Abstract
目的
探讨血红素氧合酶 1（heme oxygenase 1，HO-1）对 TNF-α 诱导的人退变椎间盘髓核细胞凋亡的作用及其可能的分子机制。
方法
取腰椎间盘突出症患者自愿捐赠的椎间盘组织，体外培养人退变髓核细胞并传代，取第 3 代细胞进行实验。采用细胞计数试剂盒 8 测定不同浓度（10、20、50、100 和 200 ng/mL）TNF-α 对髓核细胞活性的影响，筛选最佳刺激浓度进行下一步实验。将髓核细胞分成 4 组，分别采用单纯基础培养液（对照组）、TNF-α 刺激（TNF-α 组）、TNF-α 和 CoPP 10 μmol/L 刺激（CoPP 组）、TNF-α 和 ZnPP 15 μmol/L 刺激（ZnPP 组）培养，24 h 后采用 Hoechst 染色以及流式细胞仪检测细胞凋亡；Western blot 检测凋亡相关蛋白活化型 Caspase-3（cleaved Caspase-3）、上皮膜蛋白 1（epithelial membrane protein 1，EMP-1）以及 HO-1、p-P65 的表达。为进一步探讨 HO-1 对髓核细胞凋亡的潜在分子机制，取髓核细胞分别采用 TNF-α 刺激（TNF-α 刺激组）以及 TNF-α 和吡咯烷二硫基甲酸（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）5 μmol/L 刺激（TNF-α+PDTC 刺激组）培养 24 h，采用流式细胞仪检测髓核细胞凋亡率。
结果
经检测确定 TNF-α 最佳抑制浓度为 100 ng/mL。Hoechst 染色示，对照组和 CoPP 组凋亡细胞较少；TNF-α 组和 ZnPP 组可见凋亡样改变细胞核，其中 ZnPP 组最显著。流式细胞仪检测示，与对照组相比，TNF-α 组、CoPP 组及 ZnPP 组细胞凋亡率均显著提高（P<0.05）；与 TNF-α 组相比，CoPP 组细胞凋亡率显著降低（P<0.05），而 ZnPP 组显著提高（P<0.05）。Western blot 检测示，与对照组相比，TNF-α 组 HO-1 蛋白表达降低，cleaved Caspase-3、EMP-1 及 p-P65 蛋白表达升高（P<0.05）。与 TNF-α 组相比，CoPP 组 HO-1 蛋白表达明显升高，cleaved Caspase-3、EMP-1、p-P65 蛋白表达明显降低（P<0.05）；而 ZnPP 组 HO-1 蛋白表达明显降低（P<0.05），cleaved Caspase-3、EMP-1 蛋白表达增高（P<0.05），p-P65 蛋白表达无明显变化（P>0.05）。与 TNF-α 刺激组相比，TNF-α+PDTC 刺激组细胞凋亡率明显降低（t=3.076，P=0.031）。
结论
HO-1 能够抑制 TNF-α 诱导的人椎间盘髓核细胞凋亡，其机制可能是通过调控 NF-кB 通路得以实现。
Keywords: 血红素氧合酶 1, TNF-α, 髓核细胞, 细胞凋亡
Abstract
Objective
To investigate the effect of heme oxygenase 1 (HO-1) on the apoptosis of human degenerated nucleus pulposus (NP) cells induced by tumor necrosis factor α (TNF-α), and explore its possible molecular mechanism.
Methods
The intervertebral disc tissues were derived from patients with lumbar intervertebral disc herniation. Then, the NP cells were cultured in vitro and the third generation of NP cells were used for subsequent experiments. Cell counting kit 8 (CCK-8) method was used to observe the proliferative effect of TNF-α on the NP cells in vitro at the concentration of 10, 20, 50, 100, and 200 ng/mL. The most apropriate concentration was selected according to the result of CCK-8. The NP cells were cultured with basal medium (control group), TNF-α (TNF-α group), TNF-α and CoPP 10 μmol/L (CoPP group), and TNF-α and ZnPP 15 μmol/L (ZnPP group), respectively. After cultured, the cell poptosis was detected by Hoechst staining and flow cytometry; the expression of cleaved Caspase-3, epithelial membrane protein 1 (EMP-1), HO-1, and p-P65 proteins were detected by Western blot. In order to further explore the potential molecular mechanisms of HO-1 for cell apoptosis, the NP cells were cultured with TNF-α (TNF-α stimulated group), TNF-α and pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) 5 μmol/L (TNF-α+PDTC stimulated group), respectively. Then the cell apoptosis rate was measured by flow cytometry at 24 hours after cultured.
Results
The optimal concentration of TNF-α was 100 ng/mL. Hoechst staining showed that a few apoptotic cells could be observed in control group and CoPP group; the apoptosis-like nucleis were observed in TNF-α group and ZnPP group, which was the most significant in ZnPP group. Flow cytometry showed that the cell apoptosis rates of TNF-α group, CoPP group, and ZnPP group were significantly increased when compared with the control group (P<0.05). Compared with TNF-α group, the cell apoptosis rate in CoPP group decreased (P<0.05), while in ZnPP group it increased (P<0.05). Western blot showed that the expression of HO-1 protein in TNF-α group was decreased, and the expressions of cleaved Caspase-3, EMP-1, and p-P65 proteins were increased when compared with the control group (P<0.05). Compared with TNF-α group, the expression of HO-1 protein in CoPP group increased, and the expressions of cleaved Caspase-3, EMP-1, and p-P65 proteins were reduced (P<0.05); the expression of HO-1 protein in ZnPP group decreased (P<0.05), the expressions of cleaved Caspase-3 and EMP-1 proteins increased (P<0.05), and the expression of p-P65 protein was not significantly changed (P>0.05). Compared with TNF-α stimulated group, the cell apoptosis rate in TNF-α+PDTC stimulated group was significantly reduced (t=3.076, P=0.031).
Conclusion
HO-1 can inhibit the apoptosis of degerated NP cells induced by TNF-α, and its mechanism effect is by inhibiting the nuclear factor кB signaling pathway.
Keywords: Heme oxygenase 1, tumor necrosis factor α, nucleus pulposus cells, apoptosis
研究发现，椎间盘退变常导致脊柱结构失稳，进而导致腰背部疼痛[1-3]。因此延缓椎间盘退变可能会成为减轻患者腰背部疼痛的一种治疗方式。而氧化应激和髓核细胞过度凋亡是导致椎间盘退变的重要潜在因素，因此通过抑制椎间盘细胞的过度凋亡可能减缓椎间盘退变[4-7]。目前，关于氧化应激和细胞凋亡的基础研究主要集中在血红素氧合酶 1（heme oxygenase 1，HO-1）。HO-1 是血红素代谢的起始限速酶，正常情况下其表达水平较低，当受到重金属、热休克和内毒素等因素刺激后，表达水平会显著增加。HO-1 具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的作用，也与椎间盘退变密切相关[8-9]。本实验使用 TNF-α 诱导建立人椎间盘退变髓核细胞凋亡模型，通过将 HO-1 诱导剂钴原卟啉（CoPP）和抑制剂锌原卟啉（ZnPP）分别作用于该细胞模型，观察细胞凋亡变化情况，为进一步研究 HO-1 对椎间盘髓核细胞凋亡的作用及其机制提供思路。
1. 材料与方法
1.1. 主要试剂及仪器
Ⅱ 型胶原酶、FBS、ZnPP、CoPP（Sigma 公司，美国）；DMEM/F12 细胞培养液（HyClone 公司，美国）； Hoechst 染色试剂盒（南京凯基生物技术有限公司）；TNF-α（R&D 公司，美国）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；江苏碧云天生物技术有限公司）；兔抗人活化型 Caspase-3（cleaved Caspase-3）单克隆抗体、兔抗人上皮膜蛋白 1（epithelial membrane protein 1，EMP-1）单克隆抗体、兔抗人 HO-1 单克隆抗体、兔抗人 p-P65 单克隆抗体（CST 公司，美国）；鼠抗人 β-actin 抗体（南京钟鼎生物技术有限公司）；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（武汉博士德生物工程有限公司）；吡咯烷二硫基甲酸 （pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC；Selleck 公司，美国）。倒置相差显微镜、荧光显微镜（Nikon 公司，日本）；流式细胞仪（B&D Biosciences 公司，美国）。
1.2. 椎间盘髓核细胞分离及培养
人退变椎间盘组织均由重庆医科大学附属第一医院手术治疗的 8 例腰椎间盘突出症患者自愿捐赠，患者年龄 46～75 岁，椎间盘退变根据椎间盘影像学改良 Pfirrmann 分级标准[10]均为 Ⅲ～Ⅴ 级。标本获取通过重庆医科大学附属第一医院伦理委员会批准。
将术中摘取的髓核组织置于无菌培养皿中，放入冰盒中带回实验室。在超净工作台中用无菌 PBS 液反复清洗髓核组织，眼科剪剪碎后置于 0.25% 胰蛋白酶中处理 30 min，以离心半径 13.5 cm、1 000 r/min 离心 5 min；弃胰蛋白酶液，置于 0.2%Ⅱ 型胶原酶中处理 4 h，用 200 目滤网过滤，以离心半径 13.5 cm、1 000 r/min 离心 5 min；取细胞沉淀，加入含 20%FBS 的 DMEM/F12 培养液，于 37℃、5%CO2孵箱中培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态，待细胞融合至 70%～80% 时进行传代，取第 3 代髓核细胞进行后续实验。
1.3. TNF-α 最佳刺激浓度筛选
取髓核细胞以 0.25% 胰蛋白酶消化中和后，以离心半径 13.5 cm、1 000 r/min 离心 5 min，取细胞沉淀，加入 1 mL 含 20%FBS 的 DMEM/F12 培养液，吹打均匀后制成细胞悬液，计数后调整细胞浓度为 1×104 个/mL，接种于 96 孔板，每孔 100 μL。于 37℃、5%CO2 培养箱培养 24 h 待细胞贴壁后分别给予不同浓度（10、20、50、100、200 ng/mL）TNF-α 溶液刺激细胞，各组 3 个复孔；以等体积培养基培养髓核细胞作为阴性对照组，仅有培养基无细胞作为空白对照组。培养 24 h 后采用 CCK-8 法检测细胞活性，每孔加入 CCK-8，2 h 后测定吸光度（A）值。根据检测结果选择对细胞增殖活性抑制最显著的浓度，作为 TNF-α 最佳刺激浓度进行后续实验。
1.4. HO-1 对椎间盘髓核细胞凋亡的影响
1.4.1. 实验分组
实验分为 4 组，分别为基础培养液组（对照组）、TNF-α 刺激组（TNF-α 组）、TNF-α 和 CoPP 10 μmol/L 刺激组（CoPP 组）、TNF-α 和 ZnPP 15 μmol/L 刺激组（ZnPP 组）。
1.4.2. Hoechst 染色观察髓核细胞凋亡
取髓核细胞同上法消化离心后制成细胞悬液，按 6×104 个/孔细胞接种于 24 孔板，待细胞融合至 70%～80% 后，按照分组分别给予不同试剂培养。培养 24 h 后，避光条件下弃培养液，加入 Hoechst 33258，置于 37℃ 孵箱中 10 min，清洗后封片，荧光显微镜下观察，细胞核呈亮蓝色为凋亡细胞。
1.4.3. 流式细胞术检测髓核细胞凋亡
取髓核细胞同上法消化离心后制成细胞悬液，按 1×105个/孔接种于 6 孔板，待细胞融合至 70%～80% 后，按照分组分别给予不同试剂培养。培养 24 h 后，收集培养液至 10 mL 离心管，无菌 PBS 液反复洗涤培养孔后，用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化髓核细胞，与收集的培养液一并以离心半径 13.5 cm、1 000 r/min 离心 5 min，收集细胞沉淀，PBS 液清洗，流式细胞仪检测髓核细胞凋亡率。
1.4.4. Western blot 检测髓核细胞凋亡相关蛋白及 HO-1 的表达
取髓核细胞同上法消化离心后制成细胞悬液，按 2.5×105个/瓶接种于培养瓶中，按照分组方法分别给予不同试剂培养。培养 24 h 后，弃培养液，用预冷 PBS 液反复洗涤，加入细胞裂解液，置于冰上裂解 30 min，细胞刮收集碎裂细胞及蛋白，以离心半径 13.5 cm、12 000 r/min 离心 15 min，收集细胞总蛋白，用 BCA 法测定其蛋白浓度。按照 5∶1 比例加入上样缓冲液，煮沸 10 min 变性。各组平衡蛋白量上样后，在 12%SDS-PAGE 电泳上进行蛋白分离，再电转至 0.45 μm 聚偏氟乙烯膜上。常温下用 50 g/L 脱脂牛奶对膜封闭 2 h，用 TBST 洗涤 3 次。以 β-actin 作为内参，分别加入下述相应单克隆抗体（1∶1 000），兔抗人 cleaved Caspase-3、EMP-1、HO-1、p-P65 抗体和鼠抗人 β-actin 抗体，4℃ 过夜孵育。加入 1∶5 000 稀释的二抗室温下孵育 2 h，暗室显影，发光，应用凝胶图像分析软件分析各目标条带灰度值，计算目的蛋白与 β-actin 的比值作为其相对表达量。
1.5. HO-1 影响髓核细胞凋亡的分子机制
实验分为 2 组，分别为 TNF-α 刺激组以及 TNF-α 100 ng/mL 和 PDTC 5 μmol/L 刺激组（TNF-α+PDTC 刺激组）。取髓核细胞同上法消化离心后制成细胞悬液，按 1×105 个/孔接种于 6 孔板，待细胞融合至 70%～80% 后，按照分组分别给予不同试剂培养 24 h 后，同 1.4.3 方法采用流式细胞仪检测髓核细胞凋亡率。
1.6. 统计学方法
采用 SPSS18.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；两组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2. 结果
2.1. 髓核细胞形态学观察
倒置相差显微镜下观察示，原代髓核细胞为圆形小光点漂浮在培养液中；培养 5 d 后髓核细胞开始贴壁，细胞形态较小，呈短梭形或多角形；10 d 后细胞质开始向外伸展，细胞变成长梭形；培养 2 周左右细胞融合率约为 80%，呈不规则梭形或火焰状细胞团聚集。见图 1。传代后细胞形态呈不规则梭形，但无火焰状团聚现象。
图 1.
Morphological observation of primary degenerated NP cells (×200)
原代髓核细胞形态学观察（×200）
a. 培养 5 d；b. 培养 15 d
a. After cultured for 5 days; b. After cultured for 15 days
2.2. TNF-α 最佳刺激浓度筛选
各浓度 TNF-α 培养 24 h 后，髓核细胞增殖活性均被抑制，CCK-8 法检测阴性对照组、10、20、50、100 和 200 ng/mL 组 A 值分别为 94.43%±4.35%、94.47%±1.98%、83.00%±4.11%、75.33%±4.73%、52.73%±2.55%、47.67%±4.23%，其中仅 100、200 ng/mL 组与阴性对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），且 100、200 ng/mL 组间比较差异无统计学意义（P>0.05），故确定 TNF-α 最佳抑制浓度为 100 ng/mL 进行后续实验。
2.3. HO-1 对椎间盘髓核细胞凋亡的影响
2.3.1. Hoechst 染色观察髓核细胞凋亡
荧光显微镜下观察示，对照组和 CoPP 组细胞核呈较均匀的蓝色荧光，凋亡细胞较少；而 TNF-α 组和 ZnPP 组可见凋亡样改变细胞核，表现为亮蓝色，出现核碎裂，荧光强度较对照组明显增强，同时 ZnPP 组出现凋亡像的细胞多于 TNF-α 组。见图 2。
图 2.
Hoechst staining observation of cell apoptosis in each group (Fluorescence microscope×200)
Hoechst 染色观察各组髓核细胞凋亡（荧光显微镜×200）
a. 对照组；b. TNF-α 组；c. CoPP 组；d. ZnPP 组
a. Control group; b. TNF-α group; c. CoPP group; d. ZnPP group
2.3.2. 流式细胞术检测髓核细胞凋亡
对照组、TNF-α 组、CoPP 组、ZnPP 组细胞凋亡率分别为 7.38%±0.78%、19.08%±0.98%、13.53%±1.19%、29.29%±0.90%。与对照组相比，TNF-α 组、CoPP 组及 ZnPP 组细胞凋亡率均显著提高（P<0.05）；与 TNF-α 组相比，CoPP 组细胞凋亡率显著降低（P<0.05），ZnPP 组细胞凋亡率显著提高（P<0.05）。见图 3。
图 3.
Cell apoptosis detection in each group by flow cytometry a. Control group; b. TNF-α group; c. CoPP group; d. ZnPP group
流式细胞仪检测各组细胞凋亡
a. 对照组；b. TNF-α 组；c. CoPP 组；d. ZnPP 组
2.3.3. Western blot 检测髓核细胞凋亡相关蛋白及HO-1的表达
与对照组相比，TNF-α 组 HO-1 蛋白表达降低，凋亡蛋白 cleaved Caspase-3 及 EMP-1 表达升高（P<0.05）。与 TNF-α 组相比，CoPP 组 HO-1 蛋白表达明显升高，凋亡蛋白 cleaved Caspase-3 及 EMP-1 表达明显降低（P<0.05）；而 ZnPP 组 HO-1 蛋白表达明显降低，凋亡蛋白 cleaved Caspase-3 及 EMP-1 表达明显升高（P<0.05）。见图 4。
图 4.
Expressions of cleaved Caspase-3, EMP-1, and HO-1 proteins by Western blot
Western blot 检测髓核细胞凋亡相关蛋白及 HO-1 的表达
a. 蛋白条带图 1：对照组 2：TNF-α 组 3：CoPP 组 4：ZnPP 组；b. 各蛋白相对表达量
a. Protein stripe diagram 1: Control group 2: TNF-α group 3: CoPP group 4: ZnPP group; b. Relative expressions of proteins
同时，与对照组相比，TNF-α 组 p-P65 蛋白表达升高（P<0.05）。与 TNF-α 组相比，CoPP 组 p-P65 蛋白表达明显降低（P<0.05）；而 ZnPP 组 p-P65 蛋白表达无明显变化，比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 5。
图 5.
Expression of p-P65 protein by Western blot
Western blot 检测髓核细胞 p-P65 蛋白表达
a. 蛋白条带图 1：对照组 2：TNF-α 组 3：CoPP 组 4：ZnPP 组；b. p-P65 蛋白相对表达量
a. Protein stripe diagram 1: Control group 2: TNF-α group 3: CoPP group 4: ZnPP group; b. Relative expression of p-P65 protein
2.4. 应用 PDTC 对髓核细胞凋亡率的影响
TNF-α 刺激组细胞凋亡率为 20.33%±1.24%，TNF-α+PDTC 刺激组为 11.51%±0.72%，较 TNF-α 刺激组明显降低，比较差异有统计学意义（t=3.076，P=0.031）。见图 6。
图 6.
Cells apoptosis rate after PDTC treatment by flow cytometry
流式细胞仪检测 PDTC 对髓核细胞凋亡的影响
a. TNF-α 刺激组；b. TNF-α+PDTC 刺激组
a. TNF-α stimulated group; b. TNF-α+PDTC stimulated group
3. 讨论
TNF-α 是人体中主要的促炎性因子，不仅能促使髓核细胞发生凋亡，而且还能抑制髓核细胞外基质的表达，在椎间盘退变病理过程中发挥重要作用，因此本实验使用 TNF-α 刺激髓核细胞建立椎间盘髓核细胞凋亡模型。CCK-8 法检测结果显示，TNF-α 浓度为 100、200 ng/mL 时，髓核细胞活性受到明显抑制，但是 100、200 ng/mL 浓度对髓核细胞活性抑制效果无明显差异，因此选择 TNF-α 最佳抑制浓度为 100 ng/mL 进行后续实验。
HO-1 是生物体内催化血红素分解的关键酶，在抗炎、抗氧化及抗凋亡等方面具有重要作用，在高血压、糖尿病及肾炎等疾病的发生发展中起一定防护作用[11-12]。Hu 等[9]研究表明，HO-1 能够减缓由 IL-1β 诱导的人椎间盘髓核细胞退变，表明 HO-1 与椎间盘退变有一定关系。但是 HO-1 减缓椎间盘退变的具体机制以及是否与髓核细胞的凋亡相关尚需明确。谷颖等[13]发现通过促进 HO-1 表达，能在一定程度上抑制大鼠心肌细胞凋亡；随着椎间盘退变程度增加，髓核组织的 HO-1 表达水平反而降低[9]，髓核组织凋亡蛋白的表达水平也随之增加[14]。因此，我们认为 HO-1 在椎间盘细胞凋亡中发挥一定作用。
EMP-1 最初是在脑部肿瘤中发现，被称为脑肿瘤相关性膜蛋白[15]。研究表明在 EMP-1 高表达的椎间盘中，椎间盘细胞凋亡水平增高，从而导致椎间盘退变[16-17]。本研究采用 CoPP 作为 HO-1 诱导剂，以提高 HO-1 蛋白表达水平。检测结果显示，与 TNF-α 组比较，CoPP 组髓核细胞凋亡率以及凋亡相关蛋白 cleaved Caspase-3、EMP-1 的表达水平降低；而 ZnPP 作为 HO-1 抑制剂使 HO-1 表达降低，但是与 TNF-α 组比较，ZnPP 组髓核细胞凋亡率以及凋亡相关蛋白 cleaved Caspase-3、EMP-1 的表达水平提高。表明 HO-1 能够抑制 TNF-α 诱导的髓核细胞凋亡，从而可减缓椎间盘的退变。
NF-κB 是一种重要的核转录因子，其对细胞损伤、应激、凋亡和炎性反应的调控发挥着重要作用[18-19]。已有证据表明 NF-κB 通路与椎间盘退变过程密切相关[20]，同时 HO-1 可能通过 NF-κB 通路抑制肠毒素刺激的肠上皮细胞的凋亡[21]。但是缺少髓核细胞中 HO-1 与 NF-κB 通路关系的相关研究报道。我们检测发现 TNF-α 组细胞内 p-P65 蛋白表达较对照组升高，而 CoPP 组与 TNF-α 组相比明显下降。同时进一步给予 NF-кB 抑制剂 PDTC 处理髓核细胞后，发现细胞凋亡率显著下降。因此，HO-1 抑制 TNF-α 诱导的髓核细胞凋亡，其机制可能是通过调控 NF-кB 通路得以实现。
综上述，HO-1 对椎间盘髓核细胞有一定保护作用，能够抑制 TNF-α 诱导的椎间盘髓核细胞凋亡水平，其主要机制可能是对 NF-кB 通路的调控，为防治椎间盘细胞的凋亡提供了新思路。但是本研究也存在不足之处：实验中缺乏单纯 HO-1 诱导剂和抑制剂对照组，对 NF-κB 通路的研究不够深入，以及 HO-1 是如何调控 NF-κB 的上下信号通路方面也需要进一步研究。
Funding Statement
国家自然科学基金面上项目（81372003）
National Natural Science Foundation of China (81372003)
References
- 1.Maidhof R, Alipui DO, Rafiuddin A, et al Emerging trends in biological therapy for intervertebral disc degeneration. Discov Med. 2012;14(79):401–411. [PubMed] [Google Scholar]
- 2.Xu HG, Li ZR, Wang H, et al. Intermittent cyclic mechanical tension-induced down-regulation of ectonucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase 1 gene expression is mainly dependent on TGF-β1 in end-plate chondrocytes. Orthop Surg, 2013, 5(1): 40-45.
- 3.Wang XH, Zhu L, Hong X, et al Resveratrol attenuated TNF-α-induced MMP-3 expression in human nucleus pulposus cells by activating autophagy via AMPK/SIRT1 signaling pathway. Exp Biol Med (Maywood) 2016;241(8):848–853. doi: 10.1177/1535370216637940. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 4.Jiang W, Zhang X, Hao J, et al SIRT1 protects against apoptosis by promoting autophagy in degenerative human disc nucleus pulposus cells. Sci Rep. 2014;4:7456. doi: 10.1038/srep07456. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.Miyazaki S, Kakutani K, Yurube T, et al Recombinant human SIRT1 protects against nutrient deprivation-induced mitochondrial apoptosis through autophagy induction in human intervertebral disc nucleus pulposus cells. Arthritis Research & Therapy. 2015;17:253. doi: 10.1186/s13075-015-0763-6. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 6.Kim KW, Ha KY, Lee JS, et al The apoptotic effects of oxidative stress and antiapoptotic effects of caspase inhibitors on rat notochordal cells. Spine (Phila Pa 1976) 2007;32(22):2443–2448. doi: 10.1097/BRS.0b013e318157395a. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 7.Poveda L, Hottiger M, Boos N, et al Peroxynitrite induces gene expression in intervertebral disc cells. Spine (Phila Pa 1976) 2009;34(11):1127–1133. doi: 10.1097/BRS.0b013e31819f2330. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 8.Planavila A, Rodríguez-Calvo R, Palomer X, et al Atorvastatin inhibits GSK-3beta phosphorylation by cardiac hypertrophic stimuli. Biochim Biophys Acta. 2008;1781(1-2):26–35. doi: 10.1016/j.bbalip.2007.10.009. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 9.Hu B, Shi C, Xu C, et al Heme oxygenase-1 attenuates IL-1β induced alteration of anabolic and catabolic activities in intervertebral disc degeneration. Sci Rep. 2016;6:21190. doi: 10.1038/srep21190. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 10.Pfirrmann CW, Metzdorf A, Zanetti M, et al Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine (Phila Pa 1976) 2001;26(17):1873–1878. doi: 10.1097/00007632-200109010-00011. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.Choi BM, Lim DW, Lee JA, et al Luteolin suppresses cisplatin induced apoptosis in auditory cells: possible mediation through induction of heme oxygenase-1 expression. J Med Food. 2008;11(2):230–236. doi: 10.1089/jmf.2007.591. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 12.Wu BJ, Chen K, Barter PJ, et al Niacin inhibits vascular inflammation via the induction of heme oxygenase-1. Circulation. 2012;125(1):150–158. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.111.053108. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 13.谷颖, 王爱红, 屈福超, 等 HO-1 对 AngⅡ诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的作用. 山东大学学报: 英文版. 2013;51(6):1–4. [Google Scholar]
- 14.梁鹤, 董双海, 夏天, 等 NF-κB 信号通路的激活与椎间盘退变的的关系. 中国矫形外科杂志. 2015;23(5):458–462. [Google Scholar]
- 15.Marvin KW, Fujimoto W, Jetten AM Identification and characterization of a novel squamous cell-associated gene related to PMP22. J Biol Chem. 1995;270(48):28910–28916. doi: 10.1074/jbc.270.48.28910. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 16.胡明, 张传森, 陈道运, 等 人退变椎间盘组织基因表达谱. 解剖学杂志. 2004;27(4):348–351. [Google Scholar]
- 17.Hu M, Ma YZ, Feng HC, et al Analysis of Gene Expression Pattern of Lumbar Intervertebral Disc Degeneration in Human. 中国康复理论与实践. 2006;12(5):420–422. [Google Scholar]
- 18.孙中仪, 田纪伟 NF-κB 信号通路与椎间盘退变的研究进展. 中国矫形外科杂志. 2012;20(23):2162–2164. [Google Scholar]
- 19.Lee H, Jeon J, Ryu YS, et al Disruption of microtubules sensitizes the DNA damage-induced apoptosis through inhibiting nuclear factor κB (NF-κB) DNA-binding activity. J Korean Med Sci. 2010;25(11):1574–1581. doi: 10.3346/jkms.2010.25.11.1574. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 20.孔敬波, 马信龙, 王涛, 等 Wnt/β-catenin 及 NF-кB 信号通路与椎间盘退变的研究进展. 中国修复重建外科杂志. 2013;27(12):1523–1528. [PubMed] [Google Scholar]
- 21.Ko SH, Rho da J, Jeon JI, et al Bacteroides fragilis Enterotoxin Upregulates Heme Oxygenase-1 in Intestinal Epithelial Cells via a Mitogen-Activated Protein Kinase- and NF-κB-Dependent Pathway, Leading to Modulation of Apoptosis. Infect Immun. 2016;84(9):2541–2554. doi: 10.1128/IAI.00191-16. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]