Abstract
目的
探讨脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）及血管内皮细胞（endothelial cells，ECs）对脂肪移植术后血管新生及脂肪成活的影响。
方法
取乳房切除术患者自愿捐赠的脂肪组织，采用胶原酶消化法分离培养 ADSCs，取第 3 代细胞进行实验；同时制备游离脂肪颗粒。取健康 4～6 周龄雄性裸鼠 80 只，随机分为 4 组（n=20），分别于裸鼠背部皮下注射 1 mL 脂肪颗粒+0.3 mL 生理盐水（对照组）、1 mL 脂肪颗粒+2×106 个人脐静脉内皮细胞株（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）+0.3 mL 生理盐水（ECs 组）、1 mL 脂肪颗粒+2×106 个 ADSCs+0.3 mL 生理盐水（ADSCs 组）、1 mL 脂肪颗粒+1×106 个 HUVECs+1×106 个 ADSCs+0.3 mL 生理盐水（ADSCs+ECs 组）。注射后观察各组裸鼠存活情况，大体观察背部移植区色泽、形状。2、4、8、12 周时背部移植区行超声影像学观察，取标本采用排水法测量其体积，组织学观察移植脂肪大体结构变化情况，免疫荧光染色观察血管新生情况。
结果
各组裸鼠均存活至实验完成。移植后各时间点各组超声检测结果无明显差异，移植脂肪内部均未见明显血流信号，未见囊肿、钙化、实性占位等异常表现。移植后各时间点，ADSCs 组及 ADSCs+ECs 组移植脂肪体积均高于 ECs 组及对照组（P<0.05）；且 8、12 周时 ADSCs 组明显高于 ADSCs+ECs 组（P<0.05）。HE 染色示移植后各组组织学形态变化趋势相似，但 ADSCs 组组织重塑速度快于其他各组。免疫荧光染色示随时间延长各组新生血管逐渐增加，各时间点 ECs 组、ADSCs 组、ADSCs+ECs 组微血管密度均高于对照组（P<0.05）；4 周时 ADSCs 组微血管密度高于 ECs 组及 ADSCs+ECs 组（P<0.05）；8、12 周时 ADSCs 组及 ADSCs+ECs 组高于 ECs 组（P<0.05），ADSCs 组及 ADSCs+ECs 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
结论
ADSCs 可提高移植脂肪存活率，且该促进作用可能与促进血管新生相关。
Keywords: 脂肪移植, 血管内皮细胞, 脂肪来源干细胞, 裸鼠
Abstract
Objective
To investigate the effects of adipose-derived stem cells (ADSCs) and endothelial cells (ECs) on the survival and neovascularization of fat tissue transplants.
Methods
The ADSCs were isolated by collagenase digestion from the adipose tissues voluntarily donated by the patients undergoing mastectomy, and subcultured. The passage 3 ADSCs were used for subsequent experiments. The residual fat tissues were used to prepare fat particles (FPs). The human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were used as ECs for subsequent experiments. Eighty healthy male nude mice, aged 4-6 weeks, were randomly divided into 4 groups (n=20). The mice were received subcutaneous injection at the dorsum of 1 mL FPs+0.3 mL normal saline (NS) in control group, 1 mL FPs+2×106 ECs+0.3 mL NS in ECs group, 1 mL FPs+2×106 ADSCs+0.3 mL NS in ADSCs group, and 1 mL FPs+1×106 ECs+1×106 ADSCs+0.3 NS in ADSCs+ECs group. General observations of the injection sites were performed, and the survival of the mice was recorded. At 2, 4, 8, and 12 weeks after injection, grafted fat tissues were firstly assessed by ultrasonography, then they were collected for volume measurement (water displacement method) and histology observation (HE staining and immunofluorescence staining).
Results
All mice survived until the end of experiment. At each time point, no significant difference was noted between groups in ultrasonography assay. There was no significant blood flow signal in the grafted fat tissues, or cysts, calcification, solid occupying in recipient area. Generally, the volume of grafted fat tissues decreased with time in all groups. Specifically, the volumes of grafted fat tissues were larger in ADSCs group and ADSCs+ECs group than that in control group and ECs group (P<0.05) at each time point, and in ADSCs group than in ADSCs+ECs group (P<0.05) at 8 and 12 weeks. HE staining showed that all groups had similar tendencies in general histology changes, and remodeling in ADSCs group was the fastest than in the other groups. By immunofluorescence staining for neovascularization, the new vessels in all groups were increasing with time. The vessel densities were higher in ECs group, ADSCs group, and ADSCs+ECs group than in control group (P<0.05) at each time point, in ADSCs group than in ECs group and ADSCs+ECs group (P<0.05) at 4 weeks, in ADSCs group and ADSCs+ECs group than in ECs group (P<0.05) at 8 and 12 weeks.
Conclusion
ADSCs can significantly increase the survival of transplanted fat tissue, which may be related to promoting the neovascularization.
Keywords: Fat grafting, endothelial cells, adipose-derived stem cells, nude mouse
血管新生不足是限制脂肪移植成活的主要因素，实现快速且广泛的毛细血管新生是提高脂肪移植成活率的重要策略[1]。脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）及血管内皮细胞（endothelial cells，ECs）与血管新生密切相关[2-3]。体外研究证实，ECs 可促进血管新生，并可通过细胞因子的旁分泌等作用机制与 ADSCs 产生协同作用[4-6]。本研究旨在初步探索 ADSCs 及 ECs 在提高移植脂肪血管生成以及移植脂肪成活中的作用。
1. 材料与方法
1.1. 实验动物及主要仪器
健康 4～6 周龄雄性裸鼠 80 只，体质量 14～19 g，由成都达硕生物科技有限公司提供。脂肪组织均由四川大学华西医院乳腺外科行乳房切除术的早期乳腺癌患者自愿捐赠，脂肪组织置于无菌 PBS 缓冲液在离体 2 h 内运送至实验室。实验所用 ECs 为 EA.hy926 人脐静脉内皮细胞株（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），购自上海赛百慷生物技术有限公司。Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件（Media Cybernetics 公司，美国）；超声检测仪（Philips 公司，荷兰）。
1.2. ADSCs 分离及培养
参照课题组前期细胞培养方法[7]分离培养 ADSCs。将患者自愿捐赠的脂肪组织取部分置于 1 mg/mL Ⅰ型胶原酶震荡消化 30～40 min，加入等体积 DMEM/F12 培养基终止消化。组织消化液以 200×g 离心 5 min，下层片状沉淀即为 ADSCs。经体外培养后选择第 3 代细胞进行实验。
1.3. 实验分组及方法
将 80 只裸鼠随机分为 4 组，每组 20 只，分别为对照组、ECs 组、ADSCs 组、ADSCs+ECs 组。取部分患者自愿捐赠的脂肪组织，采用眼科剪和眼科镊剔取脂肪颗粒，然后剪至匀浆状，移入离心管中，以 280×g 离心 5 min，取中间层脂肪，即为游离脂肪颗粒[7]。使用 1 mL 注射器针筒将 1 mL 脂肪颗粒移入安瓿瓶中，根据分组在安瓿瓶另加入 0.3 mL 生理盐水（对照组）、2×106 个 HUVECs+0.3 mL 生理盐水（ECs 组）、2×106 个 ADSCs+ 0.3 mL 生理盐水（ADSCs 组）、1×106 个 HUVECs+1×106 个 ADSCs+ 0.3 mL 生理盐水（ADSCs+ECs 组），摇匀。脂肪注射方法参考 Coleman 技术[8]，具体步骤：取 8 号（0.8 mm）注射器穿刺入裸鼠背部皮下，建立长度约 2 cm 的皮下通道，回抽未见回血后，将制备的各组游离脂肪颗粒缓慢注射至裸鼠背部皮下。注射后裸鼠正常饲养。于术后 2、4、8、12 周，每组各取 5 只裸鼠进行观测。
1.4. 观测指标
1.4.1. 大体及超声检查
注射后观察各组裸鼠存活情况，大体观察背部移植区色泽、形状。各时间点，室温条件下采用超声检测仪对移植区行影像学检测，观察移植区有无囊肿、实性结节、液化坏死等异常。
1.4.2. 移植脂肪体积测量
超声检查后使用颈椎脱臼法处死裸鼠，于背部作切口剥离移植物，通过排水法测量移植脂肪体积。
1.4.3. 组织学观察
取移植脂肪置于 4% 多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，片厚 5 μm。取部分切片行常规 HE 染色，光镜下观察各组移植脂肪结构变化。
1.4.4. 免疫荧光染色观察
取各组剩余切片行 CD31 免疫荧光染色，评估移植脂肪内微血管新生情况。其中红色荧光为新生血管内皮细胞 CD31 染色，蓝色荧光为细胞核 DAPI 染色。于 200 倍镜下，各组各时间点取 3 张切片，每张切片随机选取 5 个视野，计数微血管，以视野内形成明显完整血管结构的区域视作 1 个微血管。使用 Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件，计算移植脂肪内单位面积微血管数（个/mm2）。
1.5. 统计学方法
采用 SPSS18.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法；检验水准 α=0.05。
2. 结果
2.1. 大体及超声观察
各组裸鼠均存活至实验完成，无手术相关并发症发生。大体观察见各组裸鼠背部脂肪移植区皮肤色泽正常，注射部位局部呈半球形隆起，该隆起随时间延长进行性缩小，组间变化无明显差异。见图 1。
图 1.
General observations of the grafted fat tissue in each group at 12 weeks after injection
移植后 12 周各组大体观察
从左至右分别为对照组、ECs 组、ADSCs 组、ADSCs+ECs 组 a. 移植脂肪受区；b. 移植脂肪标本
From left to right for control group, ECs group, ADSCs group, ADSCs+ECs group a. Recipient area; b. Grafted fat tissue
超声检测示各组无明显差异，移植脂肪呈半椭圆形弱回声团块，内部均未见明显血流信号，未见囊肿、钙化、实性结节等异常表现，部分脂肪内部可观察到无回声病灶（脂肪液化）。移植后 2 周，移植脂肪内部回声粗糙、不均匀，边界较清，形态欠规则，周边无明显包膜；4 周时移植脂肪内部回声较前均匀，形态规则，周边出现强回声包膜；8 周时移植脂肪内部回声均匀，轮廓清晰，周边强回声包膜增厚；12 周时各组移植脂肪回声均匀，接近正常脂肪组织，外周可见完整强回声包膜。见图 2。
图 2.
Ultrasonography observation of each group after injection
移植后各组超声检查
从左至右分别为对照组、ECs 组、ADSCs 组、ADSCs+ECs 组 a. 2 周；b. 4 周；c. 8 周；d. 12 周
From left to right for control group, ECs group, ADSCs group, ADSCs+ECs group a. Two weeks; b. Four weeks; c. Eight weeks; d. Twelve weeks
2.2. 移植脂肪体积测量
随时间延长各组移植脂肪体积均呈进行性缩小趋势，其中 ADSCs 组体积缩小最慢、ADSCs+ECs 组次之、ECs 组及对照组下降最快。移植后各时间点，ADSCs 组及 ADSCs+ECs 组移植脂肪体积均高于 ECs 组及对照组，比较差异有统计学意义（P<0.05）；ECs 组与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。移植后 2、4 周，ADSCs 组及 ADSCs+ECs 组比较差异无统计学意义（P<0.05）；8、12 周时，ADSCs 组明显高于 ADSCs+ECs 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
图 3.
The volume of grafted fat tissue in each group after injection
移植后各组移植脂肪体积
2.3. 组织学观察
移植后各组组织学形态变化趋势相似，移植后 2 周移植脂肪由大小不一的空腔状脂肪囊泡构成，局部有液化坏死，部分脂肪细胞间质及脂肪团块周围少许纤维结缔组织形成，内可见少量细小新生血管，周围大量炎性细胞浸润；4 周时脂肪细胞间及周围纤维结缔组织较前增加，新生血管数量增加，炎性细胞减少；8 周时脂肪细胞清晰可见，大小较前均一，液化坏死区范围缩小，新生血管易见，管状结构明显，管径更粗，炎性反应消退；12 周时脂肪细胞形态规整，液化坏死少见，镜下见脂肪细胞间及周围纤维结缔组织内大量成熟血管呈完整的管状结构。但 ADSCs 组组织重塑速度快于其他各组，各时间点新生血管更多，脂滴大小更均一；ECs 组与 ADSCs+ECs 组重塑速度较 ADSCs 组稍慢，对照组组织重塑速度最慢且脂滴大小较为不均。见图 4。
图 4.
Histology observation of each group after injection (HE×200)
移植后各组组织学观察（HE×200）
从左至右分别为对照组、ECs 组、ADSCs 组、ADSCs+ECs 组 a. 2 周；b. 4 周；c. 8 周；d. 12 周
From left to right for control group, ECs group, ADSCs group, ADSCs+ECs group a. Two weeks; b. Four weeks; c. Eight weeks; d. Twelve weeks
2.4. 免疫荧光染色观察
随时间延长各组新生血管逐渐增加，见图 5。各时间点，ECs 组、ADSCs 组、ADSCs+ECs 组微血管密度均高于对照组，比较差异有统计学意义（P<0.05）。移植后 2 周，ECs 组、ADSCs+ECs 组及 ADSCs 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；4 周时，ADSCs 组微血管密度高于 ECs 组及 ADSCs+ECs 组（P<0.05），ECs 组及 ADSCs+ECs 组间差异无统计学意义（P>0.05）；8、12 周时，ADSCs 组及 ADSCs+ECs 组微血管密度高于 ECs 组（P<0.05），ADSCs 组及 ADSCs+ECs 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 6。
图 5.
Immunofluorescence staining observation of each group after injection (×200)
移植后各组免疫荧光染色观察（×200）
从左至右分别为对照组、ECs 组、ADSCs 组、ADSCs+ECs 组 a. 2 周；b. 4 周；c. 8 周；d. 12 周
From left to right for control group, ECs group, ADSCs group, ADSCs+ECs group a. Two weeks; b. Four weeks; c. Eight weeks; d. Twelve weeks
图 6.
The vessel density of each group after injection
移植后各组微血管密度
3. 讨论
在成熟脂肪组织内部，毛细血管网分布广泛，每个脂肪细胞周围都存在一个或多个毛细血管[9]，脂肪细胞的增生和生长分别依赖于持续性的毛细血管网的新生和旧有血管的扩张和重塑。在生理环境中，ECs 作为血管和淋巴管道的外壁，发挥着维持血管和淋巴管内外稳态的作用。针对这一情况，有学者提出了促血管化治疗这一概念，旨在通过使用生长因子和细胞辅助疗法，使严重缺血的组织获得更好血供[10]。
目前研究证实，ADSCs 具有多向分化潜能，并通过分泌多种细胞因子促进移植脂肪成活[11]。而且 ADSCs 可通过旁分泌途径对脂肪组织中固有 ECs 进行调控，达到增加新生血管数量及提高移植脂肪组织成活的目的[5, 12]。本研究中，通过脂肪体积测量及新生血管观察发现，ADSCs 能提高游离移植脂肪组织内的血管密度，提高移植物成活率，这与 Choi 等[13]的研究结果一致。但 ADSCs 组脂肪体积测量结果提示 ADSCs 促脂肪成活效果不及 Yoshimura 等[14]和 Kølle 等[15]的研究，分析可能与加入的 ADSCs 浓度较低且观察时间较短有关。Yoshimura 等[14]的研究显示，不同浓度 ADSCs 辅助脂肪移植术后 1 年，脂肪成活率为 40%～80%。因此，ADSCs 辅助脂肪移植时，细胞制备方法以及适宜浓度仍需要探讨。同时，也亟需进一步研究来明确 ADSCs 辅助脂肪移植过程中，其发挥的生理功能和作用机制。
ECs 是血管形成过程中的重要因素。多项研究证实，ECs 能够加速脂肪移植早期的血管化进程[2-3, 16-17]。本研究中，ECs 组各时间点微血管密度均高于对照组，但移植脂肪体积与对照组无统计学差异，提示 ECs 辅助脂肪移植以促进血管新生为主，而对移植脂肪成活的改善不明显，这可能与添加细胞数量的差异有关。Luo 等[16]研究表明移植脂肪净重及新生血管形成随着 ECs 浓度增加而提高，且随时间延长，加入 4×106 个 ECs 的实验组剩余移植脂肪净重反而略有提高，而本研究 ECs 组添加数量为 2×106 个。因此，下一步需要探索 ECs 辅助脂肪移植的适宜浓度及作用机制，明确移植区血管密度与组织活性的关系。
研究证实，ADSCs 和 ECs 在成血管方面具有协同作用 [4-5, 12]。本研究中，通过对 ECs 组、ADSCs 组及 ADSCs+ECs 组新生血管密度及移植脂肪体积比较，发现在保证接种细胞数量一致的前提下，移植后各组各时间点移植脂肪体积和新生血管数量随 ADSCs 细胞比例和数量的提高而增加。Strassburg 等 [12]提出 ADSCs 在移植早期主要通过细胞间的旁分泌信号通路激活组织中 ECs，而非直接分化为 ECs，参与调控脂肪移植早期的血管化进程，进而减少脂肪缺血性坏死。在本研究中，ECs 组移植脂肪组织中仅有少量固有 ADSCs，对 ECs 的调控作用弱，血管密度增长缓慢。ADSCs+ECs 组与 ADSCs 组比较，移植物内微血管密度随 ADSCs 细胞数量绝对值的增加而显著增多，提示新生血管的生成与 ADSCs 的数量密切相关，且 ECs 的成血管作用受 ADSCs 调控。
综上述，本研究结果发现，ADSCs 可提高移植脂肪存活率，且该促进作用可能与促进血管新生相关。当添加本研究中细胞数量级的前提下，ADSCs 促进移植脂肪成活及诱导新生血管的作用较 ECs 强。然而 ECs 及 ADSCs 最佳浓度及共添加比例对提高自体脂肪移植的术后效果，还需要更多研究证实。此外，细胞辅助自体脂肪移植的技术可行性及肿瘤安全性等问题也需要进一步研究。
References
- 1.Moustaki M, Papadopoulos O, Verikokos C, et al Application of adipose-derived stromal cells in fat grafting: Basic science and literature review. Exp Ther Med. 2017;14(3):2415–2423. doi: 10.3892/etm.2017.4811. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.Schechner JS, Nath AK, Zheng L, et al In vivo formation of complex microvessels lined by human endothelial cells in an immunodeficient mouse . Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(16):9191–9196. doi: 10.1073/pnas.150242297. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 3.Twardowski T, Fertala A, Orgel JP, et al Type Ⅰ collagen and collagen mimetics as angiogenesis promoting superpolymers. Curr Pharm Design. 2007;13(35):3608–3621. doi: 10.2174/138161207782794176. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 4.Strassburg S, Nienhueser H, Björn SG, et al Co-culture of adipose-derived stem cells and endothelial cells in fibrin induces angiogenesis and vasculogenesis in a chorioallantoic membrane model. J Tissue Eng Regen Med. 2016;10(6):496–506. doi: 10.1002/term.1769. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.Merfeld-Clauss S, Gollahalli N, March KL, et al Adipose tissue progenitor cells directly interact with endothelial cells to induce vascular network formation. Tissue Eng Part A. 2010;16(9):2953–2966. doi: 10.1089/ten.tea.2009.0635. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 6.Haug V, Torio-Padron N, Stark GB, et al Comparison between endothelial progenitor cells and human umbilical vein endothelial cells on neovascularization in an adipogenesis mouse model. Microvasc Res. 2015;97:159–166. doi: 10.1016/j.mvr.2014.10.005. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 7.田春祥, 范春娇, 陈晓禾, 等 骨骼肌无细胞基质的制备及其生物相容性研究. 中国修复重建外科杂志. 2012;26(6):749–754. [Google Scholar]
- 8.Colwell AS, Borud LJ Fat grafting to the breast revisited: safety and efficacy. Plast Reconstr Surg. 2008;121(2):701–702. [PubMed] [Google Scholar]
- 9.Christiaens V, Lijnen HR Angiogenesis and development of adipose tissue. Mol Cell Endocrinol. 2010;318(2):2–9. doi: 10.1016/j.mce.2009.08.006. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 10.Kalka C, Asahara T, Krone W, et al Angiogenesis and vasculogenesis. Therapeutic strategies for stimulation of postnatal neovascularization. Herz. 2000;25(6):611. doi: 10.1007/pl00001974. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.Zarei F, Negahdari B Recent progresses in plastic surgery using adipose-derived stem cells, biomaterials and growth factors. J Microencapsul. 2017;34(7):699–706. doi: 10.1080/02652048.2017.1370027. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 12.Strassburg S, Nienhueser H, Stark GB, et al Human adipose-derived stem cells enhance the angiogenic potential of endothelial progenitor cells, but not of human umbilical vein endothelial cells. Tissue Eng Part A. 2013;19(1-2):166–174. doi: 10.1089/ten.TEA.2011.0699. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 13.Choi JW, Kim SC, Park EJ, et al Positive effect of incubated adipose-derived mesenchymal stem cells on microfat graft survival. J Craniofac Surg. 2018;29(1):243–247. doi: 10.1097/SCS.0000000000004071. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 14.Yoshimura K, Asana Y, Aoi N, et al Progenitor-enriched adipose tissue transplantation as rescue for breast implant complications. Breast J. 2010;16(2):169–175. doi: 10.1111/j.1524-4741.2009.00873.x. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 15.Kølle SF, Fischer-Nielsen A, Mathiasen AB, et al Enrichment of autologous fat grafts with ex-vivo expanded adipose tissue-derived stem cells for graft survival: a randomised placebo-controlled trial. Lancet. 2013;382(9898):1113–1120. doi: 10.1016/S0140-6736(13)61410-5. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 16.Luo X, Cao W, Xu H, et al Coimplanted endothelial cells improve adipose tissue grafts’ survival by increasing vascularization. J Craniofac Surg. 2015;26(2):358–364. doi: 10.1097/SCS.0000000000001470. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 17.Koh YJ, Koh BI, Kim H, et al Stromal vascular fraction from adipose tissue forms profound vascular network through the dynamic reassembly of blood endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011;31(5):1141–1150. doi: 10.1161/ATVBAHA.110.218206. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]