纳米聚吡咯/甲壳素复合膜的制备及其生物相容性观察

Abstract

目的

制备纳米聚吡咯（polypyrrole，PPy）/甲壳素复合膜并观察其生物相容性。

方法

采用微乳液聚合法合成纳米 PPy，与壳聚糖共混并成膜后，进行乙酰化改性得到纳米 PPy/甲壳素复合膜（A 组），制备壳聚糖膜（B 组）及经乙酰化改性得到的甲壳素膜（C 组）作为对照组，使用扫描电镜、红外光谱观察等方法对纳米 PPy、各组膜进行鉴定并测定其导电性。将 3 组膜与雪旺细胞体外共培养，采用倒置显微镜观察、活细胞染色、细胞计数、免疫荧光染色等方法观察膜的体外生物相容性，使用溶菌酶溶液评价膜的体外降解情况。

结果

纳米 PPy 合成后，经红外光谱观察，显示在 1 543.4 cm^–1 和 1 458.4 cm^–1 处出现 PPy C=C 的特征振动吸收峰；扫描电镜观察发现纳米 PPy 的粒子聚合体直径为 100～200 nm。3 组膜制备后，红外光谱观察显示，A、C 组膜出现乙酰化改性后的 1 562 cm^–1 左右的酰胺 Ⅱ 谱带特征峰，显示 A、C 组膜成功乙酰化成甲壳素。导电性检测显示 A 组膜的电导率为（1.259 2±0.005 7）×10^–3 S/cm；B、C 组膜均未检测出电导率。扫描电镜观察到 A 组膜表面有均匀分布的纳米 PPy 聚合颗粒，对照组光滑平整，显示纳米 PPy 与壳聚糖共混并改性后成功得到导电纳米 PPy/甲壳素复合膜。将雪旺细胞与 3 组膜共培养，经二乙酸荧光素活细胞染色、可溶性蛋白-100 免疫荧光染色及倒置显微镜观察发现，培养的雪旺细胞存活，功能状态良好；共培养 2、4 d 后，细胞计数显示 A 组膜上细胞增殖数量显著多于 B、C 组（P<0.05），显示 A 组膜表现出比对照组更强的支持细胞黏附增殖的能力。膜的体外降解观察发现各时间点 A、C 组膜体外降解率均显著高于 B 组（P<0.05），表明同等条件下乙酰化改性处理的膜降解性能优于壳聚糖膜。

结论

纳米 PPy 与壳聚糖可成功共混并顺利乙酰化改性，所得纳米 PPy/甲壳素复合膜导电可降解，具有较好的体外生物相容性。

研制组织工程神经作为神经移植的替代物，已成为神经缺损修复的一个重要研究领域。甲壳素、壳聚糖在生物相容性和降解性等方面优势明显，是相对较为理想的组织工程材料^[1-5]。壳聚糖为甲壳素脱乙酰基所得，溶解性明显高于天然甲壳素，较易加工成形，也已被研究用于制作多种医学生物材料。与壳聚糖相比，甲壳素在降解速度和机械性能方面有一定优势；但是天然甲壳素溶解性差，不易加工处理，且与甲壳素共存的蛋白质难以清除。本课题组前期研究中通过壳聚糖选择性乙酰化改性制备甲壳素，规避了直接使用甲壳素溶解性差、蛋白质清除难等问题，且观察到壳聚糖选择性乙酰化的甲壳素具有良好的体内、外生物相容性^[5-6]。

当然，无论是选择甲壳素还是壳聚糖作为组织工程神经的支架材料，皆不具备导电性能，影响了其作为神经移植替代物的性能。而研究较多的导电材料如聚吡咯（polypyrrole，PPy）、聚四氟乙烯一类的高分子聚合材料，又因生物降解困难而限制其成为理想的组织工程神经支架材料。近年研究认为，通过改变 PPy 的尺寸、导电聚合物材料的表面功能化修饰，或通过合成既有共轭结构又有酯键的高聚物等途径，有望实现导电高聚物的降解性^[7-9]。另外，有文献报道将小尺寸的导电聚合物和可生物降解的材料（如聚酯、壳聚糖等）偶联或混杂，构建导电聚合物和生物降解材料的大分子框架，可初步实现整个大分子框架的导电性和降解性^[10-11]。鉴于此，本研究拟制备出纳米 PPy/甲壳素复合材料，并观察其生物相容性、导电及降解性能，为构建新型导电性能好、降解速度快的复合材料神经导管提供实验依据。

1. 材料与方法

1.1. 主要实验材料及仪器

壳聚糖（南通兴成生物制品厂）；RSC96 大鼠雪旺细胞（中国科学院细胞库）；DMEM 培养基（GIBCO 公司，美国）；二乙酸荧光素（fluorescein diacetate，FDA）、溶菌酶（Sigma 公司，美国）；兔抗可溶性蛋白-100（soluble protein-100，S-100）多抗、羊抗兔 IgG-TRITC 二抗（武汉博士德生物工程有限公司）。VERTEX 70 傅里叶红外光谱仪（Bruker 公司，德国）；S4700 扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；M-3 四探针电导测试仪（苏州晶格电子有限公司）；TI CFIS60 倒置荧光显微镜（Nikon 公司，日本）。

1.2. 纳米 PPy 的合成与表征

使用文献报道的微乳液聚合法^[12-13]合成纳米 PPy：将一定量的吡咯单体搅拌加入微乳液中［以十二烷基苯磺酸（dodecyl benzene sulfonic acid，DBSA）水溶液为乳化剂，FeCl₃ 为氧化剂，FeCl₃∶Py 摩尔比为 3.75∶1］，室温下聚合反应 24 h 后，丙酮终止反应，并用大量去离子水水洗，离心（6 500 r/min 离心 5 min），分离沉淀，真空干燥后即得纳米 PPy 粉末。

取少量纳米 PPy 粉末，常规 KBr 压片，用傅里叶红外光谱仪测定其红外光谱图。另取一定量的纳米 PPy 在 0.5%（V/V）醋酸溶液中超声震荡制成 1.5%（W/V）纳米 PPy 悬液，取 1 滴悬液干燥、喷金后扫描电镜观察。

1.3. 纳米 PPy/N-乙酰化壳聚糖复合膜的制备与表征

用 1%（V/V）醋酸溶解壳聚糖制成 1.5%（W/V）壳聚糖溶液，加入前述 1.5%（W/V）纳米 PPy 悬液，配成 2.5%（W/W）纳米 PPy/壳聚糖混合溶液。强烈搅拌 4 h 后，真空减压脱气，再将混合溶液注入平皿中，自然流延成膜，50℃ 烘箱过夜（用于降解测试的膜采用冷冻干燥，下同），2%NaOH 脱酸中和 24 h，去离子水水洗至中性，室温干燥得到纳米 PPy/壳聚糖膜。再将得到的纳米 PPy/壳聚糖膜浸入 5%（V/V）醋酐甲醇溶液中，室温乙酰化反应 2 h，4%NaOH 溶液处理后，去离子水水洗至中性，干燥得纳米 PPy/N-乙酰化壳聚糖复合膜，作为实验组（A 组）。将部分 1.5%（W/V）壳聚糖溶液直接自然流延成膜，经同法干燥、脱酸得到壳聚糖膜（B 组）；另将部分壳聚糖膜经乙酰化等处理后制备成 N-乙酰化壳聚糖膜（C 组）；B、C 组均为对照组。

取制成的 A、B、C 组 3 种膜，部分用傅里叶红外光谱仪测定其红外光谱图，采用董炎明等^[14]报道的红外光谱法测定膜的乙酰度；部分使用四探针电导测试仪测定电导率；取 A、B 组膜经干燥、喷金后扫描电镜观察。

1.4. 膜体外生物相容性观察

1.4.1. 雪旺细胞与膜共培养后形态观察

取部分上述 3 种膜，修剪成直径 15.6 mm 的圆形膜，经紫外线照射 4 h 后，0.01 mol/L PBS 水洗，含 10%FBS 的 DMEM 培养基浸泡后平铺于 24 孔培养板底部。取处于对数生长期的大鼠雪旺细胞，0.125%胰蛋白酶消化后，以 2×10⁴个/mL 密度接种于 3 组膜上，用含 10%FBS 的 DMEM 培养基于 37℃、5%CO₂ 条件下培养，隔天半量换液。细胞接种后每天倒置显微镜观察雪旺细胞在膜上的生长、迁移情况。

1.4.2. 活细胞染色观察

雪旺细胞与膜共培养 2 d 后，每组各任取出 3 个复孔，向培养系统中加入 5 μL FDA（5 mg/mL），避光反应 5 min，吸出培养液，0.01 mol/L PBS 水洗，倒置显微镜观察活细胞染色情况。

1.4.3. 细胞增殖情况观察

雪旺细胞与膜共培养 2、4 d 后，每组各任取出 3 个复孔，吸出培养液，0.01 mol/L PBS 水洗、胰蛋白酶消化后，以计数板细胞计数，并计算每孔细胞增殖数量，观察细胞增殖情况。

1.4.4. 细胞免疫荧光染色观察

雪旺细胞与膜共培养 4 d 后，每组各任取出 3 个复孔，吸出培养基，分别经 0.01 mol/L PBS 水洗、4% 多聚甲醛固定、封闭液封闭、一抗兔抗 S-100（1∶250）孵育、水洗、二抗 TRITC-羊抗兔（1∶64）孵育、水洗等步骤，荧光显微镜观察。

1.5. 膜体外降解观察

使用溶菌酶溶液评价各组膜的体外降解情况。首先配制浓度为 0.004 g/mL 的溶菌酶溶液（溶剂为 PBS 溶液，pH7.4）；配制完成后用针头滤器过滤，之后分装，放入–20℃ 中保存。应用时，根据膜的表面积与酶溶液的体积比（10 cm²∶1 mL），将 3 种膜（每种膜每个时间点 3 个样本）分别浸入上述溶菌酶溶液中，置于 37℃ 烘箱中进行降解。之后每天更换 1 次溶菌酶溶液。实验前详细称量并记录膜材料样品冻干后的初始重量（W₁）；于降解第 1、2、4、6、8、10 天，分别从溶菌酶溶液中取出膜，初步观察降解情况后，用蒸馏水彻底洗涤，冻干后称重并记录（W₂），按以下公式计算膜体外降解率 D=（W₁–W₂）/W₁×100%。

1.6. 统计学方法

采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. 纳米 PPy 的表征

2.1.1. 傅里叶红外光谱仪检测

纳米 PPy 红外光谱图显示，在 1 543.4 cm^–1 和 1 458.4 cm^–1 处出现吸收峰，为纳米 PPy C=C 的特征振动吸收峰，前者为非对称伸缩振动引起的，后者为对称伸缩振动引起的，说明聚合时吡咯环未改变。1 100～1 300 cm^–1范围内为吡咯环上 C-N 的伸缩振动峰，1 035 cm^–1处为吡咯环上 C-H 的摇摆振动峰，785 cm^–1 处为C-H 的面外变形振动吸收峰。但并未出现文献报道的纯纳米 PPy 在 3 430 cm^–1 附近有宽大的 N-H 吸收峰，这与 DBSA 的掺杂有关，在吡咯聚体掺杂复合程度较高时，掺杂物改变了纳米 PPy 的结构，在红外光谱上则观察不到该峰；间接说明 DBSA 掺杂成功。见图 1。

图 1.

FT-IR spectra of nano-PPy

纳米 PPy 傅里叶红外光谱图

2.1.2. 扫描电镜观察

可见纳米 PPy 呈球形，堆积紧密，颗粒细致均匀，颗粒间空隙较多。纳米 PPy 粒子聚合体直径为 100～200 nm，且该聚合体是由更细小的直径 10～20 nm 左右的粒子团聚而成。见图 2。

图 2.

Scanning electron microscope observation of PPy particles (×20 k)

纳米 PPy 扫描电镜观察（×20 k）

2.2. 纳米 PPy/N-乙酰化壳聚糖复合膜的制备与表征

2.2.1. 傅里叶红外光谱仪检测

3 种膜的红外光谱图中均可见 1 310 cm^–1 左右的酰胺 Ⅲ 谱带（C-N）和 1 647 cm^–1 左右的酰胺 Ⅰ 谱带（C=O），不同的是 B 组中可见 1 590 cm^–1 左右的壳聚糖 NH₂ 弯曲振动特征峰，A、C 组中由于 1 562 cm^–1 左右的酰胺 Ⅱ 谱带增强，掩盖了 NH₂ 弯曲峰。经测定，B 组膜的乙酰度为 9.19%（与商品壳聚糖标示的脱乙酰度相符），A、C 组膜的乙酰度分别为 82.15%、75.60%。上述谱线变化及计算结果说明，经过乙酰化处理，壳聚糖已经乙酰化变成了甲壳素。A、C 组间谱线比较变化不大，因纳米 PPy 在复合膜中占比<10%，难以明显影响红外光谱中吸收峰的特点。见图 3。

图 3.

FT-IR spectra of 3 membranes

3 种膜傅里叶红外光谱图

3 条谱线自上而下依次为 B 组、C 组、A 组

The 3 lines from top to bottom for groups B, C, and A respectively

2.2.2. 电导率检测

A 组膜的电导率为（1.259 2±0.005 7）×10^–3 S/cm；B、C 组膜均未检测出电导率。

2.2.3. 扫描电镜观察

B、C 组膜表面光滑平整；而 A 组膜则因为纳米 PPy 的复合，表面可见与纳米 PPy 扫描电镜图中大小基本一致的纳米 PPy 聚合颗粒，致复合膜表面虽平整但不光滑，为有均匀分布颗粒的粗糙面。见图 4。

图 4.

Scanning electron microscope observation of 3 membranes (×5 000)

3 组膜扫描电镜观察（×5 000）

a. A 组；b. B 组；c. C 组

a. Group A; b. Group B; c. Group C

2.3. 膜体外生物相容性观察

2.3.1. 雪旺细胞与膜共培养后形态观察

倒置显微镜观察示，雪旺细胞在 3 组膜上均能黏附并成功生长，细胞形态从接种初期的类圆形逐渐延伸成梭形，边缘清晰，胞体透亮有光泽，有较强的立体感，并长出多个突起，相邻细胞间突起相互连接。见图 5。

图 5.

Growth condition observation of Schwann cells co-cultured on 3 membranes (Inverted microscope×200)　

雪旺细胞在 3 组膜上生长情况观察（倒置显微镜×200）

从左至右依次为 A 组、B 组、C 组膜　a. 培养 1 d；b. 培养 4 d

From left to right for membranes of groups A, B, and C respectively　a. Cultured for 1 day; b. Cultured for 4 days

2.3.2. 活细胞染色观察

雪旺细胞与各组膜共培养 2 d，FDA 活细胞染色观察示雪旺细胞均存活，功能状态良好，部分细胞已长出明显突起。见图 6。

图 6.

FDA living cell staining observation of Schwann cells co-cultured on 3 membranes for 2 days (Fluorescence microscope×200)

雪旺细胞与 3 组膜共培养 2 d FDA 活细胞染色观察（荧光显微镜×200）

a. A 组；b. B 组；c. C 组

a. Group A; b. Group B; c. Group C

2.3.3. 细胞增殖情况观察

共培养 2、4 d，雪旺细胞在 3 种膜上均成功黏附、增殖。共培养 2 d 时 A、B、C 组膜上细胞增殖数量分别为（6.026 7±0.201 3）×10⁵、（5.483 3±0.225 5）×10⁵、（4.956 7±0.188 7）×10⁵个/mL，4 d 时分别为（94.620 0±1.697 4）×10⁵、（82.466 7±1.350 3）×10⁵、（81.453 3±1.163 8）×10⁵个/mL。两个时间点 A 组膜上细胞增殖数量均显著高于 B、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；共培养 2 d，B 组膜上细胞增殖数量多于 C 组，差异有统计学意义（P<0.05），但共培养 4 d 时 B、C 组间比较细胞增殖数量，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3.4. 细胞免疫荧光染色观察

雪旺细胞与膜共培养 4 d 后，细胞免疫荧光染色观察可见 3 组膜上均黏附有 S-100 阳性细胞，胞体呈椭圆形或梭形，可见突起。见图 7。

图 7.

S-100 immunocytochemical staining of Schwann cells co-cultured on 3 membranes for 4 days (Fluorescence microscope×200)

雪旺细胞与 3 组膜共培养 4 d S-100 免疫荧光染色观察（荧光显微镜×200）

a. A 组；b. B 组；c. C 组

a. Group A; b. Group B; c. Group C

2.4. 膜体外降解观察

随着降解时间延长，3 组膜均出现不同程度的质量丢失。B 组膜质量变化最小；A、C 组膜在降解第 6 天时质量丢失即达约 45%，以后随时间延长，基本稳定在近 50% 水平。各时间点 A、C 组膜体外降解率均显著高于 B 组，差异有统计学意义（P<0.05）；A、C 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 8。

图 8.

In vitro degradation rate of each film at each time point

各时间点各组膜体外降解率

3. 讨论

纳米 PPy 的聚合方法较多，包括电化学聚合、化学氧化、模板法、静电纺丝法等，其中又以模板法较为常用。本研究采用的是被誉为制备纳米粒子的“万能方法”—微乳液聚合法，制备出的纳米 PPy 经扫描电镜测定尺寸达到纳米级，经红外光谱仪鉴定符合纳米 PPy 的红外光谱特点，且 DBSA 成功掺杂，为通过改变 PPy 的尺寸实现导电高聚物的降解创造了条件。对于纳米 PPy 的尺寸，文献报道微乳液聚合法所能得到的聚合物尺寸最低可达到直径几纳米的超细粒子^[13-15]，本研究中扫描电镜下亦观察到直径 10～20 nm 的粒子，但因纳米粒子的团聚效应，聚合成了较大的颗粒。因此如何进一步优化制备工艺，降低纳米粒子的团聚效应，应是下一步研究需要解决的问题。

对于壳聚糖的乙酰化改性研究，方法比较成熟，一般认为在甲醇或乙醇体系中，以乙酸酐作为酰化剂，可以较为方便地对壳聚糖进行 N-酰化改性；另外，由于氨基的反应活性比羟基大，乙酰化反应首先在氨基上发生，要想得到 O-酰化的壳聚糖反而是较为困难的^[16]。本研究中乙酰化反应后膜的红外光谱图中未观察到 O-酰基的特征吸收峰，说明酸酐与壳聚糖的氨基发生了乙酰化反应，得到了研究需要的甲壳素。A 组膜的红外光谱图中因纳米 PPy 含量较低，未能在光谱图中反映出混合物的特性，但扫描电镜表面可见到与纳米 PPy 扫描电镜图中大小基本一致的纳米 PPy 聚合颗粒，分布均匀，致复合膜表面呈现出有均匀分布颗粒的粗糙面，与 B、C 组光滑平整的表面区别明显，间接说明纳米 PPy 成功混合入甲壳素膜中。

雪旺细胞是周围神经系统胶质细胞，在周围神经的发生发育、髓鞘形成、损伤再生中均发挥着关键作用^[6]。甲壳素膜在既往研究中已被证实具有较好的细胞相容性^{[6, 17]}。因此，本研究采用雪旺细胞与制备的纳米 PPy/甲壳素复合膜共培养，以壳聚糖、甲壳素膜为对照。共培养实验中，观察到雪旺细胞在 3 组膜上均能成功黏附、增殖，且培养的细胞经 S-100 免疫荧光细胞染色鉴定为阳性，说明 A 组膜与 B、C 组类似，均有着良好的生物安全性，纳米 PPy 的加入未影响膜的生物安全性。壳聚糖经 N-乙酰化改性后，乙酰化本身并不会影响材料的生物安全性，但研究认为，乙酰度增加，氨基含量减少，细胞黏附能力和分化增殖能力有下降趋势^[17-18]。本研究中观察到壳聚糖膜上共培养的细胞增殖能力稍强于 N-乙酰化改性后的甲壳素膜，与文献报道相符。

对于纳米 PPy，多数研究认为，其作为一种新型共轭结构导电聚合物材料，在离子检测、超电容、防静电材料及电化学生物传感器等方面广泛应用，也是重要的组织工程材料，报道显示纳米 PPy 具有生物活性的表面，且可为神经细胞、内皮细胞、心肌细胞等提供黏附与增殖的锚点^[19-21]，以支持贴壁性细胞的生长。本研究在甲壳素膜中引入高聚物纳米 PPy 后，膜表面形态平整，但出现有均匀分布纳米 PPy 颗粒的粗糙面，膜的光整度虽受一定程度的影响，但纳米 PPy 颗粒形成的粗糙面有可能提供了细胞黏附与增殖的锚点，从而表现出在 A 组膜上培养的细胞增殖能力优于 B、C 组。

本研究所获得的纳米 PPy/甲壳素复合膜经检测具备导电性能，其电导率与文献报道的纳米 PPy 浓度对应的电导率相符^{[12, 22]}。增加纳米 PPy 在复合材料中的浓度固然可以获得更好的导电性能，但考虑到纳米 PPy 本身尚未发现可被体内某种酶降解，目前方案也只是利用其纳米尺寸的优势，以期能被排泄器官排出体外，但纳米尺寸的粒子团聚问题尚未得到满意解决，因而需要在导电和降解之间合理选择，以获得需要的导电能力及最佳的降解性能。至于壳聚糖、甲壳素的降解性能，一般认为二者均具备降解性能，但在一定脱乙酰度范围内，壳聚糖的降解性能与其脱乙酰度成负相关^{[17, 23]}。本研究制备的 3 种膜的降解性能变化规律与文献报道一致^[23-24]，但纳米 PPy/甲壳素复合膜与 Wan 等^{[12, 22]}制备的纳米 PPy/壳聚糖复合材料（同样采用冻干干燥法）相比，导电性能类似，降解性更好，符合组织工程材料对降解性能的要求。

综上述，本研究制备的纳米 PPy/甲壳素复合材料膜具备较好的生物安全性，适宜外周神经胶质细胞的黏附、增殖，具备良好的体外生物相容性、导电性，同等条件下降解性能优于壳聚糖膜。下一步将围绕优化制备工艺，降低纳米粒子的团聚效应，复合膜的降解性能与神经再生时间之间的匹配等方面展开进一步研究，为构建新型导电可降解组织工程支架复合材料提供依据。

Funding Statement

江苏省卫生厅卫生职业技术教育研究室立项课题（J201301）；江苏省高等学校自然科学研究项目（18KJD310005）；苏州市科技局项目（STSD2011074）；江苏省“青蓝工程”资助项目（苏教师[2012]39号）

Research Project of Health Vocational Education Research Room of Jiangsu Health Department (J201301); Natural Science Research of Jiangsu High Education Institutions (18KJD310005); Science and Technology Project of Suzhou City (STSD2011074); Qing Lan Project of Jiangsu Province (2012[39])