激素性与酒精性股骨头坏死患者骨标本坏死区域病理与显微结构特点分析

Abstract

目的

观察激素性和酒精性股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）患者骨标本坏死区域的病理和显微结构特点。

方法

收集 2015 年 8 月—2016 年 4 月因 ONFH 行人工全髋关节置换术的股骨头标本 30 个，其中男 22 例，女 8 例；酒精性 15 例，激素性 15 例；两组国际骨循环协会（ARCO）分期构成比较差异无统计学意义（Z=2.143，P=0.143）。取激素性与酒精性 ONFH 患者骨标本不同区域（坏死区、硬化区、正常区）骨组织，行大体观察、HE 染色并计算空骨陷窝率。将完整股骨头标本行 Micro-CT 扫描，并进行骨微结构定量分析以下参数：骨小梁相对体积（bone volume to total volume，BV/TV）、骨表面积与骨骼体积比（bone surface area to bone volume ratio，BS/BV）、骨矿密度（bone mineral density，BMD）、骨矿容量（bone mineral content，BMC）、结构模型指数（structure model index，SMI）、骨小梁数目（trabecular plate number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular plate thickness，Tb.Th）、骨小梁间隙（trabecular spacing，Tb.Sp）。

结果

大体观察示激素性和酒精性 ONFH 均有骨小梁连续性中断，骨小梁吸收区域有囊变被肉芽组织取代，激素性 ONFH 肉芽组织内有血管新生的痕迹，酒精性 ONFH 肉芽组织内血管新生痕迹不明显。HE 染色示激素性和酒精性 ONFH 坏死区均有骨质结构紊乱、骨髓坏死、骨陷窝空虚，其中激素性 ONFH 骨小梁结构和连续性破坏更严重，酒精性 ONFH 骨小梁更粗，连续性较激素性 ONFH 好。激素性 ONFH 坏死区的空骨陷窝率明显高于酒精性 ONFH（P<0.05），但两种 ONFH 硬化区和正常区空骨陷窝率比较差异无统计学意义（P>0.05）。激素性与酒精性 ONFH 坏死区与硬化区之间区域在 Micro-CT 图像中均是低密度区，但前者形态不规则，对应部位大体标本可见富含血运的肉芽组织形成，后者对应部位大体标本见无血运的纤维肉芽组织形成。骨微结构定量分析显示，激素性 ONFH 坏死区和硬化区 BV/TV、BMD、BMC、Tb.N、Tb.Th 明显低于酒精性 ONFH，BS/BV、SMI、Tb.Sp 显著高于酒精性 ONFH，差异均有统计学意义（P<0.01）；两种 ONFH 正常区上述各指标比较差异均无统计学意义（P>0.05）。

结论

激素性和酒精性 ONFH 标本坏死区的骨小梁连续性均破坏。但两种 ONFH 有不同的坏死表现形式，激素性 ONFH 以多发灶性溶骨性骨质破坏为特点，酒精性 ONFH 是以凝固性骨质坏死为特点。

股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是好发于中青年患者的难治性疾病之一，逐渐进展到股骨头塌陷影响髋关节功能，对患者的身心健康造成一定程度影响^[1]。ONFH 也是一类具有高度异质性的疾病，我们在临床中观察到，具有相似临床症状和影像表现的患者，往往有着不一样的疾病转归和预后，它们对于同一治疗方案的反应性迥然不同。其原因在于目前对 ONFH 病理特点的认识还不充分。尽管有文献报道了 ONFH 标本不同病理区域的特点^[2-4]，但并未将其按照病因类型进行区分。众所周知，应用激素和饮酒是诱发 ONFH 的两大主要原因^[5-6]，这种异质性可能与不同病因导致的股骨头内骨组织出现不同病理变化有关。本研究通过组织病理学、micro-CT 骨计量学观察激素性与酒精性 ONFH 患者骨标本坏死区域的病理与显微结构特点，旨在为临床、影像与病理学相关性研究提供实验基础。

1. 材料与方法

1.1. 组织来源

收集 2015 年 8 月—2016 年 4 月于广州中医药大学第一附属医院三骨科因 ONFH 行人工全髋关节置换术的股骨头标本 30 个。其中男 22 例，女 8 例；年龄 26～69 岁，平均 48.4 岁。酒精性 ONFH 15 例，激素性 15 例；国际骨循环协会（ARCO）Ⅲ 期 16 例，Ⅳ 期 14 例。其中酒精性 ONFH 患者中 ARCO Ⅲ 期 6 例、Ⅳ 期 9 例，激素性 ONFH 患者中 ARCO Ⅲ 期 10 例、Ⅳ 期 5 例，两组分期构成比较差异无统计学意义（Z=2.143，P=0.143）。本研究获广州中医药大学第一附属医院医学伦理委员会批准，并在中国临床试验注册中心注册（ChiCTR-RPC-15006290）；患者均签署知情同意书。

1.2. 主要仪器

组织切片机、TP1020 自动组织处理机、Autostainer XL 自动染色机、自配图像分析软件（Leica 公司，德国）；Skyscan1172 Micro-CT（Bruker 公司，比利时）。

1.3. 观测指标

1.3.1. 大体观察

取激素性与酒精性 ONFH 患者骨标本不同区域（坏死区、硬化区、正常区）骨组织切片，大体观察股骨头内不同病理结构、骨小梁、囊性变及肉芽组织等。

1.3.2. HE 染色观察

取上述骨组织，置于 4% 多聚甲醛溶液固定 24 h，EDTA 微波脱钙，经 75%、85%、95%、100% 乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm 厚切片，常规 HE 染色，光镜下观察各组骨小梁、骨细胞、髓腔脂肪细胞的变化，并计算空骨陷窝率。

1.3.3. Micro-CT 扫描与骨微结构定量分析

将完整股骨头标本置于 Micro-CT 系统中扫描，扫描分辨率为 23 μm，单次扫描时间为 4 h。扫描参数：80 kV，88 μA，每次扫描的旋转角度为 0.4°，共旋转 180° 扫描，23 μm 为一断层。确定坏死区、硬化区、正常区的位置后，在每个区域分别选取 3 个长方体信息区进行重建（1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm）。使用 Micro-CT 自带软件 CT-vox 进行三维重建，并使用 CTan 对各区域进行骨小梁参数计量。参数：骨小梁相对体积（bone volume to total volume，BV/TV）、骨表面积与骨骼体积比（bone surface area to bone volume ratio，BS/BV）、骨矿密度（bone mineral density，BMD）、骨矿容量（bone mineral content，BMC）、结构模型指数（structure model index，SMI）、骨小梁数目（trabecular plate number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular plate thickness，Tb.Th）、骨小梁间隙（trabecular spacing，Tb.Sp）。

1.4. 统计学方法

采用 SPSS18.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. 大体观察

激素性与酒精性 ONFH 骨组织切片大体观察示，可将内部结构分为坏死区、硬化区和正常区。两组共同特点是均有骨小梁连续性中断，骨小梁吸收区域有囊变被肉芽组织取代，坏死区为淡黄色致密组织，硬化带为灰白色坚硬组织，硬化区下方为正常组织区。激素性 ONFH 坏死区与硬化区之间有坏死骨吸收、肉芽组织形成及血管新生的痕迹，坏死区被软骨和硬化区所包绕。酒精性 ONFH 坏死区与硬化区之间有坏死骨吸收，吸收区内填充纤维组织，血管新生痕迹不明显。见图 1。

图 1.

Gross observation of bone samples between steroid-induced and alcohol-induced ONFH groups

激素性与酒精性 ONFH 患者的股骨头标本大体观察

从左至右依次为 X 线片、整体外观及骨组织切片观察　1：坏死区　2：硬化区　3：正常区　a. 激素性 ONFH；b. 酒精性 ONFH

Form left to right for X-ray film, specimen appearance, and bone tissue slices　1: Necrotic region 2: Sclerotic region 3: Normal region　a. Steroid-induced ONFH; b. Alcohol-induced ONFH

2.2. HE 染色观察

激素性和酒精性 ONFH 坏死区均有骨质结构紊乱，骨髓坏死，骨陷窝空虚，其中激素性 ONFH 骨小梁结构和连续性破坏更严重；硬化区骨质连续，但不规则，可见骨髓细胞，骨陷窝内填充骨细胞，其中酒精性 ONFH 骨小梁更粗，连续性更好；正常区脱钙后骨质较少，可见骨髓细胞，骨陷窝内填充骨细胞，两种 ONFH 正常区无区别。见图 2。

图 2.

HE staining observation of bone samples between steroid-induced and alcohol-induced ONFH groups

激素性与酒精性ONFH患者股骨头标本各区域HE染色观察

从左至右放大倍数分别为×40 和×200　a. 激素性坏死区；b. 酒精性坏死区；c. 激素性硬化区；d. 酒精性硬化区；e. 激素性正常区；f. 酒精性正常区

Form left to right for 40- and 200-folds　a. Steroid-induced necrotic region; b. Alcohol-induced necrotic region; c. Steroid-induced sclerotic region; d. Alcohol-induced sclerotic region; e. Steroid-induced normal region; f. Alcohol-induced normal region

激素性 ONFH 坏死区的空骨陷窝率明显高于酒精性 ONFH，差异有统计学意义（P<0.05）；两种 ONFH 硬化区和正常区空骨陷窝率比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 1。

表 1.

Comparison of rate of empty bone lacunae in different regions of bone samples between steroid-induced and alcohol-induced ONFH (n=6, %, )

激素性和酒精性 ONFH 股骨头标本各区域空骨陷窝率 比较（n=6，%， ）

组别 Group	坏死区 Necrotic region	硬化区 Sclerotic region	正常区 Normal region
激素性 ONFH Steroid-induced ONFH	95.0±2.0	17.3±1.5	9.7±1.5
酒精性 ONFH Alcohol-induced ONFH	90.0±1.0	19.3±1.5	11.0±2.0
统计值 Statistic	t=3.873 P=0.018	t=–1.604 P= 0.184	t=–0.918 P= 0.411

2.3. Micro-CT 扫描与骨微结构定量分析

激素性 ONFH 坏死区与硬化区之间区域在 Micro-CT 图像中是低密度区（黑色），形态不规则，对应部位大体标本可见有富含血运的肉芽组织形成。而酒精性 ONFH 坏死区与硬化区之间区域同样存在低密度区（黑色），对应部位大体标本可见无血运的纤维肉芽组织形成。见图 3。

图 3.

Micro-CT scanning observation of bone samples between steroid-induced and alcohol-induced ONFH groups

激素性与酒精性ONFH患者股骨头标本Micro-CT扫描观察

从左至右依次为二维图像及三维重建图像　1：坏死区 2：硬化区 3：正常区　a. 激素性 ONFH；b. 酒精性 ONFH

Form left to right for two-dimensional and three-dimensional reconstruction images　1: Necrotic region 2: Sclerotic region 3: Normal region　a. Steroid-induced ONFH; b. Alcohol-induced ONFH

骨微结构定量分析显示，激素性 ONFH 坏死区和硬化区 BV/TV、BMD、BMC、Tb.N、Tb.Th 明显低于酒精性 ONFH，BS/BV、SMI、Tb.Sp 显著高于酒精性 ONFH，差异均有统计学意义（P<0.01）。两种 ONFH 正常区上述各指标比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 2。

表 2.

Histomorphometry for femoral head necrosis in different regions of bone samples between steroid and alcohol-induced ONFH groups (n=9， )

激素性和酒精性 ONFH 股骨头标本各区域骨计量学分析（n=9， ）

组别 Group	BV/TV (%)				BS/BV (%)				BMD (mg/cm3)
	坏死区 Necrotic region	硬化区 Sclerotic region	正常区 Normal region		坏死区 Necrotic region	硬化区 Sclerotic region	正常区 Normal region		坏死区 Necrotic region	硬化区 Sclerotic region	正常区 Normal region
激素性 ONFH Steroid-induced ONFH	20.20±4.03	72.31±2.69	52.53±3.58		22.78±2.70	12.28±0.75	15.51±1.28		60.70±4.65	249.06±10.71	137.47±13.31
酒精性 ONFH Alcohol-induced ONFH	36.56±5.53	88.40±2.64	51.89±4.53		19.40±1.10	10.81±1.71	15.18±1.33		89.64±6.92	274.59±13.85	142.52± 9.19
统计值 Statistic	t=–7.175 P= 0.000	t=–12.796 P= 0.000	t=0.330 P=0.745		t=3.477 P=0.003	t=2.368 P=0.031	t=0.535 P=0.600		t=–12.025 P= 0.000	t=–5.051 P= 0.000	t=–1.082 P= 0.295

表 3.

组别 Group	BMC (mg)				SMI				Tb.N (mm)
	坏死区 Necrotic region	硬化区 Sclerotic region	正常区 Healthy region		坏死区 Necrotic region	硬化区 Sclerotic region	正常区 Healthy region		坏死区 Necrotic region	硬化区 Sclerotic region	正常区 Healthy region
激素性 ONFH Steroid-induced ONFH	3.62±0.30	10.66±0.64	6.15±0.44		2.91±0.06	0.88±0.08	1.69±0.05		0.82±0.04	3.15±0.08	1.73±0.03
酒精性 ONFH Alcohol-induced ONFH	4.69±0.45	12.50±0.44	6.21±0.66		2.67±0.06	0.69±0.07	1.72±0.05		1.04±0.03	3.58±0.33	1.75±0.04
统计值 Statistic	t=–6.853 P= 0.000	t=–8.207 P= 0.000	t=–0.262 P= 0.797		t=8.176 P=0.000	t=–5.215 P= 0.000	t=–1.444 P= 0.168		t=–15.242 P= 0.000	t=–4.387 P= 0.002	t=–1.386 P= 0.185

表 4.

组别 Group	Tb.Th (μm)				Tb.Sp (μm)
	坏死区 Necrotic region	硬化区 Sclerotic region	正常区 Healthy region		坏死区 Necrotic region	硬化区 Sclerotic region	正常区 Healthy region
激素性 ONFH Steroid-induced ONFH	117.08±10.79	288.71± 6.25	163.47±5.10		1 665.18±62.04	339.99±11.98	536.12±8.35
酒精性 ONFH Alcohol-induced ONFH	146.88±13.77	313.45±12.59	168.20±4.64		1 388.99±79.92	311.29± 7.63	534.76±6.41
统计值 Statistic	t=–5.901 P= 0.000	t=–6.097 P= 0.000	t=–2.093 P= 0.053		t=9.456 P=0.000	t=7.000 P=0.000	t=0.448 P=0.660

3. 讨论

保留自身髋关节对于中青年 ONFH 患者具有很高的临床价值，也是该病治疗的发展方向^[7]。目前 ONFH 的早期诊断率和治疗有效率较前有明显提高^[8-9]，但仍存在着很多诊断上的误判和治疗上的误区。因为 ONFH 患者具有高度的异质性特点，即具有相似的临床症状、坏死分期和影像表现，却具有截然不同的临床转归，这可能与它们在分子、遗传改变上出现显著的差异有关^[10-12]，这种差异表现在患者的临床治疗反应、影像学表现及股骨头生存率方面。一直以来，ONFH 的预后评估都是以临床症状和影像学表现为主要依据，并未考虑疾病所处的病理阶段以及对应的病理组织学特征。

在 ONFH 病理过程中，塌陷是 ONFH 最关键的病理改变，塌陷的发生是骨修复与持续应力综合作用的结果，塌陷是否发生是疾病性质转归的关键^[13]。一旦发生塌陷，关节软骨、关节形态将不可避免地受到破坏，最终导致关节的病废^[14]。因此，研究保髋必须研究塌陷，了解塌陷发生的病理机制，必须准确判断其病理状态，也就是判断骨修复状态，才能更好地认识 ONFH 生物异质性，及时采取相应措施治疗。

激素应用和酗酒是引起 ONFH 的两大主要诱因^[5-6]。本研究大体观察结果显示，激素性和酒精性 ONFH 股骨头标本中坏死区、硬化区和正常区是两组共性病理特征，病理标本 HE 染色示两组坏死区空骨陷窝率均超过 85%，硬化区和正常区骨陷窝内均有存活的骨细胞。两组区别在于激素性 ONFH 坏死区骨小梁结构与排列破坏严重，数量明显减少，坏死区与硬化区交界处有大量红色的骨吸收区域，其内血运较丰富；而酒精性 ONFH 坏死区骨小梁结构与排列亦有破坏，数量也有减少，但比激素性 ONFH 破坏较轻，坏死区与硬化区交界处有骨吸收区域，但其内仅有纤维组织填充，血运不明显。可以初步推测，激素性 ONFH 是以骨吸收增强为特点的溶骨性骨质破坏为主，其自身激发的骨修复形式可能遵循爬行替代（先破坏后成骨）原则，因为内含血运丰富的肉芽组织，持续的应力刺激使血运瘀滞，未能及时成骨，可能是其发生塌陷的原因。酒精性 ONFH 是以骨形成减弱为特点的凝固性骨质破坏为主，其自身激发的骨修复形式可能遵循提高成骨能力的原则，因为缺乏血运无法实现骨修复，骨营养不足，脆性增强，可能是其发生塌陷的原因。无论是哪种骨质破坏，均可改变骨小梁的空间排列以及立体结构，导致力学强度丧失，最终发生塌陷。因此，我们在临床上观察到的具有相似临床症状（疼痛）和影像学表现（囊性变、塌陷）的患者，对同一治疗方案出现不同临床结局的异质性特点，可能是与不同病因的 ONFH 患者骨修复形式不同有关。

然而，Samara 等^[2]在针对 ONFH 患者骨组织标本的基因学研究中发现，与正常区相比，坏死区成骨相关的骨保护素（osteoprotegerin，OPG）基因低表达，破骨相关的 NF-κB 受体活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κ B ligand，RANKL）高表达，从而对骨代谢产生影响，是股骨头塌陷的主要原因。Miao 等^[3]同样检测 ONFH 患者骨组织标本发现，与正常区相比，坏死区 RANKL 表达增高，而 OPG 表达有降低趋势，但无统计学差异。Song 等^[4]通过建立兔激素性 ONFH 模型，证明了股骨头骨组织中 OPG、血管形成相关的 VEGF 低表达，而 RANKL 高表达。然而，这些研究并未区分不同病因诱发 ONFH 在基因学上的差异，亦无法解释 ONFH 异质性的原因。这似乎给本研究下一步工作提供了思路，针对不同病因的 ONFH 不同区域骨组织中分子生物学改变的研究，可以为本研究的病理学差异提供更有说服力的证据。

在骨计量学方面，采用 Micro-CT 图像分析和骨计量可直观显示骨组织空间结构特点，准确进行定量化分析^[15]。Wang 等^[16-17]应用 Micro-CT 将 ONFH 骨标本的坏死区、硬化区和正常区进行三维重建并进行分析，发现坏死区的骨小梁连续性破坏，结构散乱（BV/TV、BMD、BMC、Tb.N 均降低）；硬化区的骨小梁结构增厚，数目增多，间隙变窄（BV/TV 增加，Tb.Sp 降低）；正常区的骨小梁结构完整，厚度分布均匀。本研究进一步对比了激素性和酒精性 ONFH 不同区域骨组织的空间结构特点，发现两组股骨头坏死区和硬化区的骨小梁空间结构明显改变。与酒精性 ONFH 相比，激素性坏死区 BMD、BMC、Tb.N 降低，Tb.Sp 增大，SMI 增大（杆状骨小梁增多）；激素性硬化区上述参数变化趋势与坏死区一致；两组正常区各骨参数无统计学差异。骨计量学结果再次验证了大体标本、病理标本的结果，即激素性 ONFH 坏死区骨空间结构及骨量明显低于酒精性 ONFH，该结果支持激素性 ONFH 是以骨吸收增强为特点的溶骨性骨质破坏为主，酒精性 ONFH 是以骨形成减弱为特点的凝固性骨质破坏为主的推测。

综上述，本研究从激素性和酒精性 ONFH 不同区域骨小梁的病理和空间结构差异推测不同病因诱发 ONFH 的骨修复特点，分析了 ONFH 异质性的可能原因，为 ONFH 的早期诊断和治疗提供了新的指导思想和研究方向。下一步将在分子生物学层面深入研究激素性和酒精性 ONFH 的病理特点，为选择最佳治疗方法提供证据。

Funding Statement

国家自然科学基金面上项目（81473697、81573996）；广东省科技厅-广东省中医药科学院联合科研专项项目（2016A020226028）；广东省自然科学基金资助项目（2017A030313698）；广东省中医药强省建设专项中医优势病种（股骨头坏死）突破项目（粤中医函[2015]19号）；广东省名中医（何伟）传承工作室建设项目（粤中医办函[2017]17号）

National Natural Science Foundation of China (81473697, 81573996); Guangdong Provincial Science and Technology Department-Joint Research Project of Guangdong Academy of Chinese Medicine (2016A020226028); Natural Science Foundation of Guangdong Province (2017A030313698); Special Construction Project of Dominant Disease (ONFH) of Chinese Medicine in Guangdong Province ([2015]19); Inheritance Studio Construction Project of Prestigious TCM Doctors (He Wei) in Guangdong Province ([2017]17)