Effects of photobiomodulation therapy on functional recovery, angiogenesis and redox status in denervated muscle of rats

Jéssica Junia Aparecida Cardoso Nascimento; Alex Sander Dias Machado; Giovanna Moura Lamas Della-Santa; Danielle Cristina Fernandes; Marcílio Coelho Ferreira; Gustavo Augusto Pereira Machado; Bruna Carolina Garcia Chaves; Karine Beatriz Costa; Etel Rocha-Vieira; Murilo Xavier Oliveira; Thais Peixoto Gaiad; Ana Paula Santos

doi:10.31744/einstein_journal/2021AO6001

. 2021 Sep 13;19:eAO6001. doi: 10.31744/einstein_journal/2021AO6001

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Effects of photobiomodulation therapy on functional recovery, angiogenesis and redox status in denervated muscle of rats

Jéssica Junia Aparecida Cardoso Nascimento ¹, Alex Sander Dias Machado ¹, Giovanna Moura Lamas Della-Santa ¹, Danielle Cristina Fernandes ¹, Marcílio Coelho Ferreira ¹, Gustavo Augusto Pereira Machado ¹, Bruna Carolina Garcia Chaves ¹, Karine Beatriz Costa ¹, Etel Rocha-Vieira ¹, Murilo Xavier Oliveira ¹, Thais Peixoto Gaiad ¹, Ana Paula Santos ^1,^✉

PMCID: PMC8439560 PMID: 34586157

ABSTRACT

Objective:

To evaluate the effects of photobiomodulation therapy in redox status, angiogenesis marker – vascular endothelial growth factor – and in the functional recovery in denervated muscle.

Methods:

A total of 32 female Wistar rats underwent a crush injury and were randomly divided into four groups: Light Emitting Diode Group 2 and Control Group 2 (muscle collected 2 days after injury), and Light Emitting Diode Group 21 and Control Group 21 (muscle collected 21 days afterinjury). Light Emitting Diode Group 2 and Light Emitting Diode Group 21 received two and ten light emitting diode applications (630±20nm, 9J/cm², 300mW), respectively, and the Control Group 2 and Control Group 21 did not receive any treatment. The function was evaluated by grasping test at four moments (pre-injury, 2, 10 and 21 post-injury days). The flexor digitorum muscle was collected for analysis of immunolocalization of vascular endothelial growth factor and redox parameters.

Results:

Functional improvement was observed at the second and tenth post-injury day in treated groups compared to control (p<0.005). The muscle tissue of treated groups presented higher immunohistochemical expression of vascular endothelial growth factor. Photobiomodulation therapy decreased the oxidative damage to lipid in Light Emitting Diode Group 2 compared to Control Group 2 (p=0.023) in the denervated muscle.

Conclusion:

Photobiomodulation therapy accelerated the functional recovery, increased angiogenesis and reduced lipid peroxidation in the denervated muscle at 2 days after injury.

Keywords: Muscles; Crush injuries; Phototherapy; Oxidative stress; Vascular endothelial growth factors; Muscle strength; Rats, Wistar

INTRODUCTION

The human peripheral nervous system responds to axonal injuries through the active regeneration; however, the treatment of injured peripheral nerves is far from being optimal.⁽¹⁾ Patients suffer from severe impairment of their quality of life due to decline in the functionality, and their treatment is still associated with high socioeconomic costs.⁽¹^,²⁾ For functional recovery it is necessary to prevent the denervation-related skeletal muscle atrophy.⁽³⁾

Photobiomodulation therapy (PBMT), red (600nm to 700nm) or infrared (770nm to 1200nm) light spectrum,⁽⁴⁾ is widely investigated and used for nerve regeneration purposes.⁽¹⁾ Despite the considerable number of studies about PBMT action in nerve regeneration, most of them focus on performing morphometric, electrophysiological and functional analyses,⁽⁵^,⁶⁾ which leads to scarcity of studies in the literature about PBMT mechanisms of action on nerve regeneration and denervated muscle.

Redox imbalance is one of the main causes of neural or target-organ damage after injuries. In addition, it can lead to delayed functional recovery of the peripheral nerve.⁽⁷⁾ Nerve tissues are particularly sensitive to free radicals and appear to inhibit the antioxidant system when they are injured.⁽⁷⁾ Denervated muscle showed a significant increase in the mitochondrial generation of hydrogen peroxide, associated to progressive loss of muscle mass of the tibialis anterior muscle, from 7 up to 21 days following denervation.⁽⁸⁾ Mitochondria in the denervated tibialis anterior muscle of mice showed increased peroxide generation by 3 days after transection.⁽⁹⁾ These authors attested the presence of recent denervation in aging muscle fibers increased reactive oxygen species (ROS) generation by mitochondria of innervated fibers nearby and denervated fibers.

The vascular endothelial growth factor (VEGF) is a multifunctional cytokine, known to promote axonal regeneration and protect muscle fibers from degeneration.⁽³^,¹⁰⁾ It is also known that the increased vascular permeability associated with neovascularization, promoted by VEGF, are crucial events for the tissue under repair, because the increased blood supply to the injured cells allows oxygen and a variety of cytokines and growth factors to reach the injury site.⁽¹⁰⁾

Photobiomodulation therapy affects the redox state of injured muscle tissue, and increases the gene expression of antioxidant enzymes in stressed cells,⁽¹¹⁾ enables nitric oxide (NO) photodissociation from cytochrome c oxidase in mitochondria, and improves cell respiration and adenosine triphosphate production.⁽¹²⁾ In addition, PBMT decreases the production of ROS⁽⁴^,¹¹⁾ that, despite playing an essential role in the redox signaling pathway necessary to enable important biological events, can damage molecules that are essential to several cell processes.⁽¹³⁾

Photobiomodulation therapy increases immunnohistochemical expression of VEGF expression in muscle tissue.⁽¹⁴⁾ Several studies point that the VEGF interacts with skeletal muscle satellite cells and promotes regeneration after trauma.⁽³^,¹⁵⁾ Furthermore, VEGF has been shown to have a myogenic and antiapoptotic effect,⁽³⁾ and appears to be able to improve the restoration of muscle strength, and reduce the amount of connective tissue after traumatic injury.⁽¹⁵⁾

Thus, PBMT becomes a good option to help controlling damages to injured nerve and denervated muscle tissues. Obviously, PBMT has other action mechanisms besides the modification of the cell redox state and expression of growth factors.⁽⁴^,¹²⁾ However, these mechanisms should certainly be taken into consideration.

OBJECTIVE

To investigate the effect of photobiomodulation therapy using light emitting diode on the redox state and the immunohistochemical expression of vascular endothelial growth factor in denervated muscles at two different moments after the injury, as well as to analyze the influence of this therapy on functional recovery.

METHODS

Animals and surgical procedure

The present study was approved by the Institutional Ethics Committee on Animal Research, under protocol 46/2015 and was carried out in Laboratory of Animal Experimentation of the Physical Therapy Department of Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri between September 2017 and December 2018.

A total of 32 female Wistar rats (age: 7 weeks; weight: 140 to 190g) were used. They were kept in boxes (four animals in each) placed in an air-conditioned room (22°C to 23°C), where they had access to water/feed ad libitum , and were subjected to 12-hour light cycles.

The rodents were intraperitoneally anesthetized with xylazine 2% and ketamine 10% (0.1mL/100g). They were placed in dorsal decubitus position to enable performing trichotomy and asepsis of the site; the right median nerve was exposed 10mm above the elbow, and a crush injury was induced using standard hemostatic forceps, in which the second notch was utilized for maintaining the nerve crush. The same was maintained closed, during 2 minutes, to crush the nerve⁽¹⁶⁾ ( Figure 1 ). Subsequently, the skin was sutured with 4-0 thread and treated with chlorhexidine digluconate (Merthiolate, Gold Lab). After surgery, the animals were randomly divided into four groups: Light Emitting Diode Group 2 (LG2; eight animals were subjected to two transcutaneous applications of PBMT and were euthanized 48 hours after the injury induction); Control Group 2 (CG2; eight animals received no treatment and were euthanized 48 hours after the injury induction); Light Emitting Diode Group 21 (LG21; eight animals were subjected to ten PBMT applications and were euthanized 21 days after the injury induction); Control Group 21 (CG21; eight animals received no treatment and were euthanized 21 days after the injury induction).

Photobiomodulation therapy

The parameters proposed for PBMT using light emitting diode (LED) device (Bios Therapy II, Bios^®) were wavelength (630±20nm), optical output (300mW), energy density (9J/cm²), power density (0.3W/cm²), energy (9J), spot size (1cm²), treatment time (30 seconds), LED mode (continuous output), number of irradiation points (1), and total energy delivered (216J). The animals were manually immobilized, and the treatment was transcutaneously applied to the surgical site, at a single point. The beam angle was kept perpendicular (90°) to the irradiation surface.

The application of the first therapeutic procedure was right after surgery. The LG2 Group was subjected to the second and final application 24 hours later. The LG21 Group was subjected to ten applications (five applications, one per day, at 2-day intervals and, subsequently, other five applications).

Functional test

The grasping test⁽¹⁷⁾ was applied to the right thoracic limb of the animals by two trained researchers, who were blind to the experimental group of each animal. One researcher gently lifted the rats by their tail and allowed them to grab a grid attached to an ordinary electronic scale. Next, he gently pulled it up, while the other researcher recorded the generated negative value. The contralateral thoracic limb of the animals was restrained with duct tape to prevent it from gripping the grid. The test was performed in four different experimental stages: pre-injury, 2, 10 and 21 post-injury days.

Immunohistochemistry analysis

Primary polyclonal antibodies against VEGF (Novus Bio NB100527) 1:400 were applied on muscle sections. Sections were immersed in citric acid solution at 0.01M, pH 6.0 and submitted to 95°C for 30 minutes to antigenic recovery. Next, the blockade of endogenous peroxidase with hydrogen peroxide at 3% for 40 minutes was performed. Primary antibodies were applied and incubated for 20 hours in a damp chamber at 4°C. After three more rinses in buffered saline solution,⁽¹⁸⁾ secondary (Biotinylated/Dako) and tertiary (Streptavidin-HRF/Dako) antibodies were applied and incubated for 30 minutes, at room temperature (24°C). Immunohistochemistry analysis (IHC) reaction was developed with diaminobenzidine (DAB) (Sigma Co., S. Louis, USA) for 1 minute. In the negative control, the primary antibody was omitted, and all slides were counterstained with hematoxylin. All tissue photomicrographs for immunohistochemistry analyses were made under an optical microscope (Labomed^® LxPol), equipped with an Axio CAM HRc camera and Software Capture Pro 2.9.0.1.

Analyses of redox state parameters

Samples were collected based on the protocol applied to each group of animals: two and 21 days after injury induction. Animals were pre-anesthetized with 0.1mL/100g of a mixture comprising ketamine 10% and xylazine 2%, after the application of the same aseptic and surgical conditions adopted in the initial procedure. The flexor digitorum muscle was fully removed. After this procedure, the removed muscle tissue were extensively washed in buffered saline solution (pH 7.2), weighed and stored in the freezer at −80°C, until biochemical analysis.

A Potter-Elvehjem (Corning) tissue grinder (kept in ice) was used to macerate the samples in ice-cold buffered saline solution (0.015M) at pH 7.4. The homogenate was divided into two aliquots, according to the herein performed assays. One aliquot was centrifuged at 5,000g, 4°C, for 5 minutes, and the supernatant was used to analyze thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and the non-enzymatic antioxidant capacity of the tissues. The sediment was used to measure the carbonyl derivative content in proteins. The other aliquot was centrifuged at 10,000g, 4°C, for 10 minutes, and the supernatant was used to evaluate the enzymatic antioxidant capacity of the tissues, by measuring the activity of enzymes, such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT).

The TBARS concentration,⁽¹⁹⁾ measured based on thiobarbituric acid reaction to malondialdehyde (MDA), was used to determine lipid peroxidation. Sample aliquots of 0.15mL were added to 0.1mL sodium dodecyl sulfate (SDS; 8.1%), 0.25mL acetic acid (2.5M; pH 3.4) and 0.25mL thiobarbituric acid (0.8%). The mixture was homogenized and incubated at 95°C for 90 minutes. After this procedure was over muscle samples were cooled and centrifuged at 5,000g for 5 minutes, and 0.25mL of the supernatant was removed and placed on a 96-well flat-bottom plate for spectrophotometric reading at 532nm. Thiobarbituric acid reactive substances content was expressed in nmol MDA/mg of protein, based on the standard curve of known MDA concentrations. Measurements were carried out in duplicate.

The non-enzymatic antioxidant capacity of the samples was determined based on the Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) method.⁽²⁰⁾ To prepare the FRAP reagent, 25mL of sodium acetate buffer (0.3M, pH 3.6) were added to 2.5mL of tripyridyl triazine (TPTZ) (10mM TPTZ) and, then, to 2.5mL of iron chloride (FeCl₃H₂O −20 mM). Next, a 528μL aliquot of FRAP reagent was added with 72μL of homogenate. The mixture was homogenized and incubated in the dark at 37°C, for 30 minutes. Subsequently, samples were centrifuged at 300g, for 5 minutes, and the supernatant was spectrophotometrically analyzed (in duplicate), in microplate reader at 593nm. The total antioxidant capacity of the samples was determined based on the standard curve of known ferrous sulfate (FeSO4) concentrations and normalized based on the amount of protein in the sample; results were expressed in μM FeSO₄/mg of protein.

The homogenate sediment of muscle tissue was suspended in 1mL of 50mM potassium phosphate buffer (pH 6.7) containing 1mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), and samples were divided into blank and test groups to enable measuring the carbonyl derivative concentrations in proteins.⁽²¹⁾ Trichloroacetic acid at 10% was added to all samples, which were centrifuged at 5,000g, at 4°C for 10 minutes; the supernatant was discarded. Next, 2,4-dinitrophenylhydrazine (10mM DNPH) diluted in 2mM hydrochloric acid was added to the test sediment. The blank was added with 2mM hydrochloric acid only. Samples were kept in the dark, at room temperature, for 30 minutes and vortex-homogenized every 15 minutes. Trichloroacetic acid at 10% was added to the samples, which were homogenized and centrifuged at 5,000g, 4°C, for 10 minutes. The supernatant was discarded and the sedimented material was washed in 1mL ethanol and ethyl acetate (1:1), and centrifuged two times, at 5,000g, 4°C, for 10 minutes. Finally, the sedimented material was dissolved in 6% SDS and centrifuged at 10,000g, 4°C, for 10 minutes. The supernatant was spectrophotometrically analyzed at 370nm, in a 96-well plate microplate reader, at 22,000M^-1cm^-1 DNPH molar absorption coefficient. The carbonyl derivative content in proteins was expressed in mmol of carbonyl derivatives per mg of protein (mmol/mg of protein); measurements were conducted in triplicate.

Superoxide dismutase activity was determined based on the inhibition of pyrogallol autoxidation.⁽²²⁾ Samples of each tissue were added to potassium phosphate buffer (50mM, pH 8.2, 37°C). containing 1mM diethylenetriaminepentaacetic acid, and the reaction was triggered by the addition of 0.2mM pyrogallol (1,2,3-benzenetriol); the reading was spectrophotometrically performed in microplate reader at 420nm, 37°C, for 4 minutes. SOD activity (expressed in U/mg) was determined based on the enzyme's ability to inhibit pyrogallol autoxidation by 50%; measurements were performed in duplicate.

Catalase activity was determined based on hydrogen peroxide absorbance decrease at 240nm.⁽²³⁾ A hydrogen peroxide solution at 0.3M was added to the samples, and the reaction deriving from its decomposition was spectrophotometrically monitored in quartz cuvettes at 240nm, 25°C, for 1 minute; measurements were performed in triplicate. Catalase activity was expressed in millimolar of H₂O₂ decomposed per minute per milligram of protein (ΔE/min/mg of protein).

Statistical analysis

Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 5 software. Morphometric and histological data are presented as mean±standard deviation (SD). Qualitative assessments of immunohistochemistry of muscle samples were analyzed by observing three sections from each one of the animals (n=8)/per group=4. The Shapiro-Wilk normality test was used. The t -test for independent samples was used to compare the variables of the redox state of denervated muscles and of the median nerve function. Differences were considered significant at p<0.05.

RESULTS

Results of the functional analysis are described in table 1 . It is possible to observe that LG accelerated the functional return in the first two moments of evaluation (2 and 10 days post-injury). There was no significant difference in functional recovery between LG21 and CG21 on the 21^st post-injury day.

Table 1. Values obtained in the grasping functional test.

Groups	Pre-Injury	2PL	10PL	21PL
LG2	234.40±46.40	1.88±2.59 ^*	-	-
CG2	211.40±42.50	0.00±0.00	-	-
LG21	183.80±37.01	6.25±2.31 ^*	39.38±20.43 ^*	140.00±16.04
CG21	178.10±52.09	1.87±2.58	14.38±5.63	163.80±45.02

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Indicates a significant difference between LG2 and CG2; and LG21 and CG21. Differences were considered significant at p<0.05 ( t -test for independent samples).

PL: post-injury: LG2: Light Emitting Diode Group 2; CG2: Control Group 2; LG21: Light Emitting Diode Group 21; CG21: Control Group 21.

The immunohistochemical analysis of VEGF showed denervated muscles of treated groups expressed more VEGF staining than control ones. This expression was higher at 2 days group than 21 days ones. Denervated muscles of PBMT groups expressed also closer angiogenesis points/places when compared to controls ( Figure 2 ).

Figure 3 shows the results of redox state biomarkers of denervated muscles in CG2 and LG2. Light Emitting Diode Group 2 presented lower TBARS concentration in denervated muscles than CG2 (p=0.023). Figure 4 shows data about biomarkers in denervated muscles of the groups euthanized 21 days after injury induction.

DISCUSSION

The current study was the first to describe the action of PMBT on redox state biomarkers and VEGF immunnohistochemical expression in denervated muscles associated with functional responses. The results showed that the PBMT using the LED device after axonotmesis can increase VEGF immunnohistochemical expression and change redox state parameters, such as lipid peroxidation and oxidative damage to proteins, in denervated muscles.

Photobiomodulation therapy accelerated the functional recovery of the analyzed animals, since there were significant differences between the irradiated and control groups on the second and tenth post-injury days.

The grasping test adopted in the current study is objective and effective in demonstrating the day when the functional recovery began, as well as its progression.⁽¹⁷^,²⁴⁾ Studies conducted with rodents have already demonstrated that animals subjected to median nerve crushing, which remained untreated, began to flex their fingers on the eighth post-injury day, presented reduced strength on the 9^th day, as well as satisfactory improvement after the tenth day,⁽¹⁷⁾ and recovered full function 20-21 days after injury induction.⁽²⁵⁾

The accelerated functional recovery after axonotmesis has already been described for PBMT using LED. The evaluation of the sciatic nerve function of Wistar rats (the nerve was harmed with hemostatic forceps for 30 seconds) was based on the sciatic functional index; rats treated with LED presented better functional outcomes at the seventh, 14^th and 21^st post-injury days.⁽⁶⁾ The starting date and the number of LED irradiations were similar to this study. However, the parameters wavelength (940nm), power density (9.5mW/cm²) and energy density (4/cm²) were different.⁽⁶⁾ In addition, the nerve compression time was different, and this interferes in the results.⁽²⁴⁾

The median nerve was selected because it presents lesser incidence of contractures and autotomy, which are often seen in sciatic nerve injuries; these processes can affect the evaluation of nerve regenerative parameters and end up not preserving animals’ well-being. The distance between the median nerve and the target organs is small, and it allows faster reinnervation; besides, most nerve injuries in humans happen in the upper limbs.⁽²⁴⁾

Among the neurotrophic factors involved in nerve regeneration, the VEGF has essential function.⁽²⁶⁾ The VEGF is known to promote axonal regeneration, neurogenesis, neuroprotection, stimulation of glial growth, functional reinnervation and neovascularization.⁽³^,¹⁰⁾ In the denervated muscle, local applications of VEGF attenuate atrophy.⁽³⁾ Like the denervation-induced capillary regression may be associated with downregulation of VEGF, the PBMT could be a choice for increasing the VEGF expression.⁽¹⁴⁾

The increase in VEGF expression found in the denervated muscle in this study was not observed in the sciatic nerve crushed with laser (780nm, 30mW and 15J/cm²).⁽¹⁰⁾ The PBMT parameters, among them the light spectrum, and the crushed nerves interfere in the results and were different between studies.⁽⁵⁾ Regarding the light spectrum, endothelial cells in culture that underwent laser irradiation in the infrared and red spectrum responded significantly to the application of the red spectrum. There was no significant difference in the number of endothelial cells irradiated by infrared laser.⁽²⁷⁾

The higher imunohistochemical expression of VEGF observed in the LED groups, associated with the lower lipid and protein damage found, demonstrated the beneficial effect that neovascularization provides for tissue recovery. We can also highlight the qualitative difference in immunohistochemical expression of VEGF, between 2 and 21 days, in LED groups. Such difference demonstrates that just as the vessels are neoformed, induced by the increased oxygen demand of the injured cells; when the inflammation recedes, decreases the number of vessels, with the degeneration of endothelial cells and vascular regression.⁽²⁸⁾

It is known that PBMT has positive effects on denervated muscles, since it reduces muscle atrophy and improves muscle functions.⁽²⁾ However, no reports about the action of PBMT on oxidative parameters and growth factors in denervated muscles were found in the literature. The current study has found lesser lipid damage in the denervated muscle tissues of LED-irradiated groups. This outcome corroborated with the decreased lipid peroxidation after PBMT application in stressed muscles.⁽¹¹⁾

Crush injuries cause redox imbalance in nerve tissues. Increased ROS and lipid peroxidation, as well as decreased antioxidant activity, were already described in this injury model.⁽⁷⁾ According to Pigna et al.,⁽²⁹⁾ although denervated muscles presented increased ROS, there was no increase in carbonyl groups and in lipid peroxidation. In addition, oxidative stress was not responsible for muscle damage and atrophy. On the other hand, Sayir et al.,⁽³⁰⁾ observed that both neurotmesis and axonotmesis presented increased lipid peroxidation and reduced antioxidant CAT, SOD, glutathione peroxidase and carbonic anhydrase activity in denervated muscles. Abruzo et al.,⁽³¹⁾ also found ROS production and lipid peroxidation in denervated muscles, as well as abundant cytoprotective and antioxidant RNA proteins, such as CAT and SOD, and increased glutathione S-transferase and glutathione peroxidase activity.

The PBMT application site (on the injury, in the current study) should be taken into consideration at the time of analysis of light effects, since different results have already been described after nerve crushing, depending on the light application site.⁽³²⁾ Besides, other factors such as irradiation frequency, energy and power density, emission and irradiation time, should be taken into consideration in PBMT protocols.⁽⁵⁾

Since innervation is an important trophic factor that regulates the functional and structural integrity of muscle tissues, muscle preservation, or decrease of the progressive muscle degeneration are the major challenges in nerve injury cases.⁽³¹⁾ The current study showed that PBMT can be used for muscle and functional preservation purposes after nerve injury. However, it is necessary to conduct further studies focused on evaluating the action of PBMT on the redox state, and growth factors in injured nerves and denervated muscles.

CONCLUSION

The photobiomodulation therapy using LED (630nm; 9J/cm²; 300mW) accelerated the functional recovery, increased immunnohistochemical expression of vascular endothelial growth factor, and reduced lipid peroxidation in denervated muscles at 2 days after injury induction.

ACKNOWLEDGMENTS

To the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (Fapemig) for the financial support (APQ01082-15).

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Efeitos da terapia de fotobiomodulação na recuperação funcional, na angiogênese e no estado redox em músculo desnervado de ratos

RESUMO

Objetivo:

Avaliar os efeitos da terapia de fotobiomodulação no estado redox, no marcador de angiogênese – fator de crescimento endotelial vascular – e na recuperação funcional do músculo desnervado.

Métodos:

Um total de 32 ratas Wistar foi submetido a uma lesão por esmagamento e dividido aleatoriamente em quatro grupos: Grupo Diodo Emissor de Luz 2 e Grupo Controle 2 (músculo coletado 2 dias após a lesão), além do Grupo Diodo Emissor de Luz 21 e do Grupo Controle 21 (músculo coletado 21 dias após a lesão). Grupo Diodo Emissor de Luz 2 e Grupo Diodo Emissor de Luz 21 receberam duas e dez aplicações de diodo emissor de luz (630±20nm, 9J/cm²e 300mW), respectivamente, e Grupo Controle 2 e Grupo Controle 21 não receberam tratamento. A função foi avaliada pelo teste de preensão em quatro momentos (pré-lesão, 2, 10 e 21 dias após a lesão). O músculo flexor dos dedos foi coletado para análise dos parâmetros redox e da imunolocalização do fator de crescimento endotelial vascular.

Resultados:

Houve melhora funcional no segundo e décimo dia pós-lesão nos grupos tratados em comparação aos controles (p<0,005). O tecido muscular dos grupos tratados apresentou maior expressão imuno-histoquímica do fator de crescimento endotelial vascular. A terapia de fotobiomodulação diminuiu o dano oxidativo aos lipídeos no Grupo Diodo Emissor de Luz 2 comparado ao Grupo Controle 2 (p=0,023) no músculo desnervado.

Conclusão:

A terapia de fotobiomodulação acelerou a recuperação funcional, aumentou a angiogênese e reduziu a peroxidação lipídica no músculo desnervado 2 dias após a lesão.

Descritores: Músculos, Lesões por esmagamento, Fototerapia, Estresse oxidativo, Fatores de crescimento do endotélio vascular, Força muscular, Ratos Wistar

INTRODUÇÃO

O sistema nervoso periférico humano responde a lesões axonais por meio de regeneração ativa; porém, o tratamento de nervos periféricos lesados está longe de ser ideal.⁽¹⁾Os pacientes têm grave comprometimento de sua qualidade de vida devido à redução na funcionalidade, e o tratamento ainda está associado a altos custos socioeconômicos.⁽¹^,²⁾Para a recuperação funcional é necessário prevenir a atrofia do músculo esquelético relacionada à desnervação.⁽³⁾

A terapia de fotobiomodulação (TFBM), espectro de luz vermelha (600nm a 700nm) ou infravermelho (770nm a 1.200nm),⁽⁴⁾é amplamente investigada e utilizada para fins de regeneração nervosa.⁽¹⁾Apesar do número considerável de estudos sobre a ação da TFBM na regeneração nervosa, a maioria deles se concentra na realização de análises morfométricas, eletrofisiológicas e funcionais,⁽⁵^,⁶⁾o que leva à escassez de estudos na literatura sobre os mecanismos de ação da TFBM na regeneração nervosa e no músculo desnervado.

O desequilíbrio redox é uma das principais causas de danos neurais ou em órgãos-alvo após lesões. Além disso, pode resultar em uma recuperação funcional retardada do nervo periférico.⁽⁷⁾Os tecidos nervosos são particularmente sensíveis aos radicais livres e parecem inibir o sistema antioxidante quando são lesados.⁽⁷⁾O músculo desnervado apresentou aumento significativo na geração mitocondrial de peróxido de hidrogênio, associado à perda progressiva de massa muscular do músculo tibial anterior, de 7 a 21 dias após a desnervação.⁽⁸⁾As mitocôndrias do músculo tibial anterior desnervado de camundongos mostraram aumento da geração de peróxido 3 dias após a transecção.⁽⁹⁾Esses autores verificaram que a presença de desnervação recente nas fibras musculares em envelhecimento aumentou a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS - reactive oxygen species ) pela mitocôndria de fibras inervadas próximas e fibras desnervadas.

O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é uma citocina multifuncional, que sabidamente promove a regeneração axonal e protege as fibras musculares de degeneração.⁽³^,¹⁰⁾Sabe-se também que o aumento da permeabilidade vascular associada à neovascularização, promovida pelo VEGF, é um evento crucial para o tecido em reparo, porque o aumento do suprimento de sangue para as células lesadas permite que oxigênio e várias citocinas e fatores de crescimento cheguem ao local da lesão.⁽¹⁰⁾

A TFBM afeta o estado redox do tecido muscular lesado, aumenta a expressão gênica de enzimas antioxidantes em células estressadas,⁽¹¹⁾permite a fotodissociação do óxido nítrico (NO) da citocromo c oxidase na mitocôndria e melhora a respiração celular e a produção de trifosfato de adenosina.⁽¹²⁾Além disso, a TFBM diminui a produção de ROS,⁽⁴^,¹¹⁾que, apesar de desempenhar papel essencial na via de sinalização redox necessária para possibilitar eventos biológicos importantes, pode danificar moléculas essenciais a diversos processos celulares.⁽¹³⁾

A TFBM aumenta a expressão imuno-histoquímica da expressão do VEGF no tecido muscular.⁽¹⁴⁾Vários estudos apontam que o VEGF interage com as células satélite do músculo esquelético e promove a regeneração após o trauma.⁽³^,¹⁵⁾Além disso, foi demonstrado que o VEGF tem ação miogênica e antiapoptótica,⁽³⁾parecendo ser capaz de melhorar a restauração da força muscular e reduzir a quantidade de tecido conjuntivo após lesão traumática.⁽¹⁵⁾

Assim, a TFBM torna-se uma boa opção para auxiliar no controle de danos ao nervo lesado e aos tecidos musculares desnervados. Obviamente, a TFBM possui outros mecanismos de ação, além da modificação do estado redox celular e da expressão de fatores de crescimento.⁽⁴^,¹²⁾Entretanto, esses mecanismos certamente devem ser levados em consideração.

OBJETIVO

Investigar o efeito da terapia de fotobiomodulação com diodo emissor de luz sobre o estado redox e a expressão imuno-histoquímica do fator de crescimento endotelial vascular em músculos desnervados em dois momentos distintos após a lesão, bem como analisar a influência dessa terapia na recuperação funcional.

MÉTODOS

Animais e procedimento cirúrgico

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da instituição, sob protocolo 46/2015, e foi realizado no Laboratório de Experimentação Animal do Departamento de Fisioterapia da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri entre setembro de 2017 e dezembro de 2018.

Foram utilizadas 32 ratas Wistar fêmeas (7 semanas de idade; 140 a 190g de peso). Os animais foram acondicionados em caixas (quatro animais em cada) e colocados em sala com ar condicionado (22°C a 23°C), onde tiveram acesso a água/ração ad libitum , e foram submetidos a ciclos de luz de 12 horas.

Os roedores foram anestesiados intraperitonealmente com xilazina 2% e cetamina 10% (0,1mL/100g). Foram colocados em decúbito dorsal para possibilitar a realização da tricotomia e assepsia do local; o nervo mediano direito foi exposto 10mm acima do cotovelo, e uma lesão por esmagamento foi induzida usando uma pinça hemostática padrão, em que o segundo entalhe foi utilizado para manter o esmagamento do nervo. O mesmo foi mantido fechado, durante 2 minutos, para esmagamento do nervo⁽¹⁶⁾( Figura 1 ). A seguir, a pele foi suturada com linha 4-0 e tratada com digluconato de clorexidina (Merthiolate, Gold Lab). Após a cirurgia, os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: Grupo Diodo Emissor de Luz 2 (GL2; oito animais foram submetidos a duas aplicações transcutâneas de TFBM e sacrificados 48 horas após a indução da lesão); Grupo Controle 2 (GC2; oito animais não receberam tratamento e foram sacrificados 48 horas após a indução da lesão); Grupo Diodo Emissor de Luz 21 (GL21; oito animais foram submetidos a dez aplicações de TFBM e sacrificados 21 dias após a indução da lesão) e Grupo Controle 21 (CG21; oito animais não receberam tratamento e foram sacrificados 21 dias após a indução da lesão).

Terapia de fotobiomodulação

Os parâmetros propostos para TFBM utilizando dispositivo de diodo emissor de luz (LED; Bios Therapy II, Bios^®) foram comprimento de onda (630±20nm), potência óptica (300mW), densidade de energia (9J/cm²), densidade de potência (0,3W/cm²), energia (9J), tamanho do ponto (1cm²), tempo de tratamento (30 segundos), modo LED (saída contínua), número de pontos de irradiação (1) e energia total emitida (216J). Os animais foram imobilizados manualmente, e o tratamento foi aplicado por via transcutânea no sítio cirúrgico, em um único ponto. O ângulo do feixe foi mantido perpendicular (90°) à superfície de irradiação.

A aplicação do primeiro procedimento terapêutico foi logo após a cirurgia. O GL2 foi submetido à segunda e última aplicação 24 horas depois. O GL21 foi submetido a dez aplicações (cinco aplicações, sendo uma por dia, com intervalos de 2 dias e, posteriormente, outras cinco aplicações).

Teste funcional

O teste de preensão⁽¹⁷⁾foi aplicado no membro torácico direito dos animais por dois pesquisadores treinados, que desconheciam o grupo experimental de cada animal. Um pesquisador gentilmente erguia os ratos pela cauda e permitia que pegassem uma grade presa a uma balança eletrônica comum. Em seguida, puxava-o com cuidado, enquanto o outro pesquisador registrava o valor negativo gerado. O membro torácico contralateral dos animais era preso com fita adesiva para evitar que agarrasse a grade. O teste foi realizado em quatro diferentes etapas experimentais: pré-lesão, 2, 10 e 21 dias pós-lesão.

Análise imuno-histoquímica

Anticorpos policlonais primários contra VEGF (Novus Bio NB100527) 1:400 foram aplicados em cortes de músculo. Os cortes foram imersos em solução de ácido cítrico a 0,01M, com pH de 6,0, e submetidos à recuperação antigênica de 95°C, por 30 minutos. Em seguida, foi realizado o bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio a 3% por 40 minutos. Os anticorpos primários foram aplicados e incubados por 20 horas em uma câmara úmida a 4°C. Após mais três lavagens em solução salina tamponada,⁽¹⁸⁾anticorpos secundários (Biotinilado/Dako) e terciários (Streptavidina-HRF/Dako) foram aplicados e incubados por 30 minutos, em temperatura ambiente (24°C). A reação de análise imuno-histoquímica foi revelada com diaminobenzidina (DAB; Sigma Co., S. Louis, Estados Unidos) por 1 minuto. No controle negativo, o anticorpo primário foi omitido, e todas as lâminas foram contrastadas com hematoxilina. Todas as fotomicrografias de tecidos para análise de imuno-histoquímica foram feitas em microscópio óptico (Labomed^®LxPol), equipado com câmera Axio CAM HRc e Software Capture Pro 2.9.0.1.

Análise dos parâmetros de estado redox

As amostras foram coletadas com base no protocolo aplicado a cada grupo de animais: 2 e 21 dias após a indução da lesão. Os animais foram pré-anestesiados com 0,1mL/100g de uma mistura de cetamina 10% e xilazina 2%, após a aplicação das mesmas condições assépticas e cirúrgicas adotadas no procedimento inicial. O músculo flexor dos dedos foi totalmente removido. Após esse procedimento, os tecidos musculares retirados foram extensivamente lavados em solução salina tamponada (pH de 7,2), pesados e armazenados em freezer a −80°C, até a análise bioquímica.

Um triturador de tecido Potter-Elvehjem (Corning), mantido em gelo, foi usado para macerar as amostras em solução salina tamponada gelado (0,015M) a pH de 7,4. O homogenato foi dividido em duas alíquotas, de acordo com os ensaios realizados. Uma alíquota foi centrifugada a 5.000g, 4°C, por 5 minutos, e o sobrenadante foi utilizado para analisar as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e a capacidade antioxidante não enzimática dos tecidos. O sedimento foi usado para medir o teor de derivados de carbonila nas proteínas. A outra alíquota foi centrifugada a 10.000g, 4°C, por 10 minutos, e o sobrenadante foi utilizado para avaliar a capacidade antioxidante enzimática dos tecidos, medindo a atividade de enzimas, como superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT).

A concentração de TBARS,⁽¹⁹⁾medida com base na reação do ácido tiobarbitúrico ao malondialdeído (MDA), foi usada para determinar a peroxidação lipídica. Amostras de alíquotas de 0,15mL foram adicionadas a 0,1mL de dodecilsulfato de sódio (SDS; 8,1%), 0,25mL de ácido acético (2,5M; pH de 3,4) e 0,25mL de ácido tiobarbitúrico (0,8%). A mistura foi homogeneizada e incubada a 95°C durante 90 minutos. Após o término desse procedimento, as amostras de músculo foram resfriadas e centrifugadas a 5.000g por 5 minutos, e 0,25mL do sobrenadante foi removido e colocado em uma placa de fundo plano de 96 poços para leitura espectrofotométrica a 532nm. O conteúdo de TBARS foi expresso em nmol MDA/mg de proteína, com base na curva padrão de concentrações conhecidas de MDA. As medições foram realizadas em duplicata.

A capacidade antioxidante não enzimática das amostras foi determinada com base no método do poder antioxidante redutor férrico (FRAP).⁽²⁰⁾Para preparar o reagente FRAP, 25mL de tampão de acetato de sódio (0,3M, pH de 3,6) foram adicionados a 2,5mL de tripiridil triazina (TPTZ; TPTZ 10 mM) e, a seguir, a 2,5mL de cloreto de ferro (FeCl₃H₂O −20mM). Em seguida, uma alíquota de 528μL de reagente FRAP foi adicionada com 72μL de homogenato. A mistura foi homogeneizada e incubada no escuro a 37°C, durante 30 minutos. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas a 300g, por 5 minutos, e o sobrenadante analisado por espectrofotometria (em duplicata) em leitor de microplacas a 593nm. A capacidade antioxidante total das amostras foi determinada com base na curva padrão de concentrações conhecidas de sulfato ferroso (FeSO4) e normalizada com base na quantidade de proteína na amostra; os resultados foram expressos em μM FeSO₄/mg de proteína.

O sedimento homogenato do tecido muscular foi suspenso em 1mL de tampão de fosfato de potássio 50mM (pH de 6,7) contendo ácido etilenodiaminotetracético 1mM (EDTA), e as amostras foram divididas em grupos branco e de teste, para permitir a medição das concentrações de derivados de carbonila nas proteínas.⁽²¹⁾Foi adicionado ácido tricloroacético a 10% a todas as amostras, que foram centrifugadas a 5.000g, a 4°C, por 10 minutos; o sobrenadante foi descartado. Em seguida, foi adicionada 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH; 10mM) diluída em ácido clorídrico (2mM) ao sedimento de teste. O branco foi adicionado com apenas 2mM de ácido clorídrico. As amostras foram mantidas no escuro, em temperatura ambiente, por 30 minutos, e homogeneizadas em vórtice, a cada 15 minutos. Foi adicionado ácido tricloroacético 10% às amostras, que foram homogeneizadas e centrifugadas a 5.000g, 4°C, por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado, e o material sedimentado foi lavado em 1mL de etanol e acetato de etila (1:1) e centrifugado duas vezes, a 5.000g, 4°C, por 10 minutos. Finalmente, o material sedimentado foi dissolvido em SDS a 6% e centrifugado a 10.000g, 4°C, por 10 minutos. O sobrenadante foi analisado por espectrofotometria a 370nm, em leitor de microplacas de 96 poços, com coeficiente de absorção molar DNPH 22.000 M^-1cm^-1. O teor de derivados de carbonila nas proteínas foi expresso em mmol de derivados de carbonila por mg de proteína (mmol/mg de proteína); as medições foram realizadas em triplicado.

A atividade do SOD foi determinada com base na inibição da autoxidação de pirogalol.⁽²²⁾Amostras de cada tecido foram adicionadas a tampão de fosfato de potássio (50mM; pH de 8,2; 37°C), contendo 1mM de ácido dietilenotriaminapentaacético, e a reação foi desencadeada pela adição de 0,2mM pirogalol (1,2,3-benzenotriol). A leitura foi realizada por espectrofotometria, em leitor de microplacas a 420nm, 37°C, por 4 minutos. A atividade de SOD, expressa em U/mg, foi determinada com base na capacidade da enzima de inibir a autoxidação de pirogalol em 50%; as medições foram realizadas em duplicata.

A atividade da CAT foi determinada com base na diminuição da absorbância do peróxido de hidrogênio a 240nm.⁽²³⁾Uma solução de peróxido de hidrogênio a 0,3M foi adicionada às amostras, e a reação decorrente de sua decomposição foi monitorada por espectrofotometria, em cubetas de quartzo a 240nm, 25°C, por 1 minuto; as medições foram realizadas em triplicata. A atividade da CAT foi expressa em milimolar de H₂O₂decomposto por minuto por miligrama de proteína (ΔE/min/mg de proteína).

Análise estatística

A análise estatística foi realizada com o software Prism 5 (GraphPad). Os dados morfométricos e histológicos são apresentados como média±desvio-padrão (DP). As avaliações qualitativas de imuno-histoquímica de amostras de músculo foram analisadas observando-se três cortes de cada um dos animais (n=8)/por grupo=4. Foi utilizado o teste de normalidade Shapiro-Wilk. O teste t para amostras independentes foi utilizado para comparar as variáveis do estado redox dos músculos desnervados e da função do nervo mediano. As diferenças foram consideradas significativas em p<0,05.

RESULTADOS

Os resultados da análise funcional são descritos na tabela 1 . É possível observar que o GL acelerou o retorno funcional nos dois primeiros momentos de avaliação (2 e 10 dias pós-lesão). Não houve diferença significativa na recuperação funcional entre GL21 e GC21 no 21° dia pós-lesão.

Tabela 1. Valores obtidos no teste funcional de preensão.

Grupos	Pré-lesão	2PL	10PL	21PL
GL2	234,40±46,40	1,88±2,59 ^*	-	-
GC2	211,40±42,50	0,00±0,00	-	-
GL21	183,80±37,01	6,25±2,31 ^*	39,38±20,43 ^*	140,00±16,04
GC21	178,10±52,09	1,87±2,58	14,38±5,63	163,80±45,02

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Indica diferença significativa entre o GL2 e o GC2; e o GL21 e o GC21. As diferenças foram consideradas significativas em p<0,05 (teste t para amostras independentes).

PL: pós-lesão; GL2: Grupo Diodo Emissor de Luz 2; GC2: Grupo Controle 2; GL21: Grupo Diodo Emissor de Luz 21; GC21: Grupo Controle 21.

A análise imuno-histoquímica do VEGF mostrou que os músculos desnervados dos grupos tratados expressaram mais coloração do VEGF do que os controles. Essa expressão foi maior no grupo de 2 dias do que no de 21 dias. Os músculos desnervados dos grupos TFBM também expressaram pontos/locais de angiogênese mais próximos quando comparados aos controles ( Figura 2 ).

A figura 3 mostra os resultados dos biomarcadores do estado redox de músculos desnervados em GC2 e GL2. O GL2 apresentou menor concentração de TBARS em músculos desnervados do que o GC2 (p=0,023). A figura 4 mostra os dados dos biomarcadores nos músculos desnervados dos grupos sacrificados 21 dias após a indução da lesão.

DISCUSSÃO

O presente estudo foi o primeiro a descrever a ação da TFBM nos biomarcadores do estado redox e na expressão imuno-histoquímica do VEGF em músculos desnervados associados a respostas funcionais. Os resultados mostraram que a TFBM usando o dispositivo LED após a axonotmese pode aumentar a expressão imuno-histoquímica do VEGF e alterar parâmetros do estado redox, como peroxidação lipídica e dano oxidativo às proteínas, em músculos desnervados.

A TFBM acelerou a recuperação funcional dos animais analisados, uma vez que houve diferenças significativas entre os grupos irradiados e os controles no segundo e no décimo dia pós-lesão.

O teste de preensão adotado no presente estudo é objetivo e eficaz em demonstrar o dia em que teve início a recuperação funcional, bem como sua progressão.⁽¹⁷^,²⁴⁾Estudos realizados com roedores já demonstraram que animais submetidos ao esmagamento do nervo mediano, que permaneceram não tratados, começaram a fletir os dedos no oitavo dia pós-lesão, apresentaram força reduzida no nono dia, bem como melhora satisfatória a partir do décimo dia,⁽¹⁷⁾e recuperaram a plena função 20 a 21 dias após a indução da lesão.⁽²⁵⁾

A recuperação funcional acelerada após a axonotmese já foi descrita para TFBM usando LED. A avaliação da função do nervo ciático de ratos Wistar (o nervo foi lesado com pinça hemostática por 30 segundos) baseou-se no índice funcional do ciático; os ratos tratados com LED apresentaram melhores resultados funcionais no sétimo, 14^oe 21^odias pós-lesão.⁽⁶⁾A data de início e o número de irradiações de LED foram semelhantes aos deste estudo. Porém, os parâmetros comprimento de onda (940nm), densidade de potência (9,5mW/cm²) e densidade de energia (4/cm²) foram diferentes.⁽⁶⁾Além disso, o tempo de compressão do nervo foi diferente, e isso interfere nos resultados.⁽²⁴⁾

O nervo mediano foi selecionado por apresentar menor incidência de contraturas e autotomia, as quais costumam ocorrer nas lesões do nervo ciático. Esses processos podem afetar a avaliação dos parâmetros regenerativos do nervo e acabar não preservando o bem-estar dos animais. A distância entre o nervo mediano e os órgãos-alvo é pequena e permite uma reinervação mais rápida. Além disso, a maioria das lesões nervosas em humanos ocorre nos membros superiores.⁽²⁴⁾

Dentre os fatores neurotróficos envolvidos na regeneração nervosa, o VEGF tem função essencial.⁽²⁶⁾Sabe-se que ele promove regeneração axonal, neurogênese, neuroproteção, estimulação do crescimento glial, reinervação funcional e neovascularização.⁽³^,¹⁰⁾No músculo desnervado, aplicações locais de VEGF atenuam a atrofia.⁽³⁾Como a regressão capilar induzida por desnervação pode estar associada à regulação negativa de VEGF, a TFBM pode ser uma escolha para aumentar a expressão do VEGF.⁽¹⁴⁾

O aumento da expressão do VEGF encontrado no músculo desnervado neste estudo não foi observado no nervo ciático esmagado com laser (780nm, 30mW e 15J/cm²).⁽¹⁰⁾Os parâmetros TFBM, entre eles o espectro de luz, e os nervos lesados interferem nos resultados e foram diferentes entre os estudos.⁽⁵⁾Em relação ao espectro de luz, as células endoteliais em cultura submetidas à irradiação a laser no infravermelho e no espectro vermelho responderam, de forma significativa, à aplicação do espectro vermelho. Não houve diferença significativa no número de células endoteliais irradiadas pelo laser infravermelho.⁽²⁷⁾

A maior expressão imuno-histoquímica de VEGF observada nos grupos LED, associada ao menor dano lipídico e proteico encontrado, demonstrou o efeito benéfico que a neovascularização proporciona para a recuperação do tecido. Também é possível destacar a diferença qualitativa na expressão imuno-histoquímica do VEGF, entre 2 e 21 dias, nos grupos LED. Essa diferença demonstra que, assim como os vasos são formados recentemente, induzidos pelo aumento da demanda de oxigênio das células lesadas, quando a inflamação retrocede, diminui-se o número de vasos, com degeneração das células endoteliais e regressão vascular.⁽²⁸⁾

A TFBM tem efeitos positivos nos músculos desnervados, pois reduz a atrofia muscular e melhora as funções musculares.⁽²⁾No entanto, não foram encontrados na literatura relatos sobre a ação da TFBM sobre os parâmetros oxidativos e fatores de crescimento em músculos desnervados. O estudo atual encontrou menor dano lipídico nos tecidos musculares desnervados de grupos irradiados com LED. Esse resultado corroborou a diminuição da peroxidação lipídica após a aplicação de TFBM em músculos estressados.⁽¹¹⁾

Lesões por esmagamento causam desequilíbrio redox nos tecidos nervosos. Já foram descritos aumento de ROS e peroxidação lipídica, bem como diminuição da atividade antioxidante, nesse modelo de lesão.⁽⁷⁾Segundo Pigna et al.,⁽²⁹⁾embora os músculos desnervados apresentassem aumento de ROS, não houve aumento nos grupos carbonila e em peroxidação lipídica. Além disso, o estresse oxidativo não foi responsável pelo dano muscular e pela atrofia. Por outro lado, Sayir et al.,⁽³⁰⁾observaram que tanto a neurotmese quanto a axonotmese apresentaram aumento da peroxidação lipídica e redução da atividade antioxidante da CAT, do SOD, da glutationa peroxidase e da anidrase carbônica em músculos desnervados. Abruzo et al.,⁽³¹⁾também encontraram produção de ROS e peroxidação lipídica em músculos desnervados, além de abundantes proteínas de RNA citoprotetoras e antioxidantes, como CAT e SOD, e aumento da atividade da glutationa S-transferase e da glutationa peroxidase.

O local de aplicação da TFBM (na lesão, no presente estudo) deve ser levado em conta na hora de analisar os efeitos da luz, uma vez que diferentes resultados já foram descritos após o esmagamento do nervo, dependendo do local de aplicação da luz.⁽³²⁾Além disso, outros fatores, como frequência de irradiação, densidade de energia e potência, emissão e tempo de irradiação, devem ser considerados nos protocolos de TFBM.⁽⁵⁾

Visto que a inervação é um importante fator trófico que regula a integridade funcional e estrutural dos tecidos musculares, a preservação muscular ou a diminuição da degeneração muscular progressiva são os principais desafios nos casos de lesão nervosa.⁽³¹⁾O presente estudo mostrou que a TFBM pode ser usada para fins de preservação muscular e funcional após lesão do nervo. No entanto, faz-se necessária a realização de mais estudos voltados para a avaliação da ação da TFBM sobre o estado redox e os fatores de crescimento em nervos lesados e músculos desnervados.

CONCLUSÃO

A terapia de fotobiomodulação com LED (630nm; 9J/cm²; 300mW) acelerou a recuperação funcional, aumentou a expressão imuno-histoquímica do fator de crescimento endotelial vascular e reduziu a peroxidação lipídica em músculos desnervados 2 dias após a indução da lesão.

AGRADECIMENTOS

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (Fapemig), pelo apoio financeiro (APQ01082-15).

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PERMALINK

Effects of photobiomodulation therapy on functional recovery, angiogenesis and redox status in denervated muscle of rats

Jéssica Junia Aparecida Cardoso Nascimento

Alex Sander Dias Machado

Giovanna Moura Lamas Della-Santa

Danielle Cristina Fernandes

Marcílio Coelho Ferreira

Gustavo Augusto Pereira Machado

Bruna Carolina Garcia Chaves

Karine Beatriz Costa

Etel Rocha-Vieira

Murilo Xavier Oliveira

Thais Peixoto Gaiad

Ana Paula Santos

ABSTRACT

Objective:

Methods:

Results:

Conclusion:

INTRODUCTION

OBJECTIVE

METHODS

Animals and surgical procedure

Figure 1. Median nerve crush, 10mm above the elbow. Arrow indicates the injury site.

Photobiomodulation therapy

Functional test

Immunohistochemistry analysis

Analyses of redox state parameters

Statistical analysis

RESULTS

Table 1. Values obtained in the grasping functional test.

Figure 3. Redox state parameters in the denervated muscle on the second post-injury day in the control and light emitting diode groups. A) Carbonylated protein; B) Thiobarbituric-acid-reactive substances; C) Catalase; D) Ferric reducing antioxidant power; E) Superoxide dismutase.

Figure 4. Redox state parameters in the denervated muscle on the 21st day post-injury in the control and light emitting diode groups. A) Carbonylated protein; B) Thiobarbituric-acid-reactive substances; C) Catalase; D) Ferric reducing antioxidant power; E) Superoxide dismutase.

DISCUSSION

CONCLUSION

ACKNOWLEDGMENTS

REFERENCES

Efeitos da terapia de fotobiomodulação na recuperação funcional, na angiogênese e no estado redox em músculo desnervado de ratos

Jéssica Junia Aparecida Cardoso Nascimento

Alex Sander Dias Machado

Giovanna Moura Lamas Della-Santa

Danielle Cristina Fernandes

Marcílio Coelho Ferreira

Gustavo Augusto Pereira Machado

Bruna Carolina Garcia Chaves

Karine Beatriz Costa

Etel Rocha-Vieira

Murilo Xavier Oliveira

Thais Peixoto Gaiad

Ana Paula Santos

RESUMO

Objetivo:

Métodos:

Resultados:

Conclusão:

INTRODUÇÃO

OBJETIVO

MÉTODOS

Animais e procedimento cirúrgico

Figura 1. Esmagamento do nervo mediano 10mm acima do cotovelo. A seta indica o local da lesão.

Terapia de fotobiomodulação

Teste funcional

Análise imuno-histoquímica

Análise dos parâmetros de estado redox

Análise estatística

RESULTADOS

Tabela 1. Valores obtidos no teste funcional de preensão.

Figura 3. Parâmetros de estado redox no músculo desnervado no segundo dia pós-lesão no grupo controle e no grupo com diodo emissor de luz. A) Proteína carbonilada; B) Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico; C) Catalase; D) Poder antioxidante redutor férrico; E) Superóxido dismutase.

Figura 4. Parâmetros do estado redox nos músculos desnervados no 21° dia pós-lesão nos grupos controle e de diodo emissor de luz. A) Proteína carbonilada; B) Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico; C) Catalase; D) Poder antioxidante redutor férrico; E) Superóxido dismutase.

DISCUSSÃO

CONCLUSÃO

AGRADECIMENTOS

ACTIONS

PERMALINK

RESOURCES

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Figure 4. Redox state parameters in the denervated muscle on the 21^st day post-injury in the control and light emitting diode groups. A) Carbonylated protein; B) Thiobarbituric-acid-reactive substances; C) Catalase; D) Ferric reducing antioxidant power; E) Superoxide dismutase.