroandrographolide and 14-deoxyandrographolide have been reported to dilate aortic rings. The compound 14-deoxy-11,12-dihydroandrographolide had a hypotensive effect in anaesthetized rats. Both compounds exert their vasorelaxant activity by the release of NO and activation of the guanylate cyclase pathway, as well as the blockade of Ca²⁺ influx through both voltage- and receptor-operated Ca2+ channels.¹³^,³⁷^–³⁹ In the present study, we also suggest that manool has an endothelium-dependent vasorelaxant effect operating via the NO/cGMP pathway.

Conclusion

In summary, manool elicits endothelium-dependent vascular relaxation in rat aorta mediated by the NO/cGMP signaling pathway and BP reduction also by NOx plasma increase. These effects together could be involved in modulating the peripheral resistance, contributing to the antihypertensive effect of this diterpene.

Footnotes

Sources of Funding

This study was funded by Abbot Vascular.

Study Association

This article is part of the thesis of master submitted by Ariadne Santana e Neves Monteiro, from Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.

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PERMALINK

Efeito do Diterpeno Manool sobre a Pressão Arterial e Reatividade Vascular em Ratos Normotensos e Hipertensos

Ariadne Santana e Neves Monteiro

Debora Ribeiro Campos

Agnes Afrodite Sumarelli Albuquerque

Paulo Roberto Barbosa Evora

Luciana Garros Ferreira

Andrea Carla Celotto

Resumo

Fundamento:

Objetivo:

Métodos:

Resultados:

Conclusão:

Introdução

Figura 1. Estrutura química do Manool.10,11.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética e Animais

Fármacos

Indução da Hipertensão

Efeito do Manool na Pressão Arterial

Reatividade Vascular

Medições Plasmáticas Indiretas de NO

Análise Estatística

Resultados

Tabela 1. Evolução temporal do peso corporal de animais normotensos e hipertensos.

Figura 4. Níveis plasmáticos de nitrito e nitrato (NOx) em veículos normotensos e manool e veículos hipertensos e animais com manool. ANOVA de uma via, pós-teste de Bonferroni (n=7). *p<0,01 indica diferença significativa entre veículo hipertenso e manool hipertenso.

Discussão

Conclusão

Footnotes

Referências

Effect of Diterpene Manool on the Arterial Blood Pressure and Vascular Reactivity in Normotensive and Hypertensive Rats

Ariadne Santana e Neves Monteiro

Debora Ribeiro Campos

Agnes Afrodite Sumarelli Albuquerque

Paulo Roberto Barbosa Evora

Luciana Garros Ferreira

Andrea Carla Celotto

Abstract

Background:

Objective:

Methods:

Results:

Conclusion:

Introduction

Figure 1. Manool chemical structure.10,11.

Material and Methods

Ethics Statement and Animals

Drugs

Induction of Hypertension

Manool Effect on Systolic Blood Pressure

Vascular Reactivity

Indirect Plasma Measurements of NO

Statistical Analysis

Results

Table 1. Time evolution of body weight normotensive and hypertensive animals.

Figure 4. Nitrite and nitrate levels (NOx) plasma in normotensive vehicle and manool and hypertensive vehicle and manool animals. One-way ANOVA, Bonferroni post-test (n=7). *p<0.01 indicates significant difference between hypertensive vehicle and hypertensive manool.

Discussion

Conclusion

Footnotes

ACTIONS

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Figura 1. Estrutura química do Manool.¹⁰^,¹¹.

Figure 1. Manool chemical structure.¹⁰^,¹¹.