Abstract
目的
研究虾青素对大鼠脊髓损伤后细胞凋亡的影响。
方法
144 只健康成年清洁级 SD 大鼠按随机数字表法分为实验组、对照组及假手术组 3 组，每组 48 只。对照组和实验组采用改良 Allen 法制作脊髓损伤模型，假手术组仅切开椎板不损伤脊髓。术后即刻实验组给予虾青素（75 mg/kg）灌胃，对照组和假手术组给予等量橄榄油灌胃，每日 2 次。术后 1 d 及 1、2、3、4 周采用 BBB 评分法评定大鼠运动功能；术后 24 h 采用硫代巴比妥酸法检测丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；术后 6、24、48 h 采用 TUNEL 法检测细胞凋亡指数（apoptosis index，AI）；术后 48 h 采用干湿重法测定脊髓组织含水量，计算脊髓损伤面积比，透射电镜观察脊髓组织超微结构，并采用 Kaptanoglu 评分法进行超微结构评分。
结果
术后各时间点对照组和实验组大鼠 BBB 评分均显著低于假手术组（P<0.05）；术后 1～4 周实验组大鼠 BBB 评分均显著高于对照组（P<0.05）。术后 24 h 对照组和实验组 MDA 含量显著高于假手术组，实验组显著低于对照组（P<0.05）；对照组和实验组 SOD 活性显著低于假手术组，实验组显著高于对照组（P<0.05）。术后各时间点对照组和实验组脊髓组织中 AI 显著高于假手术组，实验组显著低于对照组（P<0.05）。术后 48 h，对照组和实验组脊髓组织含水量、脊髓损伤面积比及超微结构评分均显著高于假手术组，实验组均显著低于对照组（P<0.05）。
结论
虾青素能够抑制脊髓损伤后的脂质过氧化，减轻脊髓损伤后细胞凋亡，减轻脊髓水肿，减少脊髓损伤面积，减轻脊髓组织病理学损伤，改善了脊髓损伤大鼠的运动功能，有效地保护了脊髓组织，具有明显的神经保护作用。
Keywords: 虾青素, 脊髓损伤, 细胞凋亡, 大鼠
Abstract
Objective
To study the effects of astaxanthin on the apoptosis after spinal cord injury in rats.
Methods
One hundred and forty-four healthy adult Sprague Dawley rats were divided into experimental group, control group, and sham group according to the random number table (n=48). In the control group and the experimental group, the modified Allen’s method was used to make the spinal cord injury model; in the sham group, only the lamina was cut without damaging the spinal cord. At immediate after operation, the rats in the experimental group were given intragastric administration of astaxanthin (75 mg/kg) twice a day; and the rats in the control group and the sham group were given equal amount of olive oil by gavage twice a day. BBB score was used to assess the motor function at 1 day and 1, 2, 3, and 4 weeks after operation. The malondialdehyde (MDA) content was determined by the thiobarbituric acid method at 24 hours after operation; and the activity of superoxide dismutase (SOD) was determined by the xanthine oxidase method. Apoptosis index (AI) was determined by TUNEL method at 6, 24, and 48 hours after operation. At 48 hours after operation, the water content of spinal cord was measured by dry-wet weight method, the lesion ratio of spinal cord was calculated, the ultrastructure of the spinal cord was observed by transmission electron microscopy, and ultrastructure scoring was performed using the Kaptanoglu score method.
Results
The BBB score in the control group and the experimental group was significantly lower than that in the sham group at each postoperative time point (P<0.05); and the BBB score in the experimental group were significantly higher than that in the control group at 1-4 weeks postoperatively (P<0.05). The MDA content in the control group and the experimental group was significantly higher than that in the sham group at 24 hours after operation, and in the experimental group was significantly lower than in the control group (P<0.05). The SOD activity in the control group and the experimental group was significantly lower than that in the sham group, and in the experimental group was significantly higher than in the control group (P<0.05). At each time point postoperatively, the AI in the control group and the experimental group was significantly higher than that in the sham group, and in the experimental group was significantly lower than in the control group (P<0.05). At 48 hours after operation, the water content of spinal cord, the lesion ratio of spinal cord, and the ultrastructure score in the control group and the experimental group were significantly higher than those in the sham group, and in the experimental group were significantly lower than in the control group (P<0.05).
Conclusion
Astaxanthin can inhibit the lipid peroxidation, reduce the apoptosis, reduce the spinal cord edema, reduce the spinal cord lesion, reduce the histopathological damage after spinal cord injury, and improve the motor function of rats with spinal cord injury, and protect the spinal cord tissue, showing an obvious neuroprotective effect.
Keywords: Astaxanthin, spinal cord injury, apoptosis, rat
虾青素是一种类胡萝卜素，广泛存在于生物界，是一种强效抗氧化剂，具有广泛的抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、预防心脑血管疾病和免疫调节作用[1-4]。近年研究表明，虾青素能明显减轻脑创伤、脑缺血性损伤、脑缺血再灌注损伤、帕金森综合征、Alzheimer 综合征等中枢神经系统损伤后的细胞凋亡，发挥神经保护作用[5-9]。但虾青素对脊髓损伤后的细胞凋亡是否有影响尚不清楚。为此，本研究旨在观察虾青素对大鼠脊髓损伤后细胞凋亡的影响，同时观察损伤脊髓组织超微结构改变及脊髓损伤大鼠的运动功能改变。
1. 材料与方法
1.1. 实验动物及主要试剂、仪器
健康成年清洁级 SD 大鼠 144 只，雌雄不限，体质量（280±20）g，由吉林大学动物实验中心提供。虾青素（Sigma 公司，美国），临用前溶于橄榄油中。丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；细胞凋亡检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。Motic Med 6.0 数码医学图像分析系统（厦门麦克奥迪实业集团有限公司）；JEM-1200EX 透射电镜（电子株式会社，日本）；LKB-5 型超薄切片机（LKB 公司，瑞典）。
1.2. 实验分组及方法
将 144 只 SD 大鼠按随机数字表法分为实验组、对照组及假手术组 3 组，每组 48 只。将大鼠以 1% 戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯卧并固定于鼠板手术台上，颈背部备毛、消毒铺巾后，以 T10 棘突为中心取背部后正中约 5 cm 长纵切口，依次切开皮肤、皮下组织，剥离椎旁肌肉，显露棘突及椎板。咬除 T10 棘突及全椎板至椎弓根部，部分咬除 T9 和 T11 椎板扩大椎管。假手术组直接缝合切口。实验组和对照组暴露约 20 mm 长脊髓，采用改良 Allen 法制作脊髓重物打击损伤模型。用自制的改良 Allen 打击装置以致伤能量 50 g·cm（冲击量为 5 g 重物从 10 cm 高度自由落下）造成大鼠脊髓损伤；造模成功标准：损伤处脊髓外观出血、水肿，大鼠尾巴痉挛性摆动、双下肢及躯体回缩扑动后，双下肢瘫；脊髓损伤造模成功后，逐层缝合切口。
术后即刻实验组给予虾青素（75 mg/kg[10]）灌胃，对照组和假手术组给予等量橄榄油灌胃，每日 2 次，连续灌胃至实验结束。给予 12 h∶12 h 的白天/夜间光照周期，自由进食粉状饲料及饮用自来水（不限饮水及进食），室温 25～27℃，每日 3 次人工膀胱排尿，直至形成反射性膀胱。
1.3. 观测指标
1.3.1. 运动功能评价
术后 1 d 及 1、2、3、4 周每组各取 6 只大鼠，进行 BBB 评分。由熟悉该评分标准的 2 名实验人员进行双盲法评分。
1.3.2. MDA 含量和 SOD 活性测定
术后 24 h 各组分别取 6 只大鼠麻醉后处死，取损伤段脊髓，以损伤点为中心切取脊髓组织 10 mm，称重后制备脊髓组织匀浆。采用硫代巴比妥酸法，根据 MDA 检测试剂盒说明方法测定 MDA 含量；采用黄嘌呤氧化酶法，根据 SOD 检测试剂盒说明方法测定 SOD 活性。
1.3.3. 细胞凋亡检测
术后 6、24、48 h 各组分别取 6 只大鼠，麻醉后剖胸、心脏插管、灌流固定，以损伤点为中心切取脊髓组织 10 mm，修剪后石蜡包埋连续切片，片厚 5 μm，严格按照细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，光镜下观察。凋亡细胞在原位末端标记后呈棕黄色，每张切片随机取 1 个高倍视野，按以下公式计算凋亡指数（apoptosis index，AI）：（凋亡细胞数/镜下细胞总数）×100%。以上观察由 2 名病理学专业人员根据双盲原则统计。
1.3.4. 脊髓组织水肿评价
用干湿重法测定脊髓组织含水量，评估脊髓组织水肿程度。术后 48 h 各组分别取 6 只大鼠麻醉后处死，取损伤段脊髓，以损伤点为中心低温切取 10 mm 脊髓组织冻存，称湿重（W）；然后于 80℃ 烤箱干燥 48 h，称干重（D）；重复 3 次后，取均值，按以下公式计算脊髓组织含水量：［（W–D）/W］×100%，数值大小与脊髓水肿程度成正相关。
1.3.5. 脊髓损伤面积测定
术后 48 h 各组分别取 6 只大鼠麻醉后处死，以损伤点为中心取损伤段脊髓，按光镜标本制作要求分步骤进行标本处理后，25 μm 厚切片，行常规 HE 染色，采用 Motic Med 6.0 数码医学图像分析系统，测量损伤处像素与脊髓横截面总像素，计算二者的比值作为脊髓损伤面积比。
1.3.6. 超微结构观察及评分
术后 48 h 各组分别取 6 只大鼠麻醉后处死，按透射电镜标本制作要求分步骤进行标本处理后，用 LKB-5 型超薄切片机切片，片厚 50～60 nm，用枸橼酸铅进行染色，JEM-1200EX 透射电镜观察。采用 Kaptanoglu 评分法[11]在 5 000 倍放大率下，对透射电镜标本进行超微结构评分，每个样本分别评估 20 个神经细胞、20 个轴突、20 个线粒体的超微结构改变，计算各组细胞质内水肿、细胞核损伤、轴突变性、髓鞘分解和线粒体损伤的评分。数值大小与脊髓损伤严重程度成正相关。由 2 名实验人员进行双盲法评分。
1.4. 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2. 结果
2.1. 运动功能评价
术后各时间点对照组和实验组大鼠 BBB 评分均显著低于假手术组，差异有统计学意义（P<0.05）；术后 1～4 周实验组大鼠 BBB 评分均显著高于对照组，差异亦有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表 1.
Comparison of BBB score of rats in each group at each time point after operation (n=6,
)
术后各时间点各组大鼠 BBB 评分比较（n=6，
）
| 组别
Group |
1 d | 1 周
One week |
2 周
Two weeks |
3 周
Three weeks |
4 周
Four weeks |
|
*与假手术组比较 P<0.05，#与对照组比较 P<0.05
*Compared with sham group, P<0.05;#compared with control group, P<0.05 | |||||
| 假手术组
Sham group |
18.8±0.4# | 21.0±0.0# | 21.0±0.0# | 21.0±0.0# | 21.0±0.0# |
| 对照组
Control group |
0* | 2.3±0.4* | 3.8±0.5* | 6.0±0.3* | 8.2±0.6* |
| 实验组
Experimental group |
0* | 4.2±0.6*# | 6.6±0.8*# | 9.8±0.5*# | 12.6±0.4*# |
| 统计值
Statistic |
F=13 254.000
P= 0.000 |
F=3 666.577
P= 0.000 |
F=1 722.607
P= 0.000 |
F=3 219.529
P= 0.000 |
F=1 464.000
P= 0.000 |
2.2. MDA 含量和 SOD 活性测定
术后 24 h，假手术组、对照组、实验组脊髓组织中 MDA 含量分别为（2.82±0.24）、（10.12±0.64）、（6.21±0.36）nmol/mg，对照组和实验组 MDA 含量显著高于假手术组，实验组 MDA 含量显著低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。假手术组、对照组、实验组脊髓组织中 SOD 活性分别为（35.63 ±1.76）、（17.83±1.21）、（31.56±1.46）U/mg，对照组和实验组 SOD 活性显著低于假手术组，实验组 SOD 活性显著高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.3. 细胞凋亡检测
术后各时间点假手术组均未见 TUNEL 标记阳性细胞；对照组可见较多 TUNEL 标记阳性细胞，累及灰质和白质，大小不一，分布不均匀；实验组可见较少 TUNEL 标记阳性细胞，见图 1。术后各时间点对照组和实验组脊髓组织中 AI 显著高于假手术组，实验组显著低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表 2。
图 1.
TUNEL staining in each group at 48 hours after operation (×200)
术后 48 h 各组 TUNEL 染色观察（×200）
a. 假手术组；b. 对照组；c. 实验组
a. Sham group; b. Control group; c. Experimental group
表 2.
Comparison of AI of rats in each group at each time point after operation (n=6, %,
)
术后各时间点各组 AI 比较（n=6，%，
）
| 组别
Group |
6 h | 24 h | 48 h |
|
*与假手术组比较 P<0.05，#与对照组比较 P<0.05
*Compared with sham group, P<0.05;#compared with control group, P<0.05 | |||
| 假手术组
Sham group |
0# | 0# | 0# |
| 对照组
Control group |
13.8±1.6* | 31.2±2.4* | 34.2±2.8* |
| 实验组
Experimental group |
10.4±1.2*# | 14.2±1.6*# | 18.4±2.1*# |
| 统计值
Statistic |
F=232.620
P= 0.000 |
F=527.913
P= 0.000 |
F=430.491
P= 0.000 |
2.4. 脊髓组织水肿评价
术后 48 h，假手术组、对照组、实验组脊髓组织含水量分别为 55.21%±1.89%、88.11%±4.12% 和 64.84%±3.06%，对照组和实验组脊髓组织含水量显著高于假手术组，实验组显著低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.5. 脊髓损伤面积测定
术后 48 h，假手术组、对照组、实验组的脊髓损伤面积比分别为 0、0.52±0.08 和 0.28±0.05，对照组和实验组脊髓损伤面积比显著高于假手术组，实验组显著低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.6. 超微结构观察及评分
术后 48 h 透射电镜观察示，假手术组脊髓组织无出血、水肿，表现为正常的脊髓灰质和白质，神经细胞、胶质细胞、神经纤维、膜性细胞器、轴突及髓鞘均呈现正常的超微结构。对照组脊髓组织明显出血、水肿；灰质内神经细胞的细胞核和胞质细胞器显著变性；白质内有髓神经纤维出现髓鞘分裂和轴突细胞器变化；毛细血管周围水肿，毛细血管内皮细胞呈现细胞器改变。实验组脊髓组织内部分区域可见间质水肿和出血，但较对照组程度轻；灰质内部分神经细胞胞膜细胞器空泡化，脂褐素颗粒聚集，胶质细胞结构基本正常；白质内部分有髓神经纤维髓鞘板层部分分离，大多数神经纤维呈现正常的超微结构；部分毛细血管周围水肿，但毛细血管内皮细胞结构正常。见图 2。
图 2.
Transmission electron microscope observation at 48 hours after operation (×5 000)
术后 48 h 各组透射电镜观察（×5 000）
a、b. 假手术组脊髓灰质和白质；c. 对照组脊髓白质；d. 实验组脊髓白质
a, b. The gray matter and white matter of spinal cord in the sham group; c. The white matter of spinal cord in the control group; d. The white matter of spinal cord in the experimental group
假手术组、对照组和实验组的超微结构评分分别为 0、8.68±0.32 和 3.12±0.16，对照组和实验组超微结构评分显著高于假手术组，实验组显著低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。
3. 讨论
脊髓损伤分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤是指脊髓受到暴力破坏后，神经细胞破碎、轴索断裂，细胞质膜破裂，内溶酶释放致细胞直接死亡。继发性损伤是在原发性损伤基础上发生的多种因素参与的序列性组织自毁性破坏过程。细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，是一种固有的自然生理过程，它通过清除死亡细胞和代谢产物维持人体各系统组织的稳定。大量研究已证实了细胞凋亡是继发性脊髓损伤的重要组成部分，不管是人还是动物，继发性损伤中出现的神经元和神经胶质细胞死亡都是继发细胞凋亡的结果。1996 年 Li 等[12]首先证实了脊髓损伤后存在细胞凋亡，作者在压迫性脊髓损伤模型中，运用原位末端标记法（TUNEL 法），发现于损伤后 4 h 开始损伤头尾侧脊髓白质内数量较多的阳性细胞，标记细胞高峰出现在损伤后 1 周，损伤后 3 周阳性细胞仍可见。同样，Yong 等[13]也观察到大鼠脊髓严重挫伤后诱发的细胞凋亡现象，并发现其凋亡细胞以神经元、星形细胞、少突神经胶质细胞和小胶质细胞为主。有学者对大鼠脊髓挫伤后 5 min～30 d 不同时间段进行了连续观察研究[14]，脊髓损伤后 5 min 就出现中央损伤区，但无凋亡细胞；4 h 后损伤区内神经元中发现凋亡细胞，8 h 达到高峰。神经胶质细胞中的凋亡细胞在伤后 4 h 出现，24 h 达到高峰。损伤后 1 周内，最初的损伤区进行性扩大，并出现空洞，同时有更多神经元和神经胶质细胞相继死亡。Liu 等[14]认为这种病理现象过程可能与残存轴突脱髓鞘改变有关。Crowe 等[15]研究表明，中枢神经系统损伤后，细胞调亡与坏死并存，共同加重中枢神经系统的损害。本实验结果显示，对照组各时间点脊髓组织 AI 均显著高于假手术组（P<0.05），表明脊髓损伤后发生了严重的细胞凋亡。同时，本研究发现对照组脊髓组织中 MDA 含量显著高于假手术组（P<0.05），SOD 活性显著低于假手术组（P<0.05），表明脊髓损伤降低了机体抗氧化酶的抗氧化能力，诱发氧自由基过度生成和严重的脂质过氧化。对照组脊髓组织含水量、脊髓损伤面积比及超微结构评分显著高于假手术组（P<0.05），大鼠 BBB 评分显著低于假手术组（P<0.05），表明脊髓损伤诱发了脊髓水肿、脊髓组织病理学损伤、超微结构损伤，以及大鼠的运动功能障碍。
虾青素又名虾黄质、龙虾壳色素，是一种呈深粉红色类胡萝卜素，化学结构类似于 β-胡萝卜素，也是类胡萝卜素合成的最高级别产物。大量研究已证实虾青素是一种具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用的强效抗氧化剂[1-2]。近期研究证实虾青素能够有效抑制脑损伤后的细胞凋亡，改善神经功能，发挥神经保护作用[7]。Wu 等[5]在实验性蛛网膜下腔出血模型研究中证实，虾青素可以激活核因子相关因子 2 和抗氧化反应元件通路，减轻氧化损伤，减轻脑水肿、血脑屏障的破坏，抑制细胞凋亡，改善神经功能，改善脑损伤。Zhang 等[6]研究发现，在大鼠蛛网膜下腔出血模型中，虾青素可显著升高大脑皮质中磷酸化 Akt 和 Bad 水平，显著降低 Caspase-3 水平，减少神经元凋亡，减少脑水肿、减轻血脑屏障破坏，改善神经功能障碍，减轻继发性脑损伤，对大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤具有保护作用。Wang 等[7]在异氟烷诱导的脑损伤模型中证实，虾青素能显著上调磷脂酰肌醇 3 激酶/蛋白激酶 B 信号通路，降低 Caspase-3 活性，减少细胞凋亡，促进细胞生长，抑制异氟醚诱导的神经元凋亡。Zhang 等[8]在体外培养的星形胶质细胞牵张损伤模型中发现，虾青素能抑制 NF-κB 核转位，降低促炎性细胞因子的表达，抑制钠离子、钾离子、氯离子共转运体的表达，降低 Bax 水平，升高 Bcl-2 水平，降低 Caspase-3 活性，减少星形胶质细胞凋亡，发挥神经保护作用。Pan 等[9]研究表明，虾青素能够提高大鼠脑缺血模型中机体的抗氧化能力，激活抗氧化防御通路，抑制活性氧，抑制细胞凋亡，促进神经再生，减少脑梗死体积，改善神经功能，发挥神经保护作用。本研究发现，实验组各时间点脊髓组织细胞 AI 均显著低于对照组（P<0.05），表明虾青素抑制了脊髓损伤后的细胞凋亡。实验组脊髓组织中 SOD 活性显著高于对照组（P<0.05），MDA 含量显著低于对照组（P<0.05），表明虾青素增强了机体的抗氧化酶活性，抑制了脊髓损伤诱发的自由基过度生成和脂质过氧化。实验组脊髓组织含水量、脊髓损伤面积比及超微结构评分显著低于对照组（P<0.05），大鼠 BBB 评分显著高于对照组（P<0.05），表明虾青素能够明显减轻脊髓水肿，减轻脊髓组织病理学损伤、超微结构损伤，改善脊髓损伤大鼠的运动功能，有效地保护脊髓组织，具有明显的神经保护作用。
综上述，本研究结果提示了虾青素能够抑制脊髓损伤后的脂质过氧化，减轻脊髓损伤后的细胞凋亡，减轻脊髓水肿，减少脊髓损伤面积，减轻脊髓组织病理学损伤及超微结构损伤，促进脊髓损伤后的运动功能的恢复，有效地保护脊髓组织，具有良好的神经保护作用。本实验为虾青素临床治疗脊髓损伤提供了初步理论依据，但实验组各项指标与假手术组比较差异均有统计学意义，因此虾青素对脊髓损伤的神经保护作用仍需进一步深入研究。
Funding Statement
国家自然科学基金资助项目（31572217）
National Natural Science Foundation of China (31572217)
References
- 1.Fassett RG, Coombes JS Astaxanthin, oxidative stress, inflammation and cardiovascular disease. Future Cardiol. 2009;5(4):333–342. doi: 10.2217/fca.09.19. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.Zhang L, Wang H Multiple mechanisms of anti-cancer effects exerted by astaxanthin. Mar Drugs. 2015;13(7):4310–4330. doi: 10.3390/md13074310. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 3.Liu X, Luo Q, Rakariyatham K, et al Antioxidation and anti-ageing activities of different stereoisomeric astaxanthin in vitro, and in vivo . J Functional Foods. 2016;25:50–61. [Google Scholar]
- 4.Park JS, Chyun JH, Kim YK, et al Astaxanthin decreased oxidative stress and inflammation and enhanced immune response in humans. Nutr Metab (Lond) 2010;7:18. doi: 10.1186/1743-7075-7-18. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.Wu Q, Zhang XS, Wang HD, et al Astaxanthin activates nuclear factor erythroid-related factor 2 and the antioxidant responsive element (Nrf2-ARE) pathway in the brain after subarachnoid hemorrhage in rats and attenuates early brain injury. Mar Drugs. 2014;12(12):6125–6141. doi: 10.3390/md12126125. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 6.Zhang XS, Zhang X, Wu Q, et al Astaxanthin alleviates early brain injury following subarachnoid hemorrhage in rats: possible involvement of Akt/bad signaling. Mar Drugs. 2014;12(8):4291–4310. doi: 10.3390/md12084291. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 7.Wang CM, Cai XL, Wen QP Astaxanthin reduces isoflurane-induced neuroapoptosis via the PI3K/Akt pathway. Mol Med Rep. 2016;13(5):4073–4078. doi: 10.3892/mmr.2016.5035. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 8.Zhang M, Cui Z, Cui H, et al Astaxanthin protects astrocytes against trauma-induced apoptosis through inhibition of NKCC1 expression via the NF-κB signaling pathway. BMC Neurosci. 2017;18(1):42. doi: 10.1186/s12868-017-0358-z. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 9.Pan L, Zhou Y, Li XF, et al Preventive treatment of astaxanthin provides neuroprotection through suppression of reactive oxygen species and activation of antioxidant defense pathway after stroke in rats. Brain Res Bull. 2017;130:211–220. doi: 10.1016/j.brainresbull.2017.01.024. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 10.Zhang XS, Zhang X, Zhou ML, et al Amelioration of oxidative stress and protection against early brain injury by astaxanthin after experimental subarachnoid hemorrhage. J Neurosurg. 2014;121(1):42–54. doi: 10.3171/2014.2.JNS13730. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.Kaptanoglu E, Palaoglu S, Surucu HS, et al Ultrastructural scoring of graded acute spinal cord injury in the rat. J Neurosurg. 2002;97(1 Suppl):49–56. doi: 10.3171/spi.2002.97.1.0049. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 12.Li GL, Brodin G, Farooque M, et al Apoptosis and expression of Bcl-2 after compression trauma to rat spinal cord. J Neuropathol Exp Neurol. 1996;55(3):280–289. doi: 10.1097/00005072-199603000-00003. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 13.Yong C, Amold PM, Zoubine MN, et al Apoptosis in cellular compartments of rat spinal cord after severe contusion injury. J Neurotrauma. 1998;15(7):459–472. doi: 10.1089/neu.1998.15.459. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 14.Liu XZ, Xu XM, Hu R, et al Neuronal and glial apoptosis after traumatic spinal cord injury. J Neurosci. 1997;17(14):5395–5406. doi: 10.1523/JNEUROSCI.17-14-05395.1997. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 15.Crowe MJ, Bresnahan JC, Shuman SL, et al Apoptosis and delayed degener ation after spinal cord injury in rats and monkeys. Nat Med. 1997;3(1):73–76. doi: 10.1038/nm0197-73. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]