脊髓损伤后胶质瘢痕在神经再生过程中作用的探讨

Abstract

The ‘glial scar’ has been widely studied in the regeneration of spinal cord injury (SCI). For decades, mainstream scientific concept considers glial scar as a ‘physical barrier’ to impede axonal regeneration after SCI. Moreover, some extracellular molecules produced by glial scar are also regarded as axonal growth inhibitors. With the development of technology and the progress of research, multiple lines of new evidence challenge the pre-existing traditional notions in SCI repair, including the role of glial scar. This review briefly reviewed the history, advance, and controversy of glial scar research in SCI repair since 1930s, hoping to recognize the roles of glial scar and crack the international problem of SCI regeneration.

如今，涉及到脊髓损伤、病变及其治疗修复相关的研究论文或评述，大都会谈及胶质瘢痕的产生、形成及其在神经再生与功能修复过程中所扮演的角色^[1-5]。长久以来的主流观点普遍认为，成熟的瘢痕应该是阻止神经纤维再生跨越并与原始靶标重新产生神经联系的一道物理屏障。此外，瘢痕组织中分泌的某些外基质分子也被证实具有抑制神经轴突生长的作用。因此，自 20 世纪 30 年代至今，瘢痕在神经再生过程中主要被认为是负面抑制角色。随着研究的不断深入，人们对瘢痕角色的认识在不断深入，越发清晰明朗，但至今仍无定论。事实上，不仅仅是瘢痕组织在脊髓损伤修复中的角色，包括影响脊髓损伤后神经再生的主要原因之争，在近百年间也有过数次变迁。争论之后，回顾历史，或许能让我们更好地梳理和认清许多理论和观念是如何产生、发展、筛选、淘汰、检验、完善、更新进步，直到成熟的。

1. 胶质瘢痕是什么？

胶质瘢痕这个概念一直以来就含混不清，目前急需一个明确的界定。脊髓损伤后，损伤部位附近的星形胶质细胞会响应损伤信号而迅速活化为反应性星形胶质细胞。这类细胞与表达 NG2（neuron/glia antigen 2）的少突胶质前体细胞和小胶质细胞一起在损伤组织附近形成一圈致密的边界结构，将整个损伤区域封闭隔离起来。而被封闭的损伤区内，在炎性反应稳定后，则聚集有许多不同来源且异质性很强的非神经类型细胞，具体包括与血管伴行的周细胞、脊膜及其他来源的成纤维细胞、MSCs、外周血来源的各种免疫细胞等^[6]；也有研究表明，脊髓室管膜细胞响应损伤后增殖产生的星形胶质细胞（这类细胞表现为胶质纤维酸性蛋白阴性）也会出现在损伤核心区内^[7]。因此，瘢痕组织的形成是一个进行性的、时间和成分上动态变化的过程。而胶质瘢痕这个名词，许多年来一直含混地代表整个由反应性星形胶质细胞形成的致密边界及其包裹的损伤核心区域。但是不难发现，损伤核心区域内神经细胞只占极其有限的一小部分，甚至在有些损伤模型中几乎检测不到其存在。基于此，有许多研究人员将损伤核心区域内的瘢痕组织称为纤维性瘢痕或者间质性瘢痕^[4]。而真正的胶质瘢痕应该是指损伤核心区外围形成致密隔离作用的数个细胞厚度的那层胶质细胞的聚合结构。

近十多年来，胶质细胞在中枢神经系统中生理功能的异质性和复杂性已有了深入的研究。除了大量的反应性星形胶质细胞之外，胶质瘢痕内还包含两类胶质细胞——NG2 细胞和小胶质细胞，这两类细胞在损伤后均有别于各自常态下特征。

1983 年 Raff 等^[8]首次发现 NG2 细胞，这类细胞在体外培养环境中会分化为少突胶质细胞或星形胶质细胞，被称为 NG2 前体细胞，也被称为少突胶质细胞-2 型星形胶质细胞祖细胞（O2A）。后续研究发现，NG2 细胞虽然在发育过程中能够在脑部特定区域分化为星形胶质细胞，但在成体中枢神经系统中只能检测到其向少突胶质细胞而非星形胶质细胞分化^[9-10]。也有少数研究表明，成体大脑中的 NG2 细胞具有向神经元分化的潜力^[11-12]，但是该研究结果还需要更多的证据进一步证实^[13]。最近研究结果表明，在脊髓损伤后，NG2 细胞的分化潜能会被激活，除了少突胶质细胞外，还可以分化为星形胶质细胞及雪旺细胞^[14]。研究表明，不同脊髓损伤模型中 NG2 细胞向星形胶质细胞分化的特性和比例存在一定差异。例如在脊髓挫伤模型中，NG2 细胞分化为星形胶质细胞的比例相对很高（25%），但在其他不同类型脊髓损伤模型中的分化比例则相对较低：背侧半横断仅为 5%，皮质刺伤 5%～8%，局灶性脱髓鞘 3%，实验性自身免疫性脑髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）1%，肌萎缩性脊髓侧索硬化症模型中几乎检测不到 NG2 细胞向星形胶质细胞的分化^[14]。最近，迈阿密大学医学院的 Lee 团队利用遗传谱系示踪技术，分别考察了在脊髓挫伤模型和 EAE 两种小鼠脊髓损伤模型下 NG2 细胞的遗传命运图谱，并考察其向星形胶质细胞分化的能力^[14]。他们发现 NG2 细胞向星形胶质细胞的分化能力确因不同脊髓损伤模型而存在差异，在挫伤模型中，损伤后 4 周星形胶质细胞占胶质瘢痕中 NG2 细胞谱系总数的 25% 左右；但在 EAE 模型中，星形胶质细胞占胶质瘢痕中 NG2 细胞谱系总数的 9% 左右。提示在既往研究中低估了 NG2 胶质细胞来源的星形胶质细胞的可能性，同时也表明 NG2 细胞在不同脊髓损伤模型中具有复杂的响应或激活机制。

脊髓损伤后，损伤局部的星形胶质细胞响应损伤而转变为反应性星形胶质细胞，后者进一步成熟为瘢痕样星形胶质细胞，最终在损伤区域周围形成致密的胶质瘢痕。这类反应性星形胶质细胞也被称为 A1 型星形胶质细胞，它们并不能为损伤后残存的神经元提供营养支持与保护，也不具有吞噬髓鞘碎片的能力，反而会杀死损伤的神经元和少突胶质细胞^[15]。其广泛存在于阿尔兹海默症、亨廷顿舞蹈症、帕金森氏症、肌肉侧索硬化以及多发性硬化等多种神经退行性疾病中。近期美国斯坦福大学医学院神经生物学系 Barres 团队的实验结果证实，脊髓损伤后，正是损伤处激活的小胶质细胞通过分泌 IL-1α、TNF 和 C1q 3 种细胞因子，诱导 A1 型反应性星形胶质细胞的产生^[15]。

小胶质细胞是脊髓中具有免疫特性的细胞，其数量占中枢神经胶质细胞总数的 5%～20%^[16]。脊髓损伤后，小胶质细胞会迅速被激活，并类似于反应性星形胶质细胞，可转化为两种不同的功能状态：经典激活型（M1 型）和选择激活型（M2 型）^[17]。其中 M1 型细胞具有促炎性反应及神经毒性作用，会进一步加重脊髓损伤，同时 M1 型细胞也是 A1 型反应性星形胶质细胞的重要诱导来源；M2 型细胞具有一定的神经营养和神经保护作用，促进脊髓损伤后神经再生与功能修复^[18]。脊髓损伤后，损伤部位的小胶质细胞可能会依据损伤程度及损伤类型，激活产生不同类型和比例的小胶质细胞。对于修复不利的 M1 型和有益于神经再生的 M2 型小胶质细胞的相对比例和分布，或许是机体响应局部损伤微环境达到的某种动态平衡的结果。有研究表明 IFN-γ 和脂多糖-TLR4 能够诱导小胶质细胞向 M1 型转换；IL-4、IL-13、IL-10 及 TLRs 则可刺激诱导 M2 型小胶质细胞的产生，参与免疫调节、抗炎性反应、细胞碎片清除、轴突再生及损伤修复等^[19-20]。因此，干预或影响脊髓损伤后 M1 型和 M2 型之间的转变，或许是为了实现神经再生和功能修复的一个潜在具有临床应用价值的修复策略^[21]。

2. 胶质瘢痕是物理屏障源自臆测？

20 世纪初，现代神经科学之父 Santiago Ramón y Cajal 根据著名的外周神经移植物能诱导中枢神经细胞的神经轴突再生长入实验，提出了趋化因子理论，来解释中枢神经系统再生困难的原因^[22]。他认为，中枢神经系统损伤后可能存在或缺乏某种对神经纤维再生必不可少的相关趋化因子。此概念暗示中枢神经系统可能相较外周神经系统存在一些抑制神经再生的因素，或者缺乏一些能促进神经再生的因素。

至 20 世纪四五十年代，有一些研究人员开始观察到，损伤后的轴突总是无法再生穿越上述由损伤后形成的结缔组织样的胶质瘢痕区域，而且许多神经轴突似乎停止在胶质瘢痕边缘，无法长入^[4]。由此，人们推测是致密的瘢痕组织本身形成了一个阻碍轴突穿越再生的物理障碍。1954 年 Clemente 等^[23]研究表明，当用药物衰减猫脊髓损伤部位胶质瘢痕的形成，能观察到更多神经轴突再生及脊髓损伤后猫的行为学改善。但此结果并未被人信服。在该论文发表后 2 年，Arteta^[24]在同一期刊刊文，称 Clemente 等报道的再生结果及功能恢复无法验证。二十多年后仍有研究者在重复这一实验结果^[25]，遗憾的是同样也无法重复出阳性结果。但是瘢痕组织是神经再生的物理障碍这一观念非常直观明了，难以让人轻易否决。

3. 胶质瘢痕产生的硫酸软骨素蛋白聚糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs）是抑制轴突再生的因素之一

受限于 20 世纪 50～80 年代细胞干预技术和实验分析手段，并没有太多令人信服的实验来多角度验证胶质瘢痕作为神经轴突再生障碍角色的科学性。直至 20 世纪 90 年代后，随着手术精细程度提升，分离鉴定手段突飞猛进，显微观察示踪术的发展，围绕胶质瘢痕的研究也在不断向前推进。Cajal 的理论自提出至上世纪 90 年代，数代科研人员虽然未能筛选和寻找到中枢神经系统中有利再生的因素，但是却陆续发现了不少起抑制作用的蛋白因素，例如 Nogo 蛋白、髓鞘碱性蛋白和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白等^[26-28]。在此期间，Martin Schwab 实验室引领了 1980s–2000s 时期脊髓损伤修复领域以外界抑制因素为主要归因的研究高潮。

在抑制类蛋白因素中，瘢痕组织中由反应性星形胶质细胞及其他细胞大量表达的 CSPGs 细胞外基质分子，在此期间被视为是主要影响轴突再生的抑制因素之一。1991 年，凯斯西储大学 Jerry Silver 实验室通过体外实验表明，脊髓损伤后瘢痕组织中反应性星形胶质细胞来源的 CSPGs 在体外能抑制神经轴突的生长，暗示其在体内可能的神经再生抑制角色^[29]。之后，剑桥大学国王学院 James Fawcett 实验室研究表明，通过施加硫酸软骨素酶 ABC（chondroitinase ABC，ChABC）消化损伤区瘢痕组织内 CSPGs 分子使其失去活性，可以有效促进脊髓损伤动物的运动功能恢复^[30]；此外，他们还观察到损伤部位附近明显的神经轴突出芽再生。此后，James Fawcett 实验室一直致力于 ChABC 治疗脊髓损伤的临床推广。后续的许多研究也较好地重复验证了 ChABC 在治疗脊髓损伤上的效果^[31-35]。

近年，Jerry Silver 实验室的研究结果还显示，当轴突中的蛋白酪氨酸磷酸酶 σ（protein tyrosine phosphatase σ，PTPσ）与胶质瘢痕中 CSPGs 相互作用时，会阻止轴突生长。他们设计了名为细胞内 σ 肽段（可作为 PTPσ 的模拟肽）的拮抗剂来阻断 PTPσ 与 CSPGs 的结合，皮下注射该药物后能使脊髓损伤的瘫痪小鼠恢复轴突再生，并可有效改善运动和膀胱功能^[36]。

由此可见，胶质瘢痕及其分泌物 CSPGs 可能通过本身形成物理屏障，以及通过某种抑制信号导致轴突再生障碍和再生轴突的再髓鞘化障碍，来负面影响脊髓损伤后神经功能再生。

4. 为胶质瘢痕及 CSPGs 抑制角色的抗辩

胶质瘢痕本身及其分泌的外基质成分 CSPGs 是否就是轴突难以再生的抑制因素之一，从一开始就面临着诸多质疑。否认 CSPGs 抑制角色观点的研究人员认为，无论是酶切消化 CSPGs 的侧链，还是对其所谓抑制轴突再生的信号通路进行拮抗和衰减，虽然检测到一定的神经功能恢复，却并无体内确切证据显示运动神经纤维能跨越瘢痕组织进行长距离再生。此外，CSPGs 能体内抑制神经轴突再生的结论也不是一成不变的，加州大学圣迭戈分校的 Mark Tuszynski 教授团队发现，少部分轴突是可以再生长入瘢痕组织之中的，而且这类瘢痕组织能检测到 NG2（又名 CSPG4，是由瘢痕区内大量少突胶质前体细胞，即 NG2 细胞，所分泌的 CSPGs 的主要类型）、L1、层粘连蛋白和神经细胞黏附分子等诸多细胞外基质蛋白的表达。上述细胞外基质分子中，除了 NG2 被视为抑制分子外，后三类细胞黏附因子通常被视为轴突生长的促进因子^[37-38]，该现象提示损伤部位诸多抑制轴突再生的因素与促进因素共同存在，而它们之间的相互影响和作用或许对部分类型神经轴突的再生有协调调节作用。

CSPGs 的种类繁多，至今已发现的有 30 多种类型，但并非所有 CSPGs 均表现出对神经再生具有抑制作用。例如，有研究表明 CSPG4（NG2）和 CSPG5（又名神经多糖 C）就表现出对轴突生长的促进作用^[39-40]。此外，还有研究表明 NG2 缺陷的小鼠在脊髓损伤后，5-羟色胺能神经纤维在瘢痕组织中的再生依旧受到限制^[41]。其他类型 CSPGs 对轴突再生、炎性反应的响应、神经环路的重塑以及功能修复的作用，目前报道较少，且结果复杂多样，相关内容可参考近期相关综述^[42]。事实上，体内损伤微环境异常复杂，除了 CSPGs 之外，还有大量其他细胞外基质存在，如胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白等。而 CSPGs 能与细胞外基质中上述所有黏附分子和其他神经生长因子等相结合或相互作用，这些不同组合又会产生不同的生物学效应。因此，在复杂的损伤微环境中，单纯考虑 CSPGs 的存在对神经轴突再生的影响，这种概率几乎是不存在的。总之，最终观察到 CSPGs 的存在是促进还是抑制轴突再生的现象，很可能是由于轴突所处的不同损伤微环境中多种不同的外基质成分或其他因素共同存在、相互博弈所取得的某种平衡所致。

2016 年，加州大学洛杉矶分校的 Micheal Sofroniew 教授团队^[40]通过遗传手段特异去除成年小鼠脊髓内响应脊髓损伤的具有瘢痕形成能力的反应性星形胶质细胞的增殖能力，并观察在急性期及陈旧性时期，特异阻碍胶质瘢痕形成后 3 种不同类型中枢神经系统上下行神经轴突的再生情况及总体 CSPGs 水平。结果表明，减少形成瘢痕的星形胶质细胞，虽然可以有效阻止胶质瘢痕的形成，但是无论阻碍急性期胶质瘢痕形成还是慢性胶质瘢痕形成，都不能引起有效的神经纤维再生进入损伤区内，同时该类细胞的增殖与否对 CSPGs 的沉积并无显著影响。斯坦福大学 Ben Barres 教授在同期《Nature》杂志配发的宣传文，题为“Not everything is scary about a glial scar”，文章上线后引发了不小的震动^[40]。瘢痕研究领域知名的 Silver 教授随后在《Experiment Neurology》杂志撰文，对上述 Ben Barres 教授的文章提出了见解与异议^[43]。在 Micheal Sofroniew 教授的研究中，无论急性期还是慢性期内，特异衰减由反应性星形胶质细胞所形成的星形胶质瘢痕，均观察不到皮质脊髓束的再生；同时未对星形胶质瘢痕做处理的对照组也并未见到有效的皮质脊髓束再生。因此以胶质瘢痕有助于轴突再生为标题略显得夸张。另外，急性期内衰减瘢痕形成反而使得轴突再生情况变差，这可能是反应性星形胶质细胞的改变引起了免疫反应的改变而导致的结果。

瘢痕组织的成分原本就是复杂的，因此，试图通过单一去掉某种细胞存在的因素去衡量其在损伤修复中的作用，最终结果可能与现实情况差异甚大；其次，瘢痕组织的组分及从急性期到慢性期的形成过程应该是动态变化的，因此，瘢痕组织对神经纤维再生的影响随时间和具体环境而扮演辩证的角色。所以，部分研究者认为^{[36, 42-45]}，胶质瘢痕在早期很可能对轴突再生是有益的，而陈旧性的胶质瘢痕可能主要对轴突再生起到障碍和抑制作用。戴建武研究团队近日发表在《Experimental Neurology》杂志的文章似乎可以印证这一观点^[44]。该研究中分别分离了大鼠脊髓全横断损伤后 2 周及 8 周的瘢痕组织，对亚急性期和陈旧性期的瘢痕组织进行蛋白质组学分析，结果显示 2 周形成的瘢痕组织中含有更多营养因子，而一些长期被视为不利于轴突再生的外基质的分泌则在 8 周形成的瘢痕组织中更多。上述结果表明亚急性期与陈旧性期的瘢痕组织在蛋白质表达上存在差异，这也暗示亚急性期的瘢痕组织相对更有益于促进神经再生，而陈旧性期的瘢痕组织则对轴突再生更多起到的是负面抑制作用。

日本九州大学 Seiji Okada 研究团队通过在脊髓损伤 2 周后，特异性通过药物抑制 integral 信号来衰减胶质瘢痕的形成，也观察到在亚急性期之后处理瘢痕组织，可以明显改善脊髓损伤动物的行为学水平^[46]，该结果也与上述推测相吻合。在 Micheal Sofroniew 教授发表于《Nature》杂志的文章中^[40]，脊髓损伤 5 周后通过遗传学手段减少陈旧性胶质瘢痕的形成后，未能观察到损伤区内明显的神经纤维再生。这一结果似乎提示陈旧性胶质瘢痕的衰减并不能有效促进神经纤维再生。但戴建武组的研究结果却并不相同，他们在脊髓损伤 8 周后，手术清除陈旧性瘢痕组织，能观察到明显的神经纤维再生，其结果提示陈旧性瘢痕组织的存在可能确实影响了神经轴突的再生^[44]。

由此可见，胶质瘢痕在急性期内促进神经再生很可能是通过分泌神经营养因子，通过其各自的信号通路对损伤的神经组织起营养支持和神经保护作用。此外，胶质瘢痕在急性期内的促进神经再生作用，还可能通过将损伤区隔离起来阻止其进一步扩大，并隔绝和降低免疫反应带来的继发性损伤等机制实现^[47]。目前主流观念认为，胶质瘢痕在陈旧性时期对神经再生的抑制主要是通过其分泌的一些细胞外基质如 CSPGs 来实现的，少数 CSPGs 抑制或促进损伤轴突再生的具体分子机制目前已有所知^[42]，但尚未完全明确。然而其他大量 CSPGs 的角色及其作用机制，目前仍然知之甚少。

早在 2015 年 1 月，戴建武团队在国际首次开展了神经再生胶原支架移植治疗陈旧性完全性脊髓损伤的临床研究^[48]。他们通过损伤部位原位电生理检测来区分神经电生理传导的响应区域与非响应区域，并首次在术中对陈旧性脊髓损伤患者损伤部位无神经传导活性的瘢痕组织进行清理。随后，他们在瘢痕组织清除区域移植了其自主研发的神经再生胶原支架。首批 5 例患者经过 1 年的安全性评估，未发现与瘢痕清理和神经再生胶原支架移植相关的不良反应，证明产品及治疗方案的安全性，这是国际上首次将功能胶原支架应用于患者的临床研究。目前，戴建武团队已完成近 60 例陈旧性脊髓损伤患者的功能胶原支架移植手术，部分患者出现植物神经功能以及感觉平面扩展等效果，证实陈旧性瘢痕组织的存在可能确实影响了神经功能恢复，而科学清除陈旧性瘢痕组织可以有效改善患者的感觉及运动功能^[49]。

5. 总结

胶质瘢痕组织及其分泌蛋白 CSPGs 在脊髓损伤后所扮演的角色已经争论了近百年，这种科学研究中的分歧和争议成为了推动科学进步的有效动力之一。相信随着科技的进步和研究的深入，用科学、动态和辩证的眼光去分析瘢痕组织及其在神经再生过程中的角色，会使得对瘢痕的定位和认知越发清晰合理。同时，这样的认知也将有效助力脊髓损伤修复这一世界难题的早日攻克。

Biography

戴建武：中国科学院遗传与发育生物学研究所研究员，中国科学院“百人计划”入选者；国家杰出青年基金获得者；国务院政府特殊津贴获得者。戴建武再生医学团队突破了再生医学产品研发的关键技术，研制了基于胶原蛋白的能有效引导组织再生的智能生物材料系列产品，率先组织领导了包括子宫内膜再生、脊髓损伤再生、心肌再生、卵巢早衰再生修复等多个产品的临床研究。主持国家自然科学基金重点项目、中国科学院干细胞与再生医学战略性先导科技专项项目等省部级以上重大项目 20 余项；是连续两届国家重点科学研究计划干细胞专项项目（973 管理）首席科学家，国家重点研发计划项目首席科学家。在 Cell、Circulation、Stem Cells、Biomaterials 等杂志上发表 SCI 论文 200 余篇，被引用 4 000 余次。申请及获授权国内外专利 30 余项，获国家科学技术进步奖二等奖 1 项，中央电视台 2014 年度十大科技创新人物，第六届中国侨界再生医学创新成果奖，2017 年中国细胞生物学会干细胞生物学分会干细胞成果转化奖

Funding Statement

国家重点研发计划（2016YFC1101500、2017YFA0104700）；中国科学院重点部署项目（ZDRW-ZS-2016-2）

National Key Research and Development Program of China (2016YFC1101500, 2017YFA0104700); Key Research Program of the Chinese Academy of Sciences (ZDRW-ZS-2016-2)