体外长期培养的猪 BMSCs 发生转化过程中基因表达谱和 DNA 甲基化谱关联分析

Abstract

目的

探讨体外长期培养的长白猪 BMSCs 全基因组 DNA 甲基化状态，阐明甲基化在调节基因表达上与 BMSCs 发生转化的关系。

方法

抽取 3 月龄长白猪胫骨近端骨髓，采用密度梯度离心法并根据细胞贴壁特性对 BMSCs 进行分离、纯化、体外传代培养。细胞恶性转化通过细胞形态、核型分析、双层软琼脂克隆形成实验、血清依赖性实验以及裸鼠成瘤实验进行验证。使用定制的家猪甲基化芯片和 Agilent 全基因组表达谱芯片，通过生物信息学分析获得第 2 代和第 25 代 BMSCs 全基因组甲基化表达水平和 mRNA 表达谱，并进行 mRNA-甲基化的关联分析，筛选 DNA 异常甲基化谱，同时对这些基因进行 KEGG 富集分析。

结果

长期培养的 BMSCs 逐渐表现出转化细胞的特性：由较大的纺锤形逐渐变为小的梭形，血清依赖程度显著降低，在双层软琼脂培养基中锚着独立生长并形成细胞集落，在裸鼠体内形成肿瘤组织。全基因表达谱芯片筛选出转化过程中上调表达的 257 条基因和下调表达的 315 条基因，信号通路分析发现部分细胞周期相关基因表达上调，部分细胞外基质受体相互作用（ECM-receptor interaction）、黏着斑通路（focal adhesion）、肌动蛋白细胞骨架调节（regulation of actin cytoskeleton）、癌症通路（pathways in cancer）、P53 等通路相关基因表达下调。DNA 甲基化芯片分析得到受甲基化调控的 962 条差异基因和 1 219 条受去甲基化的基因，并发现这些基因主要参与细胞代谢、增殖分化、细胞结构、炎性免疫、肿瘤发生等生物过程。联合分析 BMSCs 转化过程受甲基化调控的基因，发现 35 个基因的甲基化改变与表达变化方向相反（相关系数 r=–0.686，P=0.000），其中 21 个基因启动子区甲基化程度升高而基因表达下降，14 个基因启动子区甲基化程度下降而基因表达升高；同时 KEGG 富集分析发现多个受甲基化调控、参与干细胞分化的基因及参与的多个细胞信号通路，其中在 14 条甲基化下调而表达上调的基因中，很多具有调节肿瘤发生与免疫炎性相互平衡的作用，其中 CDKN3 启动子区甲基化状态改变可能与细胞肿瘤化密切相关。

结论

研究结果表明甲基化参与猪 BMSCs 自发转化，这为 BMSCs 临床应用预警和防止转化提供了新线索。

BMSCs 具有自我更新、增殖及多向分化的潜能，在体外可被诱导分化为骨、软骨、肌肉、脂肪和神经等组织细胞，还能进行遗传修饰，成为再生医学、组织工程和基因治疗领域研究的热点。BMSCs 体内应用的一个重要前提是体外安全和高效的扩增。BMSCs 经过体外长期培养，其生物学特性的改变和安全性值得关注^[1]。研究发现 BMSCs 在体外长期培养后会自发恶性转化^[2-8]，且 BMSCs 参与了肿瘤的形成^[9-13]，然而其分子机制并不是很清楚。为了深入探讨 BMSCs 自发恶性转化的表观遗传学作用机制，本研究利用 DNA 甲基化芯片和全基因组表达谱芯片技术，分析 BMSCs 转化过程中 DNA 甲基化谱和基因表达谱的改变，并通过联合分析探讨 DNA 甲基化的作用机制。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及主要试剂、仪器

3 月龄雌性长白猪 6 头，体质量约 50 kg；4～6 周龄雄性 NOD/SCID 小鼠 20 只，体质量 15～25 g；均由丹麦奥胡斯大学实验动物中心提供。

1.077 g/mL Ficoll-Paque Plus 分离液（Amersham 公司，美国）；DMEM 培养液（GIBCO 公司，英国）；FBS（Bio Whittaker Europe 公司，比利时）；胰蛋白酶、EDTA（Sigma 公司，美国）；Trizol 试剂、DNase Ⅰ（Invitrogen 公司，英国）；ND-1000 分光光度仪（Nanodrop 公司，美国）；QIAamp DNA mini Kit（DNA 提取试剂盒；Qiagen 公司，德国）；安捷伦猪表达谱基因芯片（Agilent Pig 4x44K Gene Expression Microarray，表示 44 000 个探针）、定制的家猪甲基化芯片（包括 22 017 个基因启动子）（上海康成生物工程有限公司设计）。塑料培养瓶、板（Nunc 公司，丹麦）；玻片式细胞培养皿（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）。倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；荧光显微镜（ Zeiss 公司，德国）；Agilent Scanner G2505B 扫描仪（Agilent 公司，美国）；GeneSpring GX v11.5.1 软件包（Agilent Technologies 公司，美国）；NimbleScan v2.5 软件（Roche-NimbleGen 公司，瑞士）。Agilent Array 平台（上海康成生物工程有限公司设计订购）。

1.2. BMSCs 分离培养

收集长白猪胫骨近端 15 mL 骨髓置于肝素化试管内，取 6 mL 骨髓分装于含 4 mL Ficoll-Paque Plus 分离液的离心管内，室温下以 400×g 离心 30 min；收集中间层有核细胞，PBS 稀释后以 100×g 离心 10 min，共 2 次，悬于 DMEM 培养液中并计数。将 1×10⁷ 个细胞接种于 75 cm² 塑料培养瓶中，加入 12 mL 含 10% 经灭活处理的 FBS 的 DMEM 培养液，置于 37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱培养；3 d 后更换培养液，弃去未贴壁细胞；随后每隔 3～4 d 换液，倒置显微镜下观察细胞生长情况。待接近融合时，吸去培养液，PBS 冲洗后，用 0.125% 胰蛋白酶-5 mmol/L EDTA 于 37℃ 消化 4 min，以 400×g 离心 10 min，弃上清液，进行传代培养，倒置显微镜观察细胞形态变化。

1.3. 正常 BMSCs 与恶性转化的 BMSCs 生物学特性观察

1.3.1. 核型分析

分别把第 4 代和第 30 代约 2×10⁵ 个细胞种植到玻片式细胞培养皿上，第 2 天更换细胞培养液为含秋水仙酰胺（终浓度 10 ng/mL）的 DMEM 培养液培养约 50 min；然后，细胞直接在玻片式细胞培养皿中按照下列步骤进行固定：① 用不含钙镁离子的 PBS 冲洗细胞；② 细胞在 60 mmol/L KCl 溶液中低渗 20 min；③ 浓度梯度固定细胞，依次在 17%、38%、58% 和 100% 醋酸∶乙醇（1∶3）固定液中分别固定 5、5、5、40 min。染色体使用 0.1 μg/μL DAPI 进行染色 10 min，显微镜下观察。

1.3.2. 双层软琼脂克隆形成实验

将 DMEM（2×）培养液与 1.2% 琼脂 1∶1 混合后，作为下层琼脂铺于 24 孔板，室温凝固后 37℃ 平衡备用。分别将第 2 代与第 25 代 BMSCs 以 500 个/孔密度接种于含 0.6% 琼脂的 DMEM 培养基中，铺于下层琼脂上。每组设计 3 个平行孔，培养 21 d 后进行 Mayers 苏木素染色，光镜观察克隆形成。此外进行钙黄绿素/乙锭均二聚物-1（calcein-AM/ethidium homodimer-1，calcein-AM/EthD-1）荧光双染，荧光显微镜下观察克隆细胞活/死细胞情况。

1.3.3. 血清依赖性实验

分别将第 2 代和第 25 代 BMSCs 以 2×10⁵个/孔密度接种于含 10%FBS 的 DMEM 培养基的 24 孔板中，每代 3 个平行孔；24 h 后弃去原培养基，以 PBS 洗涤 2 次后加入含 0.1%FBS 的 DMEM 培养基，培养 10 d 后进行锥虫蓝染色并用 Bürker-Türk 血球计数板进行计数。

1.3.4. 小鼠体内致瘤实验

将含 2×10⁶个第 24 代 BMSCs 的 Matrigel 胶注入 NOD/SCID 小鼠皮下，8 周后处死，组织取出后切片，常规 HE 染色观察。

1.4. 基因表达谱检测

采用 Trizol 提取分别来自 6 头长白猪的第 2 代和第 25 代 BMSCs 的总 RNA，使用 NanoDrop ND-1000 分光光度仪检测总 RNA 量，用琼脂糖电泳验证完整性。使用 Agilent Array 平台检测基因表达谱。将 1 μg 总 RNA 扩增转录成荧光 cRNA，再与安捷伦猪表达谱基因芯片杂交。使用 Agilent Scanner G2505B 扫描仪扫描，结果使用 GeneSpring GX v11.5.1 软件包进行分析。

1.5. DNA 甲基化芯片分析

取第 2 代和第 25 代 BMSCs，采用定制的家猪甲基化芯片（包括 22 017 个基因启动子）按步骤依次进行杂交、洗片、扫描与分析操作，甲基化数据导入 NimbleScan v2.5 软件进行分析。

1.6. 统计学方法

两组间差异基因表达比较采用 t 检验，如果表达相差 2 倍及以上且有统计学意义，则认为该基因表达有显著差异，筛选出差异表达基因，采用 KEGG 数据库进行通路分析。采用 MEDME （modeling experimentaldata with MeDIP enrichment）筛选出组间差异性甲基化区域（组间比较采用 t 检验）。筛选出转化 BMSCs 基因启动子区甲基化程度升高和降低的基因个数，进一步采用 GoMiner 数据库行基因本体（gene ontology，GO）分析。DNA 异常甲基化基因与表达谱关联分析采用 Pearson 相关性检验。检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. 正常 BMSCs 与恶性转化的 BMSCs 生物学特性观察

2.1.1. 体外生长特征改变

第 1 代 BMSCs 细胞形态为较大的纺锤形，随传代次数增加，细胞形态逐渐变化为小的梭形。倍增时间由原代的（1.08±0.03）d 延长到第 4 代的（8.67±4.27）d，从 12 代开始又逐渐下降到（2.39±0.45）d。培养至 25 代累积细胞群体倍增值（将各代倍增时间累加）达（105.73±11.06）d。见图 1、2。

图 1.

Doubling time of each generation of BMSCs

各代次 BMSCs 倍增时间

图 2.

Morphology observation of each generation of BMSCs (Inverted microscope×100)

各代次 BMSCs 形态学观察（倒置显微镜×100）

a. 第 4 代；b. 第 12 代；c. 第 25 代

a. The fourth generation; b. The twelfth generation; c. The twenty-fifth generation

2.1.2. 核型分析

第 4 代 BMSCs 染色体数为 38 条，第 30 代 BMSCs 全部表现为三倍体，共 57 条染色体。见图 3。

图 3.

Karyotype analysis of BMSCs (×400)

BMSCs 核型分析（×400）

a. 第 4 代；b. 第 30 代

a. The fourth generation; b. The thirtieth generation

2.1.3. 双层软琼脂克隆形成实验

第 2 代 BMSCs 在软琼脂上基本不形成或形成很少的细胞克隆，而第 25 代 BMSCs 形成大量大小不一的细胞克隆。见图 4、5。

图 4.

Optical microscope observation of cloning formation experiment on the double layer soft agar of the twenty- fifth generation cells (×25)

第 25 代细胞双层软琼脂克隆形成实验光镜观察（×25）

图 5.

Cloned cell live/death observation by calcein-AM/EthD-1 fluorescence double staining

Calcein-AM/EthD-1 荧光双染观察克隆细胞活/死细胞情况

a. 第 2 代细胞（荧光显微镜×200）；b. 第 25 代细胞（荧光显微镜×20）；c. 第 25 代细胞其中 1 个细胞克隆（荧光显微镜×100）

a. The second generation cells (Fluorescence microscope×200); b. The twenty-fifth generation cells (Fluorescence microscope×20); c. One cell clone in twenty-fifth generation cells (Fluorescence microscope×100)

2.1.4. 血清依赖性实验

当生长在低血清（0.1%FBS）DMEM 培养液下，第 25 代 BMSCs 的细胞活性为 71.6%±10.9%，而第 2 代 BMSCs 细胞活性只有 5.2%±2.1%。

2.1.5. 小鼠体内致瘤实验

注射 8 周小鼠背部有包块形成，取组织行 HE 染色示淋巴细胞、浆细胞中可见散在分布的大体积细胞，其细胞质丰富、嗜酸性，细胞核形态多样，呈多角形或分叶状，并可见核分裂象。见图 6。

图 6.

HE staining observation at 8 weeks after subcutaneous injection of twenty-fourth generation BMSCs on the back of mice

小鼠背部皮下注射第 24 代 BMSCs 后 8 周 HE 染色观察a. ×25；b. ×100

a. ×25; b. ×100

2.2. 基因表达谱检测

全基因表达谱芯片筛选出 BMSCs 转化过程中上调表达的 257 条基因（信号比倍数>2，P<0.05）和下调表达的 315 条基因（信号比倍数<0.5，P<0.05），信号通路分析发现部分细胞周期相关基因表达上调，部分细胞外基质受体相互作用（ECM-receptor interaction）、黏着斑通路（focal adhesion）、肌动蛋白细胞骨架调节（regulation of actin cytoskeleton）、癌症通路（pathways in cancer）、P53 等通路相关基因表达下调。见图 7。此外，BMSCs 自发转化后，在干细胞的自我更新、多向分化潜能等生物学特性中扮演重要角色的 Hedgehog、Wnt、TGF-β/BMPs 等信号转导通路上的若干基因的表达谱发生了变化，提示这些信号转导通路可能在 BMSCs 自发转化中起到重要作用。见图 8。

图 7.

Cell cycle signal pathway

细胞周期信号通路

图 8.

Hedgehog/Wnt/TGF-β/signaling pathway

Hedgehog/Wnt/TGF-β 信号转导通路

2.3. DNA 甲基化芯片分析

转化 BMSCs 基因启动子区甲基化程度升高的基因有 962 个，其中 383 个属于高密度 CpG 启动子区（high CpG density promoters，HCP），262 个属于中等密度 CpG 启动子区（intermediate CpG density promoters，ICP），317 个属于低密度 CpG 启动子区（low CpG density promoters，LCP）。基因启动子区甲基化程度降低的基因有 1 219 个，其中 661 个属于 HCP，320 个属于 ICP，238 个属于 LCP。我们进一步对其生物过程进行分析，发现 DNA 甲基化的改变主要参与细胞代谢、增殖分化、细胞结构、炎性免疫、肿瘤发生等生物过程。见图 9。

图 9.

GO analysis of differentially methylated genes expression

DNA 甲基化芯片扫描 GO 分析

采用 DNA 甲基化芯片和基因芯片联合分析 BMSCs 经长期培养后受甲基化调控的基因，即表达谱基因下调表达的与 DNA 甲基化相关的基因，和表达谱基因上调表达的与 DNA 去甲基化相关的基因进行整合，结果发现，35 个基因的甲基化改变与表达变化方向相反（r=–0.686，P=0.000）；其中 21 个基因启动子区甲基化程度升高而基因表达下降，14 个基因启动子区甲基化程度下降而基因表达升高。KEGG 分析发现 CDKN3、Cyclinb2、CDK1、CDK4、runx1t1、cdk2ap1 等表达异常改变参与了细胞周期的调控。此外，在 14 条甲基化下调而表达上调的基因中，很多具有调节肿瘤发生与免疫炎性相互平衡的作用，与上述有关的基因主要有 ACTC1、actin-α1、CDKN3、B2M 等。其中 CDKN3 启动子区甲基化状态改变，可能与细胞肿瘤化密切相关。见图 10。

图 10.

P53/RB-E2F signaling pathway

P53/RB-E2F 信号通路

3. 讨论

本研究中长白猪 BMSCs 在体外长期培养下，逐渐表现出转化细胞的特性：对培养液中血清依赖程度显著降低，能够在双层软琼脂培养基中锚着独立生长并形成细胞集落，并且植入裸鼠皮下形成肿瘤组织，这一现象表明 BMSCs 获得了肿瘤的生物学特性。目前，一般认为 BMSCs 恶性转化与染色体的不稳定性有关^{[2, 6, 9-10, 14]}。研究表明，P53、CDKN2 丢失^{[8, 14]}，c-Myc 高表达^[6]与 BMSCs 恶性转化关系密切。最近研究表明免疫相关蛋白 P62 通过 Ras 通路参与人 BMSCs 的恶性转化^[15]。Rubio 等^[16]采用基因芯片分析发现，BMSC 自发恶性转化与癌基因、抑癌基因、线粒体代谢活性、DNA 损伤-修复相关蛋白及细胞周期调控因子变化有关。肿瘤相关信号通路的异常参与了体外培养的 BMSCs 的转化^[17]。国内高芸等^[18]研究也发现，Wnt、SonicHed-gehog、Notch、TGF-β/BMPs 等信号转导通路上的若干基因在大鼠 BMSCs 自发恶性转化中起到重要作用。然而，越来越多研究表明，异常的 DNA 甲基化为肿瘤发生的早期变化，与多种肿瘤的发生、发展密切相关。Teng 等^[19]最近研究表明，靶向 2 个肿瘤抑制基因 HIC1 和 RassF1A 甲基化能将 BMSCs 转化为肿瘤起源细胞，进一步提示甲基化在肿瘤启动中起重要作用。这些研究仅集中在普遍接受的特异性定向分化的基因，没有在整个基因组水平进行全面扫描，导致遗漏一些受 DNA 甲基化调控的非常规分化相关基因。而且，结合基因表达谱芯片和 DNA 甲基化芯片，在 BMSCs 转化过程中，启动子受 DNA 甲基化调控的差异表达的基因表达谱，及是否存在一系列受甲基化调控的 BMSCs 转化的关键调节因子，目前还不清楚。有关 BMSCs 转化的表达谱研究很多^[16-18]。Choi 等^[20]比较了早期 BMSCs 和晚期衰老 BMSCs 甲基化水平，发现甲基化水平存在明显差异，并发现与 DNA 复制、细胞周期及过氧化物酶体增殖物活化受体信号通路相关基因的高甲基化，可能是导致 BMSCs 衰老的重要原因。通过高通量全基因组联合高通量甲基化研究，可以更细节性地捕捉到关键基因或者是信号转导通路，对细胞转化发生机制的研究有极大帮助。本研究首次应用定制的家猪启动子区 CpG 岛甲基化芯片研究 BMSCs 自发转化中的甲基化状态，并联合全基因组表达谱结果找出与 DNA 甲基化状态相关的差异表达甲基化情况，将有利于探讨整个表观遗传的改变。

本研究甲基化芯片实验结果发现，BMSCs 自发转化后受甲基化调控的基因主要参与细胞代谢、增殖分化、细胞结构、炎性免疫、肿瘤发生等生物过程。联合分析 BMSCs 转化过程受甲基化调控的基因，发现参与调控细胞周期的基因 CDKN3、Cyclinb2、CDK1、CDK4、runx1t1、cdk2ap1 等表达异常改变，其中 CDKN3 启动子区甲基化状态改变，可能与细胞肿瘤化密切相关。CDKN3 是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子中的一种，作为细胞周期蛋白依赖性激酶的负调节蛋白，是细胞周期调控网络中的重要一环。在正常的细胞周期中，CDKN3 主要是作为 CDK2 的抑制因子，在 G₁～S 期与 CDK2 稳定结合，来参与细胞周期的调节，阻滞细胞周期。CDK2 充分活化需要 Thr160 的磷酸化和 Tyr15、Thr14 的去磷酸化，而 pThr160 的去磷酸化是 CDK2 失活的关键。CDKN3 通过其 C-末端螺旋与 CDK2 C-末端的叶状结构域结合，促使 CDK2 T 环处的 pThr160 区域伸展暴露，完成去磷酸化。CDKN3 被证实在多种人类恶性肿瘤中表达异常，深入研究 CDKN3 及其甲基化作用机制，将为进一步揭示 BMSCs 恶性转化发生、发展的表观遗传学机制提供理论依据，为 BMSCs 临床应用预警和防止转化提供新线索。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（81000676、81660364）；江西省青年科学基金（2012ZBAB205004）

National Natural Science Foundation of China (81000676, 81660364); Youth Science Fund of Jiangxi Province (2012ZBAB205004)