遗传性铁粒幼细胞贫血新突变一例报告及文献复习

X连锁铁粒幼细胞贫血（XLSA）是遗传性铁粒幼细胞贫血（CSA）最常见类型（约占40％）[1]，由位于Xp11.21染色体上的红系特异性5′-氨基乙酰丙酸合酶2（ALAS2）基因突变引起并表现出X连锁遗传模式[2]。XLSA特征为骨髓中无效红细胞生成、大量的环形铁粒幼红细胞、小细胞低色素性贫血以及血清铁和铁蛋白水平升高[3]。目前，已鉴定出104种不同的ALAS2突变。本研究中，我们报道了一个新发现的ALAS2基因V110Afs*2移码突变并进行文献复习如下。

病例资料

患者，男，16岁，因“反复头昏、乏力2年”于2019年10月15日就诊我院。患者2年前开始反复出现头晕、乏力，当地医院查血常规提示小细胞低色素性贫血并予对症治疗，症状无改善，需反复输血，为求进一步诊治来我院。查体：重度贫血貌，全身皮肤黏膜无黄染及出血，浅表淋巴结未触及肿大，胸骨无压痛，心肺未见明显异常，肝脾肋缘下未触及，双下肢无水肿。既往史及家族史无特殊。血常规：WBC 5.58×10⁹/L、RBC 2.5×10¹²/L、HGB 51 g/L、平均红细胞体积（MCV）70 fl、平均血红蛋白含量（MCH）20.4 pg、平均血红蛋白浓度（MCHC）291 g/L、红细胞分布宽度（RDW）38.8％、网织红细胞绝对计数（Ret）3.3×10⁹/L、PLT 858×10⁹/L；铁蛋白：>2000 µg/L；血清铁：34.1 mmol/L；外周血涂片：无核红细胞形态大小不一，中心淡染区扩大，椭圆、泪滴、棒状、碎片等异形红细胞可见（图1A）；骨髓象：增生活跃，粒系占0.280，红系占0.675，粒红比值为0.41，红系增生活跃，以中晚幼红细胞增生为主，形态可见体积小、胞质蓝染、核固缩，淋巴细胞占4.5％，全片见巨核细胞48个，环状铁粒幼红细胞增多（69％），细胞内铁81％，细胞外铁（++），红细胞形态提示小细胞低色素，考虑环形铁粒幼细胞贫血（图1B）。骨髓活检：增生性骨髓象（红系比例增高）。流式免疫分型：粒系减低，红系比例增高，可见CD71减弱。FISH：5号、7号、8号、20号、性染色体未见异常。染色体核型：46,XY[10]。

图1. 遗传性铁粒幼细胞贫血患者外周血涂片及骨髓铁染色结果.

A：外周血涂片示无核红细胞形态大小不一，中心淡染区扩大，可见椭圆、泪滴、棒状、碎片等异形红细胞；B：骨髓铁染色可见红细胞成串排列及大量环形铁粒幼细胞

根据患者的临床表现及相关实验室检查结果，经患儿父母知情同意，采集患儿外周静脉血行基因测序，结果显示，患儿ALAS2基因第4外显子的329-332位点TCAG缺失（c.329-332delTCAG），相应的氨基酸残基110处的缬氨酸变为丙氨酸，并在112个氨基酸终止编码（p.V110Afs*2）（图2A）。在人类基因突变数据库（The Human Gene Mutation Database，HGMD）中未见相关报道。Polyphen 2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）软件预测中得分为0.00，该突变无害；SIFT（http://sift.jcvi.org）软件预测值为0.033，该突变对蛋白质功能影响不确定，然而本例患儿却有重度贫血，该变异不属于多态性位点，在人群中发生频率较低。采集其母亲外周血进行测序显示，患儿母亲为相应位点同样的杂合突变（图2B），患儿的上述变异遗传自母亲，可推断为致病性变异。结合遗传学、临床表现及病理学，综合分析诊断为XLSA。予维生素B₆（100 mg/d）口服，治疗1个月后HGB水平明显升高（HGB 76 g/L、MCV 92.5 fl、MCH 22.7 pg、MCHC 245 g/L、RDW 24.8％），目前HGB已恢复正常。

图2. 遗传性铁粒幼细胞贫血患者及其母亲ALAS2基因测序结果.

A：患者ALAS2基因第4外显子c.329-332delTCAG（p.V110Afs*2），为半合子；B：患者母亲ALAS2基因第4外显子c.329-332delTCAG（p.V110Afs*2），为杂合子

讨论及文献复习

CSA是一组极为罕见的异质性疾病，由Cooley[4]于1945年首次报道，1992年Cotter等[5]在XLSA患者中首次发现ALAS2基因突变，并揭示了XLSA的致病基因。临床上，XLSA患者通常为半合子男性，发病年龄多<40岁，初诊断为不同程度的小细胞性贫血[3]，然而，也有中年XLSA病例的报道，多诊断为铁过载[6]。但也有少数男性不会发病[7]。大多数杂合子女性没有贫血的临床表现，因为正常的ALAS2蛋白可维持必需数量的红细胞产生，已报道的少量女性病例和家族性病例，可能是偏斜的X染色体失活和后天因素影响了ALAS2正常等位基因表达[8]–[9]。目前报道的104种ALAS2突变中，尚未见V110Afs*2。本研究为首次发现XLSA家系ALAS2基因V110Afs*2突变。

在血红素生物合成途径的第一步中，线粒体基质中的甘氨酸和琥珀酰辅酶A缩合成5-氨基乙酰丙酸（ALA），此反应由ALA合成酶催化，在反应过程中吡哆醛5′-磷酸（PLP，维生素B₆）作为关键辅助因子，通过稳定琥珀酰部分的碳基和甘氨酸α-碳的相互位置，从而增强ALA合成酶的活性。随后，ALA被转运到细胞质中，参与血红素的合成[3]。Bailey等[10]报告了人类ALAS2晶体结构，ALAS突变后可引起ALAS蛋白构象发生改变，其C端延伸折叠到催化核心顶部形成loop结构，降低了对底物琥珀酰辅酶A的结合，从而影响ALA合成效率。此外，人类ALAS2与PLP采用一组高度保守的相互作用，主要涉及催化核心的中心子结构域。因此，我们推测PLP能够结合ALAS突变后形成的loop结构，抑制其进入ALAS酶活性中心顶部，由此增加ALAS酶与琥珀酰辅酶A的结合，从而增加ALA合成效率。人类ALA合成酶由ALAS2基因编码，当ALAS2基因发生功能丧失性突变时，ALAS2的酶活性降低，ALA不能有效生成，而转铁蛋白受体仍然稳定，因此摄入铁不能有效利用并积累在线粒体中。

XLSA患者的ALAS2基因突变通常是保守氨基酸的错义突变，通过改变ALAS2构象而导致功能丧失[3],[11]–[12]。在近一半的病例中，PLP治疗效果良好，从而恢复酶活性并改善小细胞低色素性贫血[10]。但仍有部分患者对吡哆醇治疗反应欠佳，ALAS2基因突变位点不同影响治疗反应：产生过早终止密码子的无义突变和使ALAS2蛋白失去稳定性的突变均会导致维生素B₆治疗无效；启动子突变导致ALAS2基因转录调控受损会导致维生素B₆疗效不佳[13]–[14]。对ALAS2基因突变的检测有助于准确诊断CSA及判断维生素B₆疗效。维生素B₆常用评价标准：①完全缓解：贫血治愈或接近治愈，HGB≥110 g/L；②部分缓解：贫血得到改善、血红蛋白水平升高>10 g/L或症状缓解；③无效：血红蛋白水平没有升高或升高≤10 g/L[15]。对于维生素B₆难治性SA患者，可进行异基因造血干细胞移植，但疗效仍不确切[16]–[17]。

迄今为止，HGMD（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）中登记的104种ALAS2突变中大多数与XLSA相关，且多位于第5～11外显子的高度保守区[6]，主要影响ALAS2的催化活性或者与PLP、甘氨酸或sCoA的结合[18]。在本病例中检测到的突变c.329-332delTCAG（p.V110Afs*2）位于第4外显子，该外显子突变的报道罕见。突变导致第110个氨基酸由甘氨酸变成丙氨酸，并在112个氨基酸终止编码。由于以前没有报道密码子110发生突变并且Val110不是已知的PLP结合位点，尚不清楚该突变如何影响PLP依赖性ALAS2活性，因此我们使用了SIFT和Polyphen-2来预测这种缺失突变的重要性，结果表明，SIFT评分为0.033，Polyphen-2评分为0。尽管预测分数较低，但V110A可能会产生功能改变的突变蛋白，从而引起XLSA发病，这种氨基酸取代的影响可能是间接的，但它可使蛋白质不稳定或影响酶催化作用[19]。患者ALAS2基因c.329-332delTCAG变异遗传来自其母亲，其母亲该位点为杂合子，符合X连锁遗传方式，为患者发病的致病性变异。患者母亲未发病，大多数女性携带者因ALAS2基因表达正常而不发病，但若出现X染色体失活，可出现X连锁疾病临床表现。由于患者采用维生素B₆治疗有效，因此我们认为该突变可能影响ALAS2与PLP的相互作用。

Funding Statement

基金项目：重庆市技术创新与发展专项面上项目（cstc2019jscx-msxmX0147）