非编码 RNA 调控骨关节炎的分子生物学研究进展

Abstract

目的

总结非编码 RNA 调控骨关节炎（osteoarthritis，OA）的分子生物学研究进展，为生物学研究及临床治疗 OA 提供参考。

方法

广泛查阅近年国内外有关非编码 RNA 调控 OA 病理过程的相关研究报道，并进行总结。

结果

根据 RNA 长度可将非编码 RNA 分为 3 类。相关研究采用高通量测序技术以及基因芯片技术筛选出大量与 OA 发病过程相关的非编码 RNA，并经 RT-PCR 验证此类非编码 RNA 多参与了 OA 的调控；通过对 OA 中表达最显著的非编码 RNA 进行基因敲减及过表达，明确了其调控 OA 的作用靶点；以及了解了非编码 RNA 间以及非编码 RNA 与编码 RNA 间存在复杂的基因共表达网络拓扑结构，为明确基因间结构及功能的相互作用、寻求 OA 治疗靶点提供线索。

结论

目前对于非编码 RNA 调控 OA 病理过程的分子生物学机制已有初步研究，但每个非编码 RNA 发挥调控作用的关键结构或序列，以及其效应复合结构的组建及相互作用机制仍未明确，有待进一步研究。

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是临床常见疾病，以骨关节软骨退行性改变为特征，目前 OA 发病率呈逐年上升趋势，并成为中国老年人群慢性致残的主要原因^[1-2]。传统治疗方法，例如物理疗法、药物治疗、关节腔注射疗法以及手术等，仅能通过改善关节腔内炎性环境、纠正下肢不合理力线等缓解临床症状，不能从病理学机制上真正阻断及延缓 OA 的发展，治疗效果有限，目前对治疗方法的选择也一直存在争议^[3-4]。

非编码 RNA 是指一类能从基因组转录得到，但不编码蛋白质的 RNA^[5]。根据 RNA 长度可将其分为 3 类：① 长度小于 50 nt，包括微小 RNA（microRNA，miRNA）、小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）、新型非编码小 RNA（Piwi-interacting RNA，priRNA）；② 长度在 50～500 nt 之间，包括核糖体 RNA（ribosome RNA，rRNA）、转移 RNA（transfer RNA，tRNA）；③ 长度大于 500 nt，包括长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA），以及一种区别于传统线性 RNA 具有闭合环状结构的环状 RNA（circular RNA，circRNA）^[6]。以往学者们常忽视非编码 RNA 的作用，将这类 RNA 看作“垃圾 RNA”，但随着科学思维及实验室技术的进步，越来越多研究发现非编码 RNA 表达异常与 OA 发展密切相关^[7]。若能找到非编码 RNA 在 OA 发展过程中起关键作用的部分，并针对该环节设计药物进行靶向治疗，有望从根本上阻断及治疗 OA。本文对非编码 RNA 调控 OA 的分子生物学机制研究进行综述，为生物学研究及临床治疗 OA 提供参考。

1. lncRNA 在 OA 中的调控作用

1.1. 作用机制

lncRNA 是非编码 RNA 中长度大于 500 nt 的一类 RNA。lncRNA 起初未受到研究者们关注，被认为是基因组转录的“噪音”，是 RNA 聚合酶 Ⅱ 转录过程中的副产物，不具备生物学特性^[8]。但近年研究发现，lncRNA 参与调控多种重要生物学过程，包括基因组印记、染色体修饰、染色体沉默、转录干扰、转录激活等，它可与 RNA、DNA 及蛋白相互作用而发挥重要功能。lncRNA 能在多个层面调控基因表达，主要包括表观遗传学调控、转录调控以及转录后调控^[9]，其表达异常会引起相关蛋白转录、表达失控，最终导致疾病发生。

1.2. 相关研究

随着基因芯片及高通量测序技术的发展，相关研究已证实 lncRNA 在 OA 病理过程中具有重要作用。Suzuki 等^[10] 使用微阵列分析技术进行了初步探索，发现软骨分化过程中 lncRNA 表达量会产生变化。在该过程中，超过 3 000 种 lncRNA 发生量变，其中 3 种 lncRNA（ZBED3-AS1、CTA-941F9.9、ENST00000433576.1）表达明显上调，1 种（LINCC00707）表达下调。该研究虽证实了 lncRNA 在软骨分化过程中发生量变，但未深入研究其变化与软骨分化的具体联系以及进行进一步的临床应用，不能指导临床 OA 的治疗。同时，由于研究者未记录完整阵列，存在遗漏发生量变 lncRNA 的问题，从而限制了对 lncRNA 调控机制的深入研究。

Chimal-Monroy 等^[11] 及 Lehmann 等^[12] 在单纯量变研究基础上，对 lncRNA 调控机制进行了进一步探索。他们采用 RNA 荧光原位杂交技术在鼠四肢间叶细胞胞核内发现了 TGF-β诱导的同源框基因 A 转录产物 lncRNA（lncRNA-homeobox A transcript induced by TGF-β，lncRNA-HIT），通过敲减四肢间叶细胞内的 lncRNA-HIT，软骨分化受到抑制，提示 lncRNA-HIT 表达变化会影响软骨细胞分化功能，在软骨分化中可能具有重要作用。该研究通过基因敲减技术进一步验证了 lncRNA 表达量变化在软骨分化中的作用，为临床治疗提供了重要思路。

但是仅明确表达量异常的 lncRNA 对软骨分化的作用不能用于治疗 OA。为此，Fu 等^[13] 使用基因芯片技术筛选出 OA 软骨中相对于正常软骨表达异常的 lncRNA 及 mRNA，研究了 lncRNA 及 mRNA 间相互关系，对 lncRNA 作用靶点进行了预测。他们发现，与正常软骨相比，OA 软骨中变化倍数超过 2 倍的 lncRNA 中，有 3 007 个表达上调、1 707 个表达下调；变化倍数超过 2 倍的 mRNA 中，有 2 136 个表达上调、2 241 个表达下调。之后通过基因本体分析、路径分析、共表达网络分析及靶点预测等技术，发现 lncRNA 与 mRNA 之间存在共表达关系。明确 OA 病理过程中异常变化的 lncRNA 及 mRNA 的庞大网络联系，探索其调控靶点，不仅能针对该靶点寻找或合成靶向治疗药物，还能提升 lncRNA 的应用价值，如作为诊断标志物等。

lncRNA 在 OA 中作用的研究已逐步深入，明确 lncRNA 在细胞内位置及含量，分析其上、下游是否存在协调或拮抗作用基因，以及如何利用这些关系寻找药物治疗靶点等，都是下一步研究方向。

2. miRNA 在 OA 中的调控作用

2.1. 作用机制

miRNA 广泛存在于动物、植物、病毒等有机体中，通过与其互补的 mRNA 选择性地结合，抑制蛋白产生。miRNA 通常位于内含子区域内或基因间，其细胞核内含有 RNA 聚合酶 Ⅱ 转录产生的具有帽子结构和多聚核苷酸尾巴结构的初始 miRNA（preliminary miRNA，pri-miRNA）。pri-miRNA 为具有发卡结构的 miRNA 前体，经 Dicer 酶剪切为长度约 22 nt 的双链 miRNA，双链 miRNA 再降解后形成成熟的单链 miRNA。最后成熟的单链 miRNA 还需要与 Argonaute 蛋白等组装，构建为 RNA 诱导沉默复合体。该复合体通过作用于特异 mRNA 的 3′UTR，抑制翻译过程或降解 mRNA，最终调控基因表达^[14-16]。

2.2. 相关研究

早期研究认为 OA 患者关节软骨、滑膜、关节液内的 miRNA 均存在变化，并通过测序技术发现了多种 miRNA 表达异常，如 miRNA-9、miRNA-140、miRNA-146、miRNA-223、miRNA-483 等^[17]。随着 OA 的发生，软骨表面因受到多种趋化因子激活而释放破坏软骨基质的酶类，Kostopoulou 等^[18] 及 Tardif 等^[19] 认为 miRNA 的功能与这类酶有关，他们发现 OA 相关 miRNA 能对基质金属蛋白酶 13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）产生抑制作用。而 MMP-13 是 OA 中具有重要生物学作用的一类人体蛋白酶，它可降解软骨细胞外基质，破坏关节软骨，引发及加重 OA。Li 等^[20] 认为在同一时间内，调控 OA 软骨的 miRNA 可能有多个，他们发现 miRNA-27b 及 miRNA-146a 在软骨细胞中可共同抑制 MMP-13 及血管性血友病因子裂解酶的表达。其中，miRNA-27b 能够直接靶向作用于 MMP-13 的 mRNA，同时 miRNA-27b 的表达又受到促分裂原活化蛋白激酶及 NF-κB 信号通路抑制；而 miRNA-146a 在 OA 早期呈高表达，OA 晚期表达量显著下降，同时它又受到 IL-1β信号通路调控，抑制 MMP-13 的表达，并与 miRNA-27b 一同抑制 OA。沉默信息调节因子 1（silent information regulator 1，SIRT1）具有抗炎及保护软骨的作用。Park 等^[21] 的研究拟探索 miRNA-449a 对 OA 的调控作用，并寻找具体调控路径。他们首先使用 miRNA 靶基因预测软件找到 SIRT1 mRNA 上 3′UTR 与 miRNA-449a 的结合位点；然后用 miRNA-449a 及 miRNA-449a 拮抗剂转染 SIRT1 过表达和敲减细胞，并使用 IL-1β进行刺激；最后用 RT-PCR 及 Western blot 技术检测发生变化的基因。结果发现，OA 及 IL-1β诱导的软骨细胞中 miRNA-449a 表达量增加，在 IL-1β刺激的 OA 软骨细胞中 miRNA-449a 表达量及 MMP-13 含量有所增加，而 Ⅱ 型胶原蛋白及 SIRT1 含量降低。因此，他们认为沉默 miRNA-449a 可以靶向作用于 SIRT1，抑制分解基因表达以及保护合成基因表达，从而抑制 IL-1β介导的软骨损伤。以上研究表明，miRNA 对 OA 的调控存在一个复杂的关系网，下一步研究需要明确及梳理这些关系及信号通路，寻找共同作用靶点，最终从基因层面调控 OA，达到临床治疗目的。

3. siRNA 在 OA 中的调控作用

3.1. 作用机制

siRNA 是长度小于 50 nt 的小分子非编码 RNA，与 miRNA 相似，由 Dicer 酶加工而成，通过诱导同源性双链 RNA 而沉默靶 mRNA，使其降解而发挥干扰作用；也可经由多种不同转染技术导入细胞内，并对特定基因产生特异性敲减效果，达到其干扰效应^[16]。

3.2. 相关研究

许多药物设计都是基于靶基因抑制作用，因此 siRNA 这种独特的干扰效应可广泛应用于 OA 靶向药物设计。传统实验方法为直接转染合成 siRNA 阻断基因表达，但该方式不稳定，siRNA 易在体内降解。目前常使用慢病毒作为载体来介导 siRNA，该方式较为稳定、持久^[22]。宁仁德等^[23] 将慢病毒介导的 siRNA 沉默细胞外信号调节激酶 2 溶液注射至创伤性关节炎大鼠膝关节腔内（实验组），并与注射 PBS 液（空白对照组）及细胞外信号调节激酶 2 siRNA 阴性溶液（阴性对照组）大鼠进行比较。结果发现，与两对照组相比，实验组大鼠膝关节软骨形态评分及关节软骨评分均较低，MMP-3、13 mRNA 表达量亦降低，但 Ⅱ 型胶原 mRNA 表达量增高，表明由慢病毒介导的 siRNA 沉默细胞外信号调节激酶 2 可有效抑制 OA 发展。因此，在明确某种基因的作用机制及靶点后，可以使用 siRNA 技术对该基因进行沉默，从而达到抑制 OA 发展的目的。

4. circRNA 在 OA 中的调控作用

4.1. 作用机制

circRNA 具有区别于常规 RNA 线性结构的环状结构，主要存在于真核转录组中。circRNA 由外显子序列组成，在组织及生物体不同发育阶段具有表达特异性，在不同物种间则具有保守性。circRNA 对核酸酶不敏感，故比线性 RNA 更稳定，因而在疾病诊断标志物方面具有独特优势。另外，研究还发现，circRNA 可竞争性结合 miRNA，调控靶基因表达，有望在疾病调控方面发挥作用^[24-25]。

4.2. 相关研究

Liu 等^[26] 使用生物学信息技术进行研究，发现相比于正常软骨，OA 软骨中有 71 种 circRNA 特异性表达，而使用 IL-1 和 TNF 刺激软骨后，软骨细胞外基质相关 circRNA（hondrocyte extracellular matrix-related circRNA，circRNA-CER）的表达明显上调，使用 siRNA 沉默 circRNA-CER 后 MMP-13 表达量降低，而细胞外基质形成增加，提示 circRNA-CER 可竞争性抑制 miRNA-136，阻断其作用，减少 MMP-13 表达，从而作为 OA 的治疗靶点。

5. 各种非编码 RNA 间相互联系在 OA 中的调控作用

每种非编码 RNA 除能单独调控 OA 发生、发展外，它们之间还能形成合作或拮抗关系，参与 OA 病理过程^[27]。lncRNA 在转录后调控过程中与 miRNA 共同作用参与 OA 调控；circRNA 可以通过“海绵”作用将 miRNA 与靶 mRNA 隔离开，从而抑制 miRNA 的调控作用^[26]。研究发现，lncRNA 能够作用于线粒体，并产生两种 miRNA：RMRP-S1 和 RMRP-S2，这两种 miRNA 可通过调控 PTCH2 和 SOX4 的 mRNA，调控软骨发育不良^[28]。Liu 等^[26] 发现在 circRNA-CER 的 3′UTR 序列上有 5 种miRNA 的结合位点，这些 miRNA 分别是 miRNA-636、miRNA-665、miRNA-217、miRNA-646、miRNA-136。通过生物信息学技术分析这些 miRNA、circRNA-CER 以及 MMP-13 的靶基因后发现，miRNA-136 与 MMP-13 的 3′UTR 序列也存在互补，因此 circRNA-CER 可通过竞争性结合 miRNA-136 发挥其“海绵”作用，即阻止 miRNA-136 发挥作用，从而调控 OA。

除了不同种类非编码 RNA 之间相互协调或拮抗调控 OA 外，同一种非编码 RNA 间的不同亚分类也可协调调控 OA。Nakamura 等^[29] 研究发现，miRNA-181a-5p 和 miRNA-4454 协同降低关节软骨表面 Ⅱ 型胶原蛋白的表达；他们在采用经 IL-1β刺激处理的 OA 软骨细胞中加入 miRNA-181a-5p 和 miRNA-4454 抑制剂，发现 TNF-A、IL-6 及单核细胞诱导蛋白 1 显著降低，Ⅱ 型胶原蛋白表达增加，表明 miRNA-181a-5p 和 miRNA-4454 能加重炎性反应、降解 Ⅱ 型胶原蛋白，进而破坏软骨代谢，促进 OA 的发展。

6. 总结及展望

目前，相关研究通过高通量测序技术以及基因芯片技术已筛出与大量 OA 发病过程相关的非编码 RNA，并经 RT-PCR 验证此类非编码 RNA 多参与了 OA 的调控；通过对 OA 中表达最显著的非编码 RNA 进行基因敲减及过表达，明确了其调控 OA 的作用靶点；有研究还明确了在 OA 治疗方面起关键作用的非编码 RNA 间以及非编码 RNA 与编码 RNA间复杂的基因共表达网络拓扑结构，为明确基因间结构及功能的相互作用、寻求 OA 治疗靶点提供线索^[30]。

有学者通过研究大量非编码 RNA，提出了竞争性内源 RNA 的假说，这是一种表达调控模式的新概念。该假说认为 mRNA、lncRNA 等转录产物间竞争性结合相同的 miRNA 来调控各自的表达，最终影响生物细胞功能^[31]。该假说的提出是临床结合分子生物学技术的突破，但疾病的发生发展是涉及基因层面、内外环境、信号通路等各方面复杂的综合病理结果，需要深入研究的问题还很多。下一步需要尽可能多地发掘 OA 相关的 lncRNA，找到其位于细胞内的具体位置、起作用的片段、作用靶点、靶点数目、基因间匹配强度、双链体稳定性，周围起协同或是拮抗作用的同一类或是非同一类基因片段，以此制备靶向治疗药物，为 OA 诊治提供新方法。

Funding Statement

云南省创新团队项目（2014HC018）；国家自然科学基金资助项目（81460340）

Innovation Team Item of Yunnan Province (2014HC018); National Natural Science Foundation of China (81460340)