Abstract
目的
探讨低氧诱导因子 1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）基因在大鼠终板软骨细胞中的表达情况及其与终板软骨细胞凋亡的关系。
方法
取 8 只 10 周龄 SPF 级雄性 SD 大鼠 L1～5 腰椎终板软骨组织，采用酶消化法分离培养终板软骨细胞并传代，取第 3 代细胞进行实验。首先将终板软骨细胞分为两组，分别于 20% O2 常氧条件下（A 组）以及 0.5% O2 低氧下条件（B 组）培养；培养 24 h，倒置相差显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞凋亡率，实时荧光定量 PCR 检测 HIF-1α 基因表达，Western blot 检测凋亡蛋白 HIF-1α、Bax、Bcl-2 表达。然后，构建 LipofectaminTM2000 载体试剂和 HIF-1α siRNA/ LipofectaminTM2000 载体混合剂分别转染终板软骨细胞后，于 0.5% O2 低氧条件下培养（分别为 C、D 组）。培养 24 h 后，倒置相差显微镜下观察细胞形态，行 HIF-1α 免疫荧光染色观察，流式细胞仪检测细胞凋亡率，实时荧光定量 PCR 检测 HIF-1α、Ⅱ 型胶原、蛋白多糖、SOX9 基因表达，Western blot 检测凋亡蛋白 HIF-1α、Bax、Bcl-2 表达。
结果
培养 24 h 后，A、B 组均见少量空泡坏死细胞；细胞凋亡率比较差异无统计学意义（t=1.026，P=0.471）；B 组 HIF-1α 基因及蛋白相对表达量显著高于 A 组（t=22.672，P=0.015；t=18.396，P=0.013）；两组 Bax、Bcl-2 蛋白表达比较，差异均无统计学意义（t=0.594，P=0.781；t=1.251，P=0.342）。低氧培养 24 h 后，D 组空泡坏死细胞较 C 组增多，且可见大量 HIF-1α 阳性终板软骨细胞；与 C 组相比，D 组细胞凋亡率显著增高（t=27.143，P=0.002），D 组 HIF-1α、Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9 基因表达较 C 组显著降低（t=21.097，P=0.015；t=34.829，P=0.002；t=18.673，P=0.022；t=31.949，P=0.007），HIF-1α、Bcl-2 蛋白相对表达量较 C 组均显著降低（t=37.648，P=0.006；t=16.729，P=0.036），而 Bax 蛋白表达较 C 组提高（t=25.583，P=0.011）。
结论
缺氧条件下，终板软骨细胞中 HIF-1α 表达上调，以提高细胞耐氧性；HIF-1α 可抑制终板软骨细胞在低氧环境中发生凋亡。
Keywords: 低氧诱导因子 1α, 终板软骨细胞, 细胞凋亡, 大鼠
Abstract
Objective
To explore the expression and significance of hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) in endplate chondrocytes, and to study the relations between HIF-1α expression and endplate chondrocytes apoptosis.
Methods
Eight Sprague Dawley rats were selected to obtain the L1-5 intervertebral disc endplate; the endplate chondrocytes were isolated by enzyme digestion method, and the endplate chondrocytes at passage 3 were cultured under 20% O2 condition (group A), and under 0.5% O2 condition (group B). Cell morphology was observed by inverted phase contrast microscope and cell apoptosis was detected using flow cytometry after cultured for 24 hours; the mRNA expression of HIF-1α was detected by real-time fluorescent quantitative PCR, the protein expressions of HIF-1α, Bax, and Bcl-2 by Western blot. Gene clone technology to design and synthesize two siRNAs based on the sequence of HIF-1α mRNA. HIF-1α specific RNAi sequence compound was constructed and transfected into cells. The transfected endplate chondrocytes at passage 3 were cultured under 0.5% O2 condition in group C and group D (HIF-1α gene was silenced). After cultured for 24 hours, cells were observed via immunofluorescence staining of HIF-1α, and cell apoptosis was detected using flow cytometry. Meanwhile, the mRNA expressions of HIF-1α, collagen type II (COL II), Aggrecan, and SOX9 were detected by real-time fluorescent quantitative PCR, and the protein expressions of HIF-1α, Bax, and Bcl-2 by Western blot.
Results
At 24 hours after culture, small amount of vacuoles necrotic cells could be observed in group A and group B; there was no significant difference in apoptosis rate between groups A and B (t=1.026, P=0.471), and HIF-1α mRNA and protein expressions in group B were significantly higher than those in group A (t=22.672, P=0.015; t=18.396, P=0.013), but, there was no significant difference in protein expressions of Bax and Bcl-2 between groups A and B (t=0.594, P=0.781; t=1.251, P=0.342). The number of vacuolar necrosis cells in group D was significantly higher than that in group C, and HIF-1α positive cells were observed in group D. The apoptosis rate of group D was significantly higher than that of group C (t=27.143, P=0.002). The mRNA expressions of HIF-1α, COL II, Aggrecan, and SOX9 in group D were significantly lower than those in group C (t=21.097, P=0.015; t=34.829, P=0.002; t=18.673, P=0.022; t=31.949, P=0.007). The protein expressions of HIF-1α and Bcl-2 in group D were significantly lower than those in group C (t=37.648, P=0.006; t=16.729, P=0.036), but the protein expression of Bax in group D was significantly higher than that in group C (t=25.583, P=0.011).
Conclusion
HIF-1α mRNA expression is up-regulated under hypoxia condition, which will increase the hypoxia tolerance of endplate chondrocytes. Cell apoptosis is suppressed by the activation of HIF-1α in endplate chondrocytes under hypoxia condition.
Keywords: Hypoxia-inducible factor 1α, endplate chondrocytes, apoptosis, rat
终板软骨与关节软骨一样不含血管组织，主要靠渗透作用供给椎间盘营养物质，随着机体的老化，终板软骨逐渐退变，氧气等营养物质供应及排除受阻，加上压力及炎症等因素，终板软骨细胞以及细胞外基质会逐渐减少[1-2]。低氧诱导因子 1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）是细胞为了适应低氧环境的重要调节因子，也是一种基因转录核调节因子。研究显示，HIF-1α 受细胞内氧分压精细调节，在组织低氧环境下 HIF-1α 表达增高[3-4]。因此，为了解低氧环境下 HIF-1α 在终板软骨细胞中的代偿机制，我们将终板软骨细胞在体外进行不同浓度氧环境处理以及干预 HIF-1α 基因表达后低氧条件下培养细胞，观察 HIF-1α 基因表达变化以及终板软骨细胞凋亡情况。报告如下。
1. 材料与方法
1.1. 实验动物及主要试剂、仪器
10 周龄 SPF 级雄性 SD 大鼠 8 只，体质量 220～260 g，由广东省医学实验动物中心提供。实验前适应性喂养 1 周。
DMEM/F12（HyClone 公司，美国）；FBS、0.25% 胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、FBS（GIBCO 公司，美国）；Trizol、Annexin V 凋亡试剂盒（Invitrogen 公司，美国）；LipofectaminTM2000 载体试剂（Olagen 公司，德国）；PrimeScriptTM RT-PCR 试剂盒、SYBR green Ⅰ real time PCR Kit 试剂盒（TaKaRa 公司，日本）；兔抗鼠 HIF-1α 多克隆抗体（Sigma 公司，美国）；山羊抗大鼠 Bax 多克隆抗体、山羊抗大鼠 Bcl-2 多克隆抗体（Oncogen 公司，美国）；山羊抗兔二抗、小鼠抗山羊二抗（北京中衫金桥生物技术有限公司）；GAPDH（上海碧云天生物技术有限公司）；DAB（北京诺博莱德科技有限公司）。流式细胞仪、细胞孵箱（Thermo Fisher 公司，美国）；紫外分光光度计（Tecan 公司，瑞士）；倒置相差显微镜（Olympus 公司，日本）。
1.2. 终板软骨细胞分离培养
采用酶消化法[5]分离培养终板软骨细胞。取 8 只 SD 大鼠颈椎脱臼法处死，无菌条件下取 L1～5 椎间盘终板软骨组织，剪碎至 1 mm×1 mm×1 mm 大小，加入 0.25% 胰蛋白酶消化 15 min，以离心半径 3 cm，1 000 r/min 离心 5 min；去上清，加入 0.05%Ⅱ型胶原酶，消化 3 h 后过滤离心，以离心半径 3 cm，1 000 r/min 离心 5 min；去上清，加入含 10% FBS 培养液，置于 37℃、5% CO2 细胞培养箱中进行培养，隔日换液。待细胞融合至 80% 消化传代。取第 3 代细胞进行实验。
1.3. 常氧及低氧培养条件对终板软骨细胞的影响
根据培养条件不同，将终板软骨细胞分为两组，20% O2 常氧条件下培养组（A 组）以及 0.5% O2 低氧条件下培养组（B 组）。采用气体混合器调节 O2 浓度为 20% 和 0.5%（总流量 2 000 mL/min，CO2 100 mL/min，O2 为 400 mL/min 或 10 mL/min，余为 N2）。将终板软骨细胞按照 1×105 个/孔置于缺氧盒中，检查密闭性良好后，持续充入浓度为 20% 或 0.5% O2 5 min，缺氧盒密封后置于 37℃、饱和湿度孵箱中培养，每 12 小时更换培养液。培养 24 h 后取细胞进行观测。
1.4. HIF-1α 对低氧培养条件下终板软骨细胞的影响
参照文献[6]方法筛选有效 HIF-1α siRNA，正义链序列 5'-GAAACUCUUCCAAGCAAUUTT-3'，反义链序列 5'-AAUUGCUUGGAAGAGUUUCTT-3'。将 siRNA 溶液与脂质体 LipofectaminTM2000 载体试剂混合，形成 HIF-1α siRNA/LipofectaminTM2000 载体复合物。将终板软骨细胞接种至 6 孔板，每孔 1×105 个细胞，于孔板内加入 LipofectaminTM2000 载体试剂作为阴性对照组（C 组），加入 HIF-1α siRNA/LipofectaminTM2000 载体复合物作为 HIF-1α 基因沉默组（D 组）。转染 6 h 后更换培养液，然后按照 1.3 方法于 0.5% O2 低氧条件下培养。培养 24 h 取细胞进行观测。
1.5. 观测指标
1.5.1 细胞形态观察 倒置相差显微镜下观察各组细胞形态及生长情况。取 C、D 组细胞，参照文献[7]方法进行 HIF-1α 免疫荧光染色，HIF-1α 蛋白阳性染色呈绿色。
1.5.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率 将各组细胞置于 0.25% 胰蛋白酶（不含 EDTA）消化后，收集细胞加入 PBS，以离心半径 3 cm，1 000 r/min 离心 3 min，弃上清，重复 2 次；加入预先配制的 Annexin V，制成 500 μL 浓度为 1×106 个/mL的细胞悬液。先后加入 5 μL Annexin V-FITC 结合物和 5 μL 碘化丙啶。室温下避光培养 15 min，上机检测。
1.5.3 实时荧光定量 PCR 检测 HIF-1α、Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9 基因表达 取各组细胞加入 Trizol 试剂提取总 RNA，逆转录成 cDNA，利用 SYBR green Ⅰ real time PCR Kit 试剂盒扩增目的基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成，GAPDH 作为内参，各引物序列见表 1。采用 2–ΔΔCt 法检测相关基因的相对表达量。其中 A、B 组仅检测 HIF-1α 基因，C、D 组检测 HIF-1α、Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9 基因。
表 1.
Primer sequences and product size for target genes
目的基因引物序列及产物长度
| 基因
Gene |
引物序列
Primer sequence |
产物长度（bp）
Product size（bp） |
| HIF-1α | 上游 5′-AAGTCTAGGGATGCAGCAC-3′
Upstream 下游 5′-CCAGATCACCAGCATCTAG-3′ Downstream |
122 |
| SOX9 | 上游 5′-CGTCAACGGCTCCAGCA-3′
Upstream 下游 5′-TGCGCCCACACCATGA-3′ Downstream |
69 |
| Ⅱ型胶原
COL II |
上游 5′-CCTGAAACTCTGCCACCCAG-3′
Upstream 下游 5′-GTTCTTCCGAGGCACAGTCG-3′ Downstream |
151 |
| 蛋白多糖
Aggrecan |
上游 5′-CTAGCTGCTTAGCAGGGATAACG-3′
Upstream 下游 5′-TGACCCGCAGAGTCACAAAG-3′ Downstream |
108 |
| GAPDH | 上游 5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′
Upstream 下游 5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′ Downstream |
252 |
1.5.4 Western blot 检测 HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表达 取各组细胞加入裂解液裂解 30 min 后，以离心半径 3 cm，12 000 r/min 离心 30 min，取上清，BCA 法蛋白定量后调整至同等浓度，每孔上样 40 μg，经 12% SDS-PAGE 凝胶电泳后转移至聚偏氟乙烯膜，5% 脱脂奶粉封闭 1 h，加入 TBST 稀释的 HIF-1α（1∶2 000）、Bax（1∶2 000）、Bcl-2（1∶5 000）一抗 4℃ 过夜，TBST 洗膜 3 次，加入二抗（1∶2 000）室温孵育 2 h，TBST 洗膜 3 次，DAB 显色，加入化学显示剂后定影。以与 GAPDH 蛋白条带灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。
1.6. 统计学方法
采用 SPSS18.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2. 结果
2.1. 常氧及低氧培养条件对终板软骨细胞的影响
2.1.1 细胞形态观察 培养 24 h A、B 组细胞爬满瓶底，倒置相差显微镜下观察，终板软骨细胞为梭形、多边形，呈铺路石样，出现接触抑制，并可见少量空泡坏死细胞，两组细胞形态无显著区别。见图 1a、b。
图 1.
Observation of endplate chondrocytes under normoxia and hypoxia culture conditions for 24 hours a. Morphological observation of endplate chondrocytes in group A (Inverted phase contrast microscope×20); b. Morphological observation of endplate chondrocytes in group B (Inverted phase contrast microscope×20); c. Cell apoptosis by flow cytometry in group A; d. Cell apoptosis by flow cytometry in group B; e. The protein expressions of HIF-1α, Bax, and Bcl-2 by Western blot 1: Group A; 2: Group B
常氧及低氧培养条件下培养 24 h 细胞观察 a. A 组细胞形态观察（倒置相差显微镜×20）； b. B 组细胞形态观察（倒置相差显微镜×20）； c. A 组流式细胞仪检测； d. B 组流式细胞仪检测； e. Western blot 检测 HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表达 1：A 组； 2：B 组
2.1.2 流式细胞仪检测 培养 24 h，A 组细胞凋亡率为 2.51%±0.38%，B 组为 2.63%±0.29%，两组细胞凋亡率比较差异无统计学意义（t=1.026，P=0.471）。见图 1c、d。
2.1.3 实时荧光定量 PCR 检测 培养 24 h，A 组 HIF-1α 基因相对表达量为 0.47±0.03，B 组为 1.02±0.09；B 组 HIF-1α 基因表达显著高于 A 组，比较差异有统计学意义（t=22.672，P=0.015）。
2.1.4 Western blot 检测 A 组 HIF-1α 蛋白相对表达量为 1.01±0.12，B 组为 6.92±0.48；B 组 HIF-1α 蛋白表达显著高于 A 组，比较差异有统计学意义（t=18.396，P=0.013）。A 组 Bax、Bcl-2 蛋白相对表达量分别为 0.97±0.08、1.03±0.11，B 组分别为 0.76±0.07、0.69±0.08；两组以上两蛋白表达比较，差异均无统计学意义（t=0.594，P=0.781；t=1.251，P=0.342）。见图 1e。
2.2. HIF-1α 对低氧培养条件下终板软骨细胞的影响
2.2.1 细胞形态观察 倒置相差显微镜下观察示，低氧培养 24 h，C 组终板软骨细胞呈长梭形，细胞质丰富，局部有空泡坏死细胞，但数量较少；D 组细胞胞质固缩，并出现大量漂浮空泡坏死细胞。见图 2a、b。HIF-1α 免疫荧光染色观察示，D 组可见大量绿染的终板软骨细胞，而 C 组未见绿染的终板软骨细胞。见图 2c、d。
图 2.
Observation of endplate chondrocytes under hypoxia culture condition for 24 hours a. Morphological observation of endplate chondrocytes in group C (Inverted phase contrast microscope×40); b. Morphological observation of endplate chondrocytes in group D (Inverted phase contrast microscope×40); c. Observation of HIF-1α immunofluorescence staining in group C (Fluorescence microscopy×400); d. Observation of HIF-1α immunofluorescence staining in group D (Fluorescence microscopy×400); e. Cell apoptosis by flow cytometry in group C; f. Cell apoptosis by flow cytometry in group D; g. The protein expressions of HIF-1α, Bax, and Bcl-2 by Western blot 1: Group C; 2: Group D
低氧培养条件下培养 24 h 后 C、D 组细胞观察 a. C 组细胞形态观察（倒置相差显微镜×40）； b. D 组细胞形态观察（倒置相差显微镜×40）； c. C 组 HIF-1α 免疫荧光染色观察（荧光显微镜×400）； d. D 组 HIF-1α 免疫荧光染色观察（荧光显微镜×400）； e. C 组流式细胞仪检测； f. D 组流式细胞仪检测； g. Western blot 检测 HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白表达 1：C 组； 2：D 组
2.2.2 流式细胞仪检测 低氧培养 24 h，C 组细胞凋亡率为 7.64%±0.68%，D 组为 26.77%±0.98%；D 组细胞凋亡率显著高于 C 组，比较差异有统计学意义（t=27.143，P=0.002）。见图 2e、f。
2.2.3 实时荧光定量 PCR 检测 低氧培养 24 h，C 组 HIF-1α、Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9 基因相对表达量分别为 1.02±0.12、1.03±0.14、1.01±0.09、1.05±0.09，D 组分别为 0.11±0.01、0.83±0.07、0.29±0.03、0.59±0.06，C 组以上目的基因表达均显著高于 D 组，比较差异有统计学意义（t=21.097，P=0.015；t=34.829，P=0.002；t=18.673，P=0.022；t=31.949，P=0.007）。
2.2.4 Western blot 检测 低氧培养 24 h，C 组 HIF-1α、Bax、Bcl-2 蛋白相对表达量分别为 5.83±0.62、1.01±0.09、4.63±0.52，D 组分别为 1.04±0.18、3.48±0.12、0.56±0.07；C 组 HIF-1α、Bcl-2 蛋白表达均显著高于 D 组（t=37.648，P=0.006；t=16.729，P=0.036），而 Bax 蛋白表达显著低于 D 组（t=25.583，P=0.011）。见图 2g。
3. 讨论
终板软骨在保护椎骨及维持椎间盘稳定方面具有重要作用，由于终板软骨内缺少血管和神经，终板软骨细胞长期处于低氧状态[8-9]。为模拟体内缺氧环境及探索 HIF-1α 是否在终板软骨细胞中表达，我们对常氧和低氧条件下培养的终板软骨细胞进行观测。结果显示，与常氧条件培养细胞相比，低氧条件下终板软骨细胞未发生明显凋亡，HIF-1α 基因和蛋白大量表达，而凋亡蛋白 Bax 和 Bcl-2 无明显变化。提示 HIF-1α 在低氧条件下大量表达，以提高终板软骨细胞耐低氧能力，抑制细胞自发性凋亡。
为验证低氧环境下 HIF-1α 在终板软骨细胞内所起作用，以及进一步探索 HIF-1α 基因与终板软骨细胞凋亡的关系，我们设计在 0.5% O2 低氧条件下，通过 RNA 干扰技术，选择性抑制 HIF-1α 基因表达，发现在抑制 HIF-1α 基因表达后，细胞凋亡率显著提高，Bax 蛋白大量表达，Bcl-2 蛋白表达明显抑制，HIF-1α 基因受抑制后细胞大量凋亡，提示 HIF-1α 基因在低氧环境下可抑制终板软骨细胞凋亡，并且 HIF-1α 基因抑制后，软骨特异性基因Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX9 基因表达也明显受到抑制，提示 HIF-1α 基因在低氧环境下对终板软骨细胞起保护作用。
本研究发现 HIF-1α 保护终板软骨细胞，抑制其凋亡，分析原因可能有以下两方面：其一，低氧条件下终板软骨细胞几乎完全依靠无氧糖酵解维持细胞能量代谢[10-11]，HIF-1α 能通过上调葡萄糖转运蛋白表达，促进葡萄糖和线粒体在终板软骨细胞内代谢，维持代谢平衡[12]；其二，退变的终板软骨以钙化和低氧为特征[13-14]，本研究表明在低氧条件下因 HIF-1α 基因表达上调，终板软骨细胞未发生明显凋亡。Fas/FasL 信号通路是重要凋亡通路之一，而半乳糖凝集素 3 是已知能够有效抑制 Fas 配体介导的细胞凋亡因子，而 HIF-1α 可与半乳糖凝集素 3 反应元件结合，协同抑制 Fas/FasL 信号通路介导的细胞凋亡[15-16]。另外，VEGF-A 与血管内皮因子受体 1 结合可促进细胞凋亡，而 CITED2（Cbp/ p300-interacting transactivator with Glu/Asp-rich carboxy-terminal domain 2）可抑制 VEGF 介导的细胞凋亡，低氧条件下 HIF-1α 可调节 p300 结合蛋白 CITED2 启动子活性，抑制 VEGF 表达条件细胞凋亡，从而提高细胞在低氧环境中成活率[17-19]。
综上述，在缺氧情况下，终板软骨细胞 HIF-1α 表达上调，提高细胞耐氧性，并抑制细胞凋亡，其具体生物学功能及相关机制有待深入研究。
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