MTHFR基因多态性与儿童支气管哮喘易感性及糖皮质激素疗效的相关性

Abstract

Objective

To study the association of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene polymorphism with susceptibility to bronchial asthma and glucocorticoid (GC) efficacy in children.

Methods

A total of 173 children with bronchial asthma who were hospitalized between June 2018 and December 2020 were selected as the observation group. The children received aerosol inhalation of GC for three consecutive months. A total of 178 healthy children who underwent physical examination during the same period were selected as the control group. PCR was used to detect the genotypes of the MTHFR C677T for the two groups. The differences in genotype distribution between the two groups were analyzed. Children with different genotypes in the observation group were compared in terms of immunoglobulin E (IgE), interleukin-8 (IL-8), leukotriene B4 (LTB4), lung function, and clinical outcome before and after treatment.

Results

TT genotype and T allele were significantly more frequent in the observation group than in the control group (P<0.001). TT/CT genotypes and T allele were independent risk factors for bronchial asthma (OR=6.615 and 7.055 respectively; P<0.001). After GC treatment, the children with CC, CT or TT genotypes experienced significantly decreased levels of IgE, IL-8, and LTB4 and significantly increased forced expiratory volume in 1 second (FEV1), forced vital capacity (FVC), and FEV1/FVC ratio (P<0.001). The children with TT genotype showed significantly lower levels of IL-8 and LTB4 than those with CC genotype, a significantly lower level of LTB4 than those with CT genotype, significantly higher FVC than those with CT genotype, and a significantly higher FEV1/FVC ratio than those with CC genotype (P<0.05). The children with TT genotype had better GC efficacy compared with those with CC genotype (P<0.05). TT genotype was an independent factor for good GC efficacy (OR=2.111, P=0.018).

Conclusions

MTHFR gene polymorphism is associated with asthma susceptibility and GC efficacy in children. Children carrying TT/CT genotypes have a higher risk of developing asthma, and those with TT genotype are more sensitive to GC treatment.

支气管哮喘是一种以呼吸道变应性和非特异性高反应为特征的慢性炎症性疾病，发病具有多样性和多变性，在儿童中发病率较高。近年来随着环境质量的降低，我国多个地区流行病学调查显示其发病率从2010年的3.02%左右上升至4%以上，甚至某些地区接近发达国家水平（9.36%~12.39%），严重威胁患儿身心健康^［1-2］。目前，临床主要采用控制性治疗和缓解性治疗两种方式，其中糖皮质激素（glucocorticoid，GC）是主要的长期控制药物。临床调查显示GC疗效存在明显的个体差异性^［3］，其原因除了患儿耐药性差异外还可能与患儿体内GC受体异常表达或相关调控基因的多态性有关^［4-5］。亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是叶酸代谢过程中的一种关键酶，有研究报道MTHFR不同基因型的酶活性存在显著差异性^［6］，因而与致病性有关。早期有研究发现MTHFR基因C667T位点突变可能是儿童哮喘发生的独立影响因素^［7］，但由于哮喘的发生受地域、环境等多种因素影响，目前尚缺乏大量研究支持该论点。另有研究报道MTHFR基因多态性与甲氨蝶呤、来氟米特等药物疗效有关^［8］，但与GC治疗疗效是否有关，是否会影响GC治疗儿童哮喘的疗效尚未可知。本研究拟通过检测和比较支气管哮喘患儿与健康儿童MTHFR基因C667T位点的基因型和等位基因频率分布情况，探讨MTHFR基因多态性与儿童支气管哮喘易感性的相关性，并通过比较不同MTHFR基因型患儿GC的疗效，初步探讨MTHFR基因多态性与GC疗效的相关性，从而为儿童支气管哮喘的遗传学研究和个体化治疗提供依据。

1. 资料与方法

1.1. 一般资料

回顾性选取2018年6月至2020年12月在我院就诊并住院治疗的支气管哮喘患儿为研究对象。纳入标准：（1）年龄0~14岁，户籍所在地为河南省，汉族；（2）符合《支气管哮喘防治指南（2020年版）》^［9］中关于儿童支气管哮喘的诊断标准；（3）哮喘严重程度≥2级；（4）近4周内未接受过GC局部或全身治疗；（5）治疗依从性良好，临床资料完整。排除标准：（1）既往有反复呼吸道感染史；（2）合并结核、肺炎及肝肾功能衰竭等其他疾病；（3）对本研究中的药物过敏或有其他过敏史。最终纳入173例支气管哮喘患儿作为观察组，其中男92例，女81例，年龄3~12岁，平均年龄（7.0±3.2）岁。同时随机选取同期在本院体检的无哮喘家族史及过敏史的健康儿童178例作为对照组，其中男100例，女78例，年龄3~12岁，平均年龄（7.4±3.1）岁。本研究经郑州儿童医院伦理委员会批准（ZZUIRB2018-0509），且所有受试儿家属均签署知情同意书。

1.2. MTHFR C677T位点基因多态性检测

所有受试儿均于采血前空腹6~8 h，采集静脉血2 mL于抗凝管中，2 000 r/min离心，分离血清和血浆，分别于-20℃冰箱中保存待用。采用DNA提取试剂盒（美国Amresco公司）提取总DNA。根据NCBI基因库中MTHFR（NC_000001.11：11785723-11806103）基因序列设计PCR引物，上游：5'-CCGCCGTGAACTACTGTGG-3'；下游：5'-AGATGGCCCGTGATCTCCTC-3'。PCR扩增条件：94℃预变性4 min；96℃变性45 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共40个循环，室温冷却1 min。采用PCR纯化试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）纯化PCR产物，并将纯化后的DNA片段于37℃恒温箱中进行HinfI酶切反应，4 h后对酶切产物用2%的琼脂糖凝胶在90 V电压下电泳30 min，溴化乙淀染色，利用凝胶成像系统对酶切产物成像观察，鉴定基因型，统计两组基因型的分布频率。

1.3. 治疗方法

观察组患儿根据病情严重程度给予常规止咳化痰、解痉平喘、维持电解质及抗感染等对症治疗，严重者给予辅助吸氧。除以上常规治疗外，雾化吸入糖皮质激素布地奈德混悬液（瑞典AstraZeneca公司）治疗，200~400 μg/次，2次/d，10 min/次，连续治疗3个月，治疗期间根据病情严重程度按需吸入支气管舒张剂硫酸沙丁胺醇溶液（澳大利亚GlaxoSmithKline公司）快速缓解。以上治疗方案参照儿童支气管哮喘防治常规中哮喘常用药物及治疗标准^［10］。

1.4. 观察指标

（1）一般资料：收集患者年龄、性别、身体质量指数（body mass index, BMI）、病程等基础资料。

（2）实验室指标：分别抽取治疗前和治疗3个月后患儿空腹静脉血2 mL，采用全自动血液分析仪检测两组受试儿嗜酸性粒细胞计数（eosinophil count，EOS%），采用酶联免疫吸附法分别检测两组受试儿血清中白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）、免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）、白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）水平，操作严格按照说明书进行。

（3）肺功能指标：治疗前和治疗3个月后，采用肺功能检测仪（美邦）对受试儿肺功能进行测试，记录受试儿第1秒用力呼气容积（forced expiratory volume in 1 second，FEV1）、用力肺活量（forced vital capacity，FVC），计算第1秒用力呼气容积占用力肺活量的百分比（FEV1/FVC%）。

1.5. 疗效评价

3个月后观察患儿喘息、咳嗽、气促、哮鸣、胸闷等临床症状改善情况，根据《儿童支气管哮喘诊断与防治指南（2016年版）》^［11］，评估患儿治疗结束后4周内的情况：喘息、胸闷等日间症状（<6岁：1次/周；≥6岁：2次/周）、夜间憋醒或咳嗽症状（<6岁：1次/周；≥6岁：2~3次/周）、应急缓解药物使用次数（<6岁：1次/周；≥6岁：2次/周）和活动能力受限。将疗效分为控制良好：症状完全缓解，偶尔轻度发作且可自行缓解；部分控制：存在1~2项上述临床症状；未控制：存在3~4项上述症状。其中控制良好视为疗效良好，部分控制和未控制视为疗效不良。

1.6. 统计学分析

采用SPSS 21.0统计学软件对所有数据进行分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（$\overline{x}\pm s$）的形式表示，两组间比较采用两样本t检验，组内治疗前后比较采用配对样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。计数资料采用百分率（%）表示，组间比较采用卡方检验，等级资料组间比较采用Kruskal-Wallis H非参数检验。应用拟合优度${\chi }^{\mathrm{2}}$检验MTHFR C667T基因型频率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用logistic回归分析支气管哮喘易感性和GC疗效敏感性的基因型。P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. Hardy-Weinberg平衡检验

经Hardy-Weinberg平衡检验，结果显示两组MTHFR基因C667T位点基因型的实际和理论频率分布无差异，均符合遗传平衡，具有群体代表性（P>0.05），见表1。

表1.

MTHFR C667T位点基因型Hardy-Weinberg平衡检验

项目	对照组 (n=178)			观察组 (n=173)
	CC	CT	TT	CC	CT	TT
实际频数 (频率)	85(47.8)	67(37.6)	26(14.6)	21(12.1)	53(30.6)	99(57.2)
理论频数 (频率)	79(44.4)	79(44.4)	20(11.2)	13(7.5)	69(39.9)	91(52.6)
${\chi }^2$值	1.988			4.318
P值	0.370			0.115

2.2. 两组一般临床资料及MTHFR C677T基因型分布情况

两组儿童的年龄、性别和BMI比较差异均无统计学意义（P>0.05）。两组基因型、等位基因分布比较差异有统计学意义（P<0.05）；观察组CC基因型频率及C等位基因频率均显著低于对照组，TT基因型频率及T等位基因频率均显著高于对照组（P<0.05）。见表2。

表2.

两组一般资料及MTHFR C667T基因型分布情况比较

组别	n	年龄($\overline{x}\pm s$, 岁)	性别(男/女, 例)	BMI($\overline{x}\pm s$, kg/m2)	基因型 [例(%)]			等位基因 [例(%)]
					CC	CT	TT	C	T
对照组	178	7.4±3.1	100/78	16.3±2.2	85(47.8)	67(37.6)	26(14.6)	243(66.6)	91(33.4)
观察组	173	7.0±3.2	92/81	15.9±2.3	21(12.1)a	53(30.6)	99(57.2)a	95(27.5)	251(72.5)
${\chi }^2$/t值		1.267	0.319	1.790	82.852			139.49
P值		0.206	0.572	0.074	<0.001			<0.001

注：［BMI］身体质量指数。a示与对照组相比，P<0.05。

2.3. MTHFR C677T基因型与支气管哮喘易感性相关性

以是否发生支气管哮喘为因变量（是=1，否=0），以年龄、性别、BMI、基因型或等位基因频率为自变量进行logistic回归分析。其中基因型按CC、CT+TT进行分类，结果显示CT+TT基因型的发病风险是CC基因型的6.615倍（P<0.001）；携带T等位基因的发病风险是携带C等位基因的7.055倍（P<0.001）。见表3。

表3.

支气管哮喘易感性的logistic回归分析

因素	B	SE	Wald${\chi }^2$	P	OR	95%CI
TT+CT基因型#	1.889	0.277	46.534	<0.001	6.615	3.844~11.385
常量	0.491	0.132	13.926	<0.001	0.612
T等位基因*	1.954	0.172	128.897	<0.001	7.055	5.035~9.885
常量	0.939	0.121	60.244	<0.001	0.391

注：^#示以CC基因型为参照；^*示以C等位基因为参照。

2.4. 不同基因型支气管哮喘患儿GC治疗前后指标变化

实验室指标检测结果显示，3种基因型患儿治疗前血清IgE、IL-8、LTB4水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。治疗后3种基因型患儿血清IgE、IL-8、LTB4水平均显著低于治疗前（P<0.05）。与CC基因型相比，TT基因型患儿治疗后血清IL-8和LTB4水平显著降低；与CT基因型相比，TT基因型患儿治疗后血清LTB4水平显著降低（P<0.05）。见表4。

表4.

不同基因型患儿治疗前后实验室指标比较 （$\overline{x}\pm s$）

基因型	n	IgE (IU/mL)				IL-8 (ng/L)				LTB4 (ng/L)
		治疗前	治疗后	t值	P值	治疗前	治疗后	t值	P值	治疗前	治疗后	t值	P值
CC	21	310±49	159±27	12.368	<0.001	27.8±5.6	20.5±3.2	5.054	<0.001	339±47	175±49	15.953	<0.001
CT	53	317±48	154±23	22.295	<0.001	29.3±5.7	20.3±2.9	2.665	<0.001	316±50	171±39	16.647	<0.001
TT	99	314±53	151±30	26.630	<0.001	30.1±6.1	18.9±2.9a	16.573	<0.001	316±48	156±35a,b	33.106	<0.001
F值		0.141	0.830			1.458	5.789			2.083	3.707
P值		0.868	0.438			0.236	0.004			0.128	0.027

注：［IgE］免疫球蛋白E；［IL-8］白细胞介素-8；［LTB4］白三烯B4。a示与CC基因型相比，P<0.05；b示与CT基因型相比，P<0.05。

肺功能检测结果显示，3种基因型患儿治疗前肺功能指标FEV1、FVC、FEV1/FVC%比较差异均无统计学意义（P>0.05）。治疗后3种基因型患儿肺功能指标均显著高于治疗前（P<0.05）。TT基因型患儿治疗后FVC明显高于CT基因型患儿，FEV1/FVC%显著高于CC基因型患儿（P<0.05）。见表5。

表5.

不同基因型患儿治疗前后肺功能的比较 （$\overline{x}\pm s$）

基因型	n	FEV1 (L)				FVC (L)				FEV1/FVC (%)
		治疗前	治疗后	t值	P值	治疗前	治疗后	t值	P值	治疗前	治疗后	t值	P值
CC	21	1.96±0.32	3.22±0.38	11.623	<0.001	2.70±0.14	3.89±0.25	19.032	<0.001	57±12	81±9	7.332	<0.001
CT	53	2.05±0.31	3.23±0.32	19.281	<0.001	2.74±0.14	3.93±0.34	24.803	<0.001	52±10	85±10	24.010	<0.001
TT	99	1.96±0.33	3.28±0.35	27.303	<0.001	2.75±0.15	4.09±0.48b	26.512	<0.001	53±10	87±10a	23.921	<0.001
F值		1.241	0.763			1.309	3.384			1.177	3.156
P值		0.292	0.468			0.273	0.036			0.311	0.045

注：［FEV1］第1秒用力呼气容积；［FVC］用力肺活量。a示与CC基因型相比，P<0.05；b示与CT基因型相比，P<0.05。

2.5. MTHFR基因C667T多态性与支气管哮喘患儿GC疗效的相关性

比较3种基因型患儿的临床疗效，结果显示临床疗效比较差异有统计学意义，且TT基因型患儿控制良好比例显著高于CC基因型（P<0.05）（表6）。以疗效（控制良好=1，部分控制+未控制=0）为因变量，以基因型为自变量进行logistic回归分析，其中基因型按CC+CT、TT进行二分类，结果显示GC对TT基因型患儿治疗效果良好是CC/CT基因型患儿的2.111倍，见表7。

表6.

不同基因型的临床疗效比较 ［例（%）］

基因型	n	控制良好	部分控制	未控制
CC	21	8(38)	11(52)	2(10)
CT	53	28(53)	21(40)	4(8)
TT	99	66(67)a	30(30)	3(3)
H值		28.164
P值		<0.001

注：a示与CC基因型相比，P<0.05。

表7.

GC疗效的logistic回归分析

因素	B	SE	Wald${\chi }^2$	P	OR	95%CI
TT基因型#	0.747	0.316	5.609	0.018	2.111	1.137~3.918
常量	0.693	0.213	10.570	0.001	0.500

注：^#示以CC+CT基因型为参照。

3. 讨论

近年来，随着对儿童支气管哮喘发病机制的不断研究和认识的加深，多数学者认为其发病机制与多基因遗传和环境因素的共同作用相关，尤其是遗传因素是其治疗疗效差异的重要因素^［12-13］。如已有研究表明，IL-7 rs766736182、IL-4 C33T位点多态性与哮喘易感性相关，且是儿童哮喘发生的独立风险因子^［14-15］，因此进一步探讨基因多态性与支气管哮喘易感性之间的关系，对儿童支气管哮喘的预防和治疗工作具有重要的意义。MTHFR作为一种转化还原酶，在甲硫氨酸-叶酸代谢过程中发挥重要作用。正常情况下，MTHFR一方面维持体内血浆同型半胱氨酸的正常水平，另一方面还介导体内嘧啶、嘌呤的合成及DNA、RNA和蛋白质的甲基化修饰代谢过程；而MTHFR基因C677T突变后，酶活性及热稳定性改变，从而导致同型半胱氨酸水平升高，体内生物合成、代谢途径受阻，进而引发恶性肿瘤、心脑血管疾病及新生儿先天异常等一系列的疾病^［16-17］。目前临床对于MTHFR基因多态性的研究主要集中在C677T位点变异，该位点导致氨基酸序列中的丙氨酸被缬氨酸取代，从而引起不同基因型下的MTHFR酶活性差异^［18-19］。研究发现MTHFR C677T位点TT基因型相对于CC基因型酶活性下降约60%~70%^［20］，提示这可能是MTHFR C677T不同基因型致病性存在差异的原因。国内外研究表明MTHFR C677T位点TT基因型较CC、CT基因型在高同型半胱氨酸血症上具有更高的致病性，是多种心脑血管疾病发生的独立危险因素^［21-22］。目前关于MTHFR与呼吸系统疾病的相关性研究较少，少数研究报道了MTHFR C677T多态性与儿童支气管哮喘的相关性，如国内学者陈文举等^［23］分析了台州地区哮喘儿童和正常儿童MTHFR C677T的多态性分布，结果显示哮喘儿童与正常儿童的MTHFR C677T基因型及等位基因频率分布均存在明显差异，哮喘组中TT基因型频率显著升高，且T等位基因是哮喘发生的危险因素。而该基因多态性在河南汉族儿童中是否也存在相似的分布，对儿童哮喘的影响如何目前尚无报道。因此，本研究探讨了河南汉族儿童哮喘与MTHFR C677T的多态性之间的关系，结果显示与对照组相比，观察组TT基因型分布频率显著高于对照组，T等位基因频率也明显升高，TT/CT相对于CC基因型的发病风险为6.615倍，T等位基因相对于C等位基因的发病风险为7.055倍，提示TT/CT基因型或携带T等位基因是支气管哮喘易感性的独立危险因素，与现有其他地区研究结果基本一致。

另外，彭昊等^［24］研究表明，CHI3L1基因多态性可能与萍乡地区哮喘患者易感性和GC疗效有关，提示基因多态性不仅在一定程度上影响支气管哮喘的易感性，还可能参与哮喘的进展和GC治疗过程。近年来，已有研究报道了部分基因多态性与GC疗效的相关性，如熊晓琦等^［25］发现eotaxin-3基因多态性除了与支气管哮喘的发病有关，其+2497位点多态性还在一定程度上影响GC的疗效，与CC和CT基因型相比，TT基因型对GC的治疗更敏感，其肺功能和临床症状改善效果更显著；Mohamed等^［26］的研究表明哮喘患者FokI基因多态性与GC耐药性之间存在关联，携带T等位基因的哮喘患者对GC的耐药性更强^［27］。多数研究指出其主要原因是哮喘的发生及病情进展往往伴随着血清IgE、TNF-α、IL-8、IL-17、LTB4等多种炎症因子水平的改变和肺功能的减弱^［28-30］，而GC是目前临床常用的高效抗炎和免疫抑制药物，主要通过改变T淋巴细胞活性和抑制IgE、IL-8、LTB4等相关炎症因子的分泌，从而减轻气道慢性炎症反应，改善肺功能和哮喘临床症状。因此，探讨基因多态性与GC治疗儿童哮喘疗效的关系对于临床用药具有重要的指导意义。而以上研究已经证实MTHFR C677T多态性和儿童支气管哮喘的发生密切相关，其是否与GC治疗疗效有一定的相关性目前几乎没有相关报道，尚需求证。因此，为了探讨MTHFR C677T不同基因型与哮喘治疗疗效之间的关系，本研究检测了哮喘患儿GC治疗前后血清IgE、IL-8、LTB4水平和肺功能指标FEV1、FVC、FEV1/FVC%的变化，并根据患儿临床症状将患儿分为疗效良好和疗效一般组，结果显示TT基因型疗效良好患儿比例显著高于CC基因型，治疗后TT基因型患儿IL-8和LTB4水平显著低于CC基因型，LTB4水平明显低于CT基因型；在肺功能上，治疗后TT基因型患儿FVC明显高于CT基因型，FEV1/FVC%显著高于CC基因型；回归分析结果显示GC对TT基因型患儿治疗效果良好是CT/CC基因型患儿的2.111倍，提示MTHFR C677T基因型多态性与GC疗效存在相关性，TT基因型患儿可能具有更高的GC敏感性。

综上所述，本研究结果显示，MTHFR C677T基因多态性与儿童支气管哮喘易感性及GC疗效相关，携带T等位基因是儿童哮喘发生的独立危险因素，TT基因型对GC疗效具有更高的敏感性。该结论为临床儿童哮喘的预防和治疗提供了新思路，比如通过检测儿童基因多态性预测哮喘发病率、针对不同基因型哮喘患儿采取针对性的个性化治疗策略等，对临床具有一定的指导意义，但本研究局限于单一地区且是小样本研究，其基因多态性检测是否适用于所有支气管哮喘患儿，还需后续纳入多地区行大样本进一步研究。

基金资助

河南省医学科技攻关计划联合共建项目（2018020614）。