新型前置式脂肪抽吸针对移植脂肪成活影响的实验研究

Abstract

Objective

To investigate the effect of a new front opening liposuction cannula on the survival of transplanted fat tissue.

Methods

Two groups of fats were obtained from the left and right sides of a female patient during the abdomen liposuction surgery, respectively. And the fats in experimental group and control group were harvested by the new front opening liposuction cannula and the side hole liposuction cannula, respectively. The differences of adipocyte activity in vitro between 2 groups were compared by observation under the electron scanning microscopy and the glucose transportation test. Then, the fats in 2 groups (n=20) were injected subcutaneously into the back of 20 nude mice (400 mg fats per injection zone). The differences of the injection area reactions, remaining weight, histological characteristics, and microvessel density (MVD) between 2 groups were compared after 4 weeks and 12 weeks.

Results

Compared with the control group, in vitro, the adipocytes were more plump and the vascular structures were more abundant. The glucose transportation quantities were (3.049±0.266) mmol/L and (2.668±0.250) mmol/L in experimental and control groups, showing significant difference between groups (t=2.956, P=0.010). There was only one fat liquefaction occurred in the injection zone of the control group after 4 weeks. The experimental group had more clear adipocytes, more vessels, and less inflammation and necrosis than the control group. The remaining weight and MVD were higher in the experimental group than in the control group after 4 and 12 weeks, showing significant differences (P<0.05).

Conclusion

The new front opening liposuction cannula can reduce the damage of adipocytes and improve the survival of transplanted fat tissue.

随着脂肪抽吸术的发展，自体脂肪移植已广泛用于治疗瘢痕、面部凹陷畸形、乳房重建等^[1-3]。作为一种常用的软组织填充材料，自体脂肪具有来源丰富、取材便捷、操作简便，以及良好生物相容性、无排斥反应、充盈效果显著等优点^[4]。然而，因脂肪不耐受缺氧和缺血状态，移植术后可能发生受体区域脂肪吸收、移植后成活率低、远期效果不稳定以及需多次移植等问题^[5-7]。此外，异常脂肪细胞坏死和炎性反应还可能导致其他并发症，如囊肿、钙化或不良美容效果^[8-9]。因此，如何提高移植脂肪成活率是当前研究热点。临床实践提示“无损伤”或“微创”抽吸脂肪对保证移植脂肪成活具有重要意义^[10]。目前临床采用的脂肪抽吸针主要为多个侧孔设计，在负压吸引动力作用下直接将脂肪从组织上拉扯下来，对脂肪细胞造成较大损伤。针对该问题，陆军军医大学第一附属医院整形外科王珍祥教授团队设计了新型前置式脂肪抽吸针（专利号：ZL201310190004.6）。本次研究拟观察采用该新型前置式脂肪抽吸针吸脂对自体脂肪移植后脂肪成活及血管再生的影响，探讨促进脂肪成活、改善美容效果的新方法。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及主要试剂、仪器

6～8 周龄雌性裸鼠 20 只，平均体质量 20 g，由广州军区广州总医院动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

DMEM 培养基［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；葡萄糖检测试剂盒（重庆源于启生物科技有限公司）；CD31（Abcam 公司，美国）；免疫组织化学二抗试剂盒（含山羊封闭血清、辣根过氧化物酶、山羊抗兔二抗）、DAB 显色液、EDTA（北京中杉金桥生物技术有限公司）。96 孔细胞培养板（Corning 公司，美国）；恒温恒湿 CO₂ 培养箱（Thermo Forma 公司，美国）；高速冷冻离心机（Hitachi 公司，日本）；采图显微镜（Olympus 公司，日本）；电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］。

1.2. 实验分组及方法

实验用脂肪组织由 1 例于陆军军医大学第一附属医院整形外科行腹部脂肪抽吸术的成年女性患者自愿捐赠。于站立位标记腹部吸脂部位，采用新型前置式脂肪抽吸针通过脐下切口抽取左侧腹部脂肪（实验组），传统侧孔脂肪抽吸针抽取右侧腹部脂肪（对照组）。具体操作步骤：常规消毒铺巾后，用 11 号刀片在脐下作长约 3 mm 切口，脂肪抽吸针可以插入即可；注射与抽取脂肪体积相等的肿胀液（按照 1 000 mL 生理盐水含肾上腺素 1∶10 万 U 及 20 mL 2% 利多卡因进行配制）。将直径 3.0 mm 的新型前置式与传统侧孔脂肪抽吸针分别与 20 mL 注射器连接，手动低压快速抽取脂肪。脂肪抽吸物收集于 60 mL 注射器中，静置 30 min 后去除下层液体，两组各获得脂肪 60 mL。见图 1。

图 1.

Two kinds of liposuction cannulas

两种脂肪抽吸针

a. 新型前置式脂肪抽吸针；b. 传统侧孔脂肪抽吸针

a. New front opening liposuction cannula; b. Side hole liposuction cannula

1.3. 体外观察

1.3.1. 扫描电镜观察

两组脂肪置于 4% 戊二醛固定，4℃ 冰箱保存。1 d 后取出标本，0.9% 氯化钠溶液清洗 2 次，每隔 5 min 1 次；以 50%、70%、90% 乙醇脱水各 1 次；100% 乙醇脱水 2 次，每隔 5～7 min 1 次；以 50%、70%、90% 叔丁醇各进行 1 次置换；100% 叔丁醇进行 2 次置换，每隔 5～7 min 1 次。锇酸染色后，扫描电镜下观察两组脂肪形态。

1.3.2. 葡萄糖转移实验

取两组脂肪各 40 mL，分别注入 8 个无菌培养皿中，每皿 5 mL，每个培养皿中加 1 U 胰岛素、10 mL 含糖无血清 DMEM。置于 37℃、5% CO₂ 恒温培养箱孵育 l h，移液管抽取下层清液，采用葡萄糖检测试剂盒于生化分析仪中测定葡萄糖浓度。同时设不含脂肪、仅含胰岛素和含糖无血清 DMEM 的空白对照组，以空白对照组葡萄糖浓度作为基础浓度，计算实验组及对照组葡萄糖浓度与基础浓度差值，即为脂肪细胞葡萄糖转移量。

1.4. 体内实验观察

1.4.1. 脂肪注射方法

于 20 只裸鼠背部左、右侧随机取 1 个区域为注射点，两点相隔 3 cm。采用 22G 针头分别注射 0.5 mL（400 mg）实验组或对照组抽取的脂肪颗粒以及生理盐水 200 μL，至裸鼠皮下。注射后 4、12 周，各取 10 只裸鼠进行观测。

1.4.2. 观测指标

① 大体观察：注射后观察裸鼠注射区情况，有无皮肤破溃、红肿等异常现象发生。注射后 4、12 周，取出移植物观察包膜是否完整，有无囊肿、脂肪液化等；采用电子天平测量其质量，即为移植物残留质量。② 组织学观察：大体观察后将两组移植物置于 10% 甲醛固定 24 h，石蜡包埋后切片。取部分切片，常规 HE 染色，光镜下观察观察两组脂肪组织学结构差异。③ CD31 免疫组织化学染色：取两组部分切片，行 CD31 免疫组织化学染色，光镜下观察脂肪组织间血管，棕黄色染色为阳性表达。于低倍镜下寻找染色血管密度最高区域，然后改为高倍镜下随机取 3 个视野计数微血管，取均值作为微血管密度（microvessel density，MVD）。

1.5. 统计学方法

采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. 体外观察

2.1.1. 扫描电镜观察

两组获得的脂肪均保留了脂肪组织基本结构，成熟的脂肪细胞之间保持正常粘连，且脂肪细胞均有不同程度的挤压变形，但实验组脂肪细胞较对照组更饱满、均一。与对照组相比，实验组脂肪血管结构更丰富，尤其是大血管结构。见图 2。

图 2.

Scanning electron microscope observation of 2 groups (×300)

两组扫描电镜观察（×300）

a、b：实验组；c、d. 对照组

a, b. Experimental group; c, d. Control group

2.1.2. 葡萄糖转移实验

实验组葡萄糖转移量为（3.049±0.266）mmol/L，明显高于对照组的（2.668±0.250）mmol/L，比较差异有统计学意义（t=2.956，P=0.010）。

2.2. 体内实验

2.2.1. 大体观察

对照组 1 处注射区 4 周时发生脂肪液化，其余裸鼠注射区无血肿、破溃、钙化等。两组移植物均呈椭圆球形、圆球形，血管钳剥离包膜、取出移植物容易。见图 3。注射后 4、12 周，实验组移植物残留质量分别为（0.309±0.031）、（0.192±0.015）g，高于对照组的（0.277±0.033）、（0.171±0.009）g，比较差异有统计学意义（t=2.248，P=0.037；t=3.695，P=0.002）。

图 3.

General observation of 2 groups

两组大体观察

左侧为实验组，右侧为对照组　a. 注射后 4 周；b. 注射后 12 周

Left for experimental group, right for control group　a. At 4 weeks after transplantation; b. At 12 weeks after transplantation

2.2.2. 组织学观察

注射后 4 周时，实验组脂肪细胞多且形态良好，呈圆形、椭圆形或多边形，未见明显坏死迹象，血管丰富清晰；对照组脂肪细胞较实验组减少，可见新生血管，但存在纤维化和坏死迹象。见图 4a、b。

图 4.

Histological observation of 2 groups (HE×200)

两组组织学观察（HE×200）

a. 实验组 4 周；b. 对照组 4 周；c. 实验组 12 周；d. 对照组 12 周

a. Experimental group after 4 weeks; b. Control group after 4 weeks; c. Experimental group after 12 weeks; d. Control group after 12 weeks

12 周时，实验组脂肪细胞形态基本清晰完整，未见明显坏死迹象，可见纤维化改变，血管较丰富；对照组脂肪细胞仍少于实验组，且细胞形态较模糊，存在轻度炎性反应，可见纤维间隙，新生血管较少。见图 4c、d。

2.2.3. 免疫组织化学染色

镜下观察，注射后 4、12 周实验组脂肪组织微血管均较对照组明显增多；同一组内 12 周时微血管较 4 周时增多。见图 5。注射后 4 周，实验组及对照组 MVD 分别为 6.767±0.943、5.133±0.613；12 周时分别为 8.03±0.936、6.57±0.969，比较差异均有统计学意义（t=4.592，P=0.000；t=3.433，P=0.003）。

图 5.

CD31 immunohistochemistry observation of 2 groups (×200)

两组 CD31 免疫组织化学染色观察（×200）

a. 实验组 4 周；b. 对照组 4 周；c. 实验组 12 周；d. 对照组 12 周

a. Experimental group after 4 weeks; b. Control group after 4 weeks; c. Experimental group after 12 weeks; d. Control group after 12 weeks

3. 讨论

脂肪抽吸术获得的脂肪颗粒内，最有可能成活的脂肪细胞位于接近小叶表面的位置。在血液供应重新建立之前，脂肪颗粒成活很大程度上依靠简单的营养扩散^[8]。因此，脂肪颗粒大小可能影响移植脂肪的成活量。但 Del Vecchio 等^[11]认为较小的脂肪颗粒可能缺乏基质成分（如成纤维细胞、血管和连接组织），用于脂肪细胞和增殖干细胞的结构支持。基于此，我们设计了新型前置式抽脂针，其吸孔位于顶端，抽吸脂肪时在低负压下直接前推抽脂针，可获取条索或线状组织，携带了更多的细胞外基质，保持组织结构基本无破坏，理论上更有利于移植术后脂肪的成活。

新型前置式脂肪抽吸针采用前置式吸口，头部为蛇头直孔，直径逐渐变小，内壁逐渐变薄，末端为平面，出口径为 3 mm，吸入吸脂针内的脂肪颗粒由粗管腔内逐渐向细管腔方向流动，明显改善受阻可能性，减少堵塞现象。前置吸口阻力小，内壁更光滑，摩擦力低，减少了组织撕裂，使完整细胞数比例更高。

为避免个体差异对实验结果的影响，本实验选择同一患者左、右侧腹部脂肪进行对比研究。同时，由同一术者完成抽脂操作，以减少抽脂速度对结果的影响。抽脂过程中，我们使用 20 mL 注射器产生负压，主要考虑以下两方面原因：一方面，低负压有利于增强自体脂肪移植活力^[12-13]。相比吸力强大的吸脂机，注射器抽脂吸力柔和，对脂肪细胞损伤小。另一方面，利用注射器抽拉产生负压吸脂时，压力过小无法获取脂肪颗粒，压力过大脂肪细胞破坏增加。文献报道，注射器容量小于 20 mL 时，其产生的负压随抽拉容量增加而明显增加；而注射器抽拉容量大于 30 mL 时，负压不再随抽拉容量的增加而明显增加^[14]。同时结合临床使用习惯，我们最终选择 20 mL 注射器进行脂肪抽吸。

本实验中，我们采用扫描电镜观察两组脂肪颗粒的组织形态。既往研究多将抽取的脂肪颗粒用石蜡包埋制成切片，HE 染色后在光镜下观察细胞膜是否完整，以此判断脂肪颗粒的活性^{[13, 15]}。但实际操作中我们发现，抽取的脂肪颗粒体积较小，多悬浮于固定液中不成团，石蜡包埋后难以切片，所以选择对脂肪颗粒脱水染色后扫描电镜下脂肪细胞形态。扫描电镜下观察显示，与对照组相比，实验组脂肪细胞形态更完整、血管更丰富，提示前置式脂肪抽吸针在取脂过程中对脂肪的机械损伤更小。

葡萄糖转移实验原理为活脂肪细胞将细胞外的葡萄糖转运到细胞内，根据细胞外葡萄糖浓度降低程度来判断脂肪细胞的活性^[16]，可以反映脂肪细胞最原始活性状态，可重复性好。本实验中，实验组葡萄糖转移量较对照组显著提高，说明通过前置式脂肪抽吸针获得的脂肪细胞活性更高。

将两组脂肪颗粒注射至裸鼠皮下后，4、12 周时实验组移植物残留质量以及组织学观察结果均提示，其脂肪细胞成活情况明显优于对照组。另外，对照组 4 周时 1 处注射区发生脂肪液化。进一步表明传统侧孔负压抽脂法对脂肪颗粒损伤更大，难以保证术后移植物的质量及形状，进而影响了远期效果。

移植后脂肪颗粒成活的首要条件是建立血供^[17]，主要通过外周血管长入或与原脂肪颗粒中的毛细血管对接来完成。因此，移植后脂肪细胞成活及脂肪颗粒活性与微血管的形成存在密切相关性。活性好的脂肪颗粒其血管也较密集，提示活性越高越有利于血管形成，而血管的形成又可促进移植后脂肪的成活。本实验中，实验组 MVD 显著高于对照组，差异有统计学意义，说明前置式脂肪抽吸针对脂肪颗粒的损伤较小。

综上述，新型前置式脂肪抽吸针与传统侧孔抽脂针相比，更有利于移植脂肪成活。但本研究仅抽取 1 例患者样本进行观察，样本量有限，有待纳入更多样本进行观测。另外，在实际操作中我们发现，新型前置式脂肪抽吸针获得的脂肪多成条索状或微团块状，较传统侧孔抽脂针获取的脂肪颗粒大，为避免注射时堵塞注射针，需要在脂肪移植前将过大的脂肪组织挑出或剪碎，延长了操作时间。相比而言传统侧孔脂肪抽吸针操作操作更简便。故新型前置式脂肪抽吸针的优势有待进一步研究探讨。

Funding Statement

重庆市应用开发课题（CSTC2014yykfA110015）；国家自然科学基金面上项目（816719241010140）；广东省省级科技计划项目（2014B020212010）

Application Development Project of Chongqing (CSTC2014yykfA110015); General Program of National Natural Science Foundation of China (816719241010140); Foundation for Science & Technology Research Project of Guangdong Province (2014B020212010)