Abstract
目的
比较内翻畸形膝关节骨关节炎内、外侧胫骨平台软骨下骨中硬化蛋白表达差异，探讨其发生机制及意义。
方法
取 2015 年 3 月—10 月 20 例接受人工全膝关节置换术的内翻畸形膝关节骨关节炎患者自愿捐赠的胫骨平台标本。其中，男 8 例，女 12 例；年龄 61～78 岁，平均 67.8 岁。病程 2～5 年，平均 3.2 年。术前均摄膝关节 X 线片，测量内翻角为 12.0～25.5°，平均 17.6°；Kellgren-Lawrance 分级：Ⅲ级 5 例、Ⅳ级 15 例，均以内侧间室病变为主。取内、外侧胫骨平台软骨下骨行 Micro-CT 检查，比较骨结构变化差异；测量骨体积分数（bone volume/total volume，BV/TV）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、结构模型指数（structure model index，SMI）、骨小梁分离度（trabecular separation，Tb.Sp）；行免疫组织化学染色及实时荧光定量 PCR 检测硬化蛋白以及 sost 基因表达水平。
结果
Micro-CT 显示，与外侧软骨下骨相比，内侧软骨下骨骨量增加，孔隙减少；内侧软骨下骨 BV/TV、Tb.N、Tb.Th 较外侧显著增高，SMI、Tb.Sp 较外侧显著降低，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。实时荧光定量 PCR 检测，内侧胫骨平台软骨下骨中 sost 基因表达为 1.000，外侧为 4.157±2.790，比较差异有统计学意义（t=2.371，P=0.040）。内侧软骨下骨中硬化蛋白表达阳性细胞所占百分比为 7.20%±0.04%，较外侧软骨下骨（52.00%±0.19%）显著降低，比较差异有统计学意义（t=5.094，P=0.005）。
结论
内翻畸形膝关节骨关节炎患者的内侧胫骨平台软骨下骨成骨增加，硬化蛋白表达降低可能是促进骨重塑、加重膝内翻畸形的一个重要因素。
Keywords: 骨关节炎, 软骨下骨, 骨重塑, 硬化蛋白
Abstract
Objective
To study the expression difference of Sclerostin in the medial and lateral subchondral bone of the varus osteoarthritic knee plateau.
Methods
The tibial plateau was obtained from 20 patients with varus knee osteoarthritis receiving total knee arthroplasty from March to October 2015. There were 8 males and 12 females with an average age of 67.8 years (range, 61-78 years). The mean course of osteoarthritis was 3.2 years (range, 2-5 years). Before operation, the varus angle was 12.0-25.5° (mean, 17.6°) on the X-ray film. Five cases were rated as grade III and 15 cases as grade IV according to Kellgren-Lawrance classification. Micro-CT scan was performed on the medial and lateral subchondral bone to compare the changes of bone structure; bone volume/total volume (BV/TV), trabecular number (Tb.N), trabecular thickness (Tb.Th), structure model index (SMI), and the trabecular separation (Tb.Sp) were measured. Immunohistochemistry and real-time fluorescent quantitative PCR were used to test the expressions of Sclerostin protein and sost gene.
Results
Micro-CT showed that BV/TV, Tb.N, and Tb.Th significantly increased in the medial subchondral bone when compared with the lateral part (P<0.05), but SMI and Tb.Sp significantly reduced (P<0.05). Real-time fluorescent quantitative PCR detection showed that sost gene expression level in the medial subchondral bone (1.000) was significantly lower than that in the lateral part (4.157±2.790) (t=2.371, P=0.040). The percentage of Sclerostin positive cells in the lateral subchondral bone (52.00%±0.19%) was significantly higher than that in the medial subchondral bone (7.20%±0.04%) (t=5.094, P=0.005).
Conclusion
Sclerostin plays an important role in the subchondral bone remodeling of the varus osteoarthritic knee. And the low expression of Sclerostin may be an important factor to promote bone remodeling and aggravate knee deformity.
Keywords: Osteoarthritis, subchondral bone, bone remodeling, Sclerostin
骨关节炎是以软骨退变、软骨下骨硬化、骨赘形成和关节滑膜炎性反应为特征的退行性疾病，我国膝关节骨关节炎患者往往表现为膝内翻畸形。近年，学者们开始探讨软骨下骨骨重塑在骨关节炎发生、发展中的作用[1]。有学者提出软骨下骨硬化导致上方软骨承受负荷增加，可能是引起骨关节炎的重要机制[2-3]。软骨下骨与软骨之间通过神经、血管相连并进行信息传递和物质交换[4-5]。越来越多的基础和临床研究发现，软骨下骨骨重塑与骨关节炎密切相关[6-7]。
骨关节炎中软骨下骨的骨重塑主要表现为成骨活跃、破骨抑制，进而表现为骨量增加、骨硬化。硬化蛋白是一个主要由成熟骨细胞分泌的成骨抑制因子，它由位于 17 号染色体上的 sost 基因编码[8]。与正常关节软骨下骨相比，骨关节炎关节的软骨下骨中硬化蛋白表达水平显著降低[9]，提示硬化蛋白与骨关节炎的发生、发展具有相关性。但在同一关节不同部位以及不同程度骨关节炎中硬化蛋白表达差异及其意义尚缺少研究。本研究拟通过自身对照，比较内翻畸形膝关节内、外侧胫骨平台软骨下骨中硬化蛋白表达差异，以及软骨下骨骨结构改变情况，进一步探讨硬化蛋白与膝关节骨关节炎发生、发展的相关性，为深入研究膝关节骨关节炎发生机制以及治疗方法提供参考。报告如下。
1. 材料与方法
1.1. 实验标本
实验用软骨下骨标本由 2015 年 3 月—10 月南京医科大学附属上海一院临床医学院收治的 20 例内翻畸形膝关节骨关节炎患者自愿捐赠。其中，男 8 例，女 12 例；年龄 61～78 岁，平均 67.8 岁。体质量 55.0～67.5 kg，平均 59.8 kg。身高 159.0～171.0 cm，平均 163.4 cm。骨关节炎病程 2～5 年，平均 3.2 年。术前均摄膝关节 X 线片，测量内翻角为 12.0～25.5°，平均 17.6°；Kellgren-Lawrance 分级[10]：Ⅲ级 5 例、Ⅳ级 15 例；均以内侧间室病变为主（图 1a）。根据病史和术前检查结果，排除类风湿性关节炎、创伤性关节炎，患者均无膝关节手术史。
图 1.
Specimen observation a. Preoperative X-ray film; b. The medial cartilage surface wear was more obvious than the lateral side; c. The medial subchondral bone sclerosis was more obvious than the lateral side
实验标本观察 a. 术前 X 线片； b. 大体观察内侧软骨面磨损较外侧明显； c. 大体观察内侧软骨下骨硬化程度较外侧明显增加
人工全膝关节置换术中切取胫骨平台时，大体观察见内侧软骨面磨损以及软骨下骨硬化程度均较外侧明显增加（图 1b、c），4 例内侧间室关节间隙消失伴严重膝关节内翻畸形。生理盐水冲洗标本，去除半月板及周围软组织。用内径为 1 cm 的圆形孔钻分别在每例患者内、外侧胫骨平台钻取 3 块圆柱状软骨和软骨下骨复合组织进行观测。
1.2. 主要试剂及仪器
GTVision 抗鼠/兔通用型免疫组织化学试剂盒、抗硬化蛋白抗体（Sigma 公司，美国）；Trizol（Invitrogen 公司，美国）；PrimeScriptTMRT Master Mix 试剂盒、SYBR® Fast qPCR Mix 试剂盒（TaKaRa 公司，日本）。Micro-CT（杭州越波生物科技有限公司）；NanoDrop2000 紫外分光光度计（NanoDrop 公司，美国）；ViiA7 实时荧光定量 PCR 仪（ABI 公司，美国）；台式高速离心机（Thermo 公司，英国）。
1.3. 观测指标
1.3.1 Mirco-CT 观测 每例患者内、外侧各取 1 块标本，置于 4% 多聚甲醛固定 24 h 后，行 Micro-CT 扫描观察骨结构变化，计算骨体积分数（bone volume/total volume，BV/TV）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、结构模型指数（structure model index，SMI）、骨小梁分离度（trabecular separation，Tb.Sp）。
1.3.2 实时荧光定量 PCR 检测 每例患者内、外侧各取 1 块标本，液氮速冻后，研磨成粉末状并转移至离心管，采用 Trizol 一步法提取组织 RNA，NanoDrop2000 紫外分光光度计检测 RNA 纯度后，PrimeScriptTMRT Master Mix 试剂盒进行逆转录，SYBR® Fast qPCR Mix 试剂盒行 PCR。反应步骤：50℃ 预变性 2 min，95℃ 变性 30 s，95℃ 退火 5 s，60℃ 延伸 30 s，共 40 个循环，72℃ 延伸 10 min。分别测定目的基因 sost 及内参基因 β-actin 的 Ct 值，采用 2–ΔΔCt 法计算 sost 基因表达量。以每例患者内侧软骨下骨中 sost 基因表达水平为参照，计算外侧软骨下骨 sost 基因表达水平。见表 1。
表 1.
Primer sequence of target gene
目的基因引物序列
| 目的基因
Gene |
引物序列
Primer sequence |
| sost | 上游 TGCTGGTACACACAGCCTTC
Upstream 下游 GTCACGTAGCGGGTGAAGTG Downstream |
| β-actin | 上游 CCGTGAAAAGATGACCCAGATC
Upstream 下游 CACAGCCTGGATGGCTACGT Downstream |
1.3.3 免疫组织化学染色观察 每例患者内、外侧各取 1 块标本，置于 4% 多聚甲醛固定 24 h，10% EDTA 脱钙液脱钙 4 周，脱水包埋，4 μm 厚切片，免疫组织化学染色后镜下观察，细胞质呈棕黄色颗粒状沉积为硬化蛋白阳性细胞。于 200 倍镜下，内、外侧标本各随机选取 5 张切片，每张切片取 5 个视野进行细胞计数，计算阳性细胞占全部细胞百分比。
1.4. 统计学方法
采用 SPSS12.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用配对 t 检验；检验水准 α=0.05。
2. 结果
2.1. Micro-CT 观测
扫描观察显示，与外侧软骨下骨相比，内侧软骨下骨骨量增加，孔隙减少（图 2）。骨结构参数测量显示，内侧软骨下骨 BV/TV、Tb.N、Tb.Th 较外侧显著增高，SMI、Tb.Sp 较外侧显著降低，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 2。
图 2.
Micro-CT observation a, b. The medial subchondral bone; c, d. The lateral subchondral bone
Mirco-CT 观察 a、b. 内侧软骨下骨； c、d. 外侧软骨下骨
表 2.
Comparison of bone structure parameters between the lateral and medial subchondral bone (n=20,
)
内、外侧软骨下骨骨结构参数比较（n=20，
）
| 侧别
Side |
BV/TV（%） | Tb.N（/mm） | Tb.Th（mm） | SMI | Tb.Sp（mm） |
| 外侧
Lateral |
0.147±0.021 | 1.706±0.184 | 0.087±0.011 | 1.244±0.350 | 0.505±0.066 |
| 内侧
Medial |
0.357±0.061 | 2.302±0.268 | 0.155±0.013 | –0.297±0.575 | 0.285±0.064 |
| 统计值
Statistic |
t =6.513
P=0.005 |
t =3.661
P=0.001 |
t =8.050
P=0.010 |
t =4.580
P=0.032 |
t =4.789
P=0.000 |
2.2. 实时荧光定量 PCR 检测
内侧软骨下骨中 sost 基因表达为 1.000，与外侧（4.157±2.790）相比显著降低，比较差异有统计学意义（t=2.371，P=0.040）。
2.3. 免疫组织化学染色观察
镜下观察见，与内侧软骨下骨相比，外侧软骨下骨中阳性细胞显著增多（图 3）。内侧软骨下骨中硬化蛋白表达阳性细胞所占百分比为 7.20%±0.04%，较外侧软骨下骨（52.00%±0.19%）显著降低，比较差异有统计学意义（t=5.094，P=0.005）。
图 3.
Immunohistochemical staining observation a. The medial subchondral bone (×100); b. The medial subchondral bone (×200); c. The lateral subchondral bone (×100); d. The lateral subchondral bone (×200)
免疫组织化学染色观察 a. 内侧软骨下骨（×100）； b. 内侧软骨下骨（×200）； c. 外侧软骨下骨（×100）； d. 外侧软骨下骨（×200）
3. 讨论
本研究通过比较骨关节炎患者的膝关节内、外侧胫骨平台软骨下骨骨结构改变以及硬化蛋白表达水平差异，发现与外侧软骨下骨相比，在骨关节炎更严重的内侧软骨下骨中，骨量明显增加且硬化蛋白表达水平降低。有研究发现，在小鼠骨关节炎模型中，随着骨关节炎的进展，软骨下骨骨重塑表现为早期骨吸收增加、晚期成骨增加，并且这些骨结构改变发生在软骨退变之前，因此认为软骨下骨的改变可能是骨关节炎发生、发展的重要因素[11]。研究显示，随着骨关节炎的进展，软骨下骨中的矿物质/胶原比值呈渐进性下降趋势，骨硬度和弹性模量也随之降低[11]，这也可能导致骨关节炎进一步发展。本研究标本大体观察和X线片检查发现，患者内侧骨关节炎程度较外侧严重，标本关节软骨磨损程度和软骨下骨骨硬化程度均显著高于外侧，与既往相关研究报道的软骨下骨成骨增加与骨关节炎进展成正相关的结果[12]一致。另外，Micro-CT 观测结果也表明，内、外侧软骨下骨骨结构改变存在明显差异。内侧软骨下骨成骨较外侧明显增加，表现为 BV/TV、Tb.N、Tb.Th 显著增高，而 SMI、Tb.Sp 显著降低，与 Finnilä 等[13]的研究结果一致。以上结果均提示骨关节炎越严重，软骨下骨骨增生、骨硬化程度越明显。
硬化蛋白主要由成熟骨细胞分泌，既往研究证实骨关节炎软骨下骨中骨细胞硬化蛋白表达减少可能是引起局部骨硬化的重要因素，在骨关节炎发生、发展中发挥重要作用[14]。体内、体外实验研究均提示，局部应力增加使骨细胞硬化蛋白表达减少[15-16]，应力负荷的改变可能是影响软骨下骨中硬化蛋白表达的重要因素。在内翻畸形膝关节骨关节炎发生、发展过程中，膝关节内侧间室退变逐渐加重，膝内翻导致内侧间室应力负荷增加，可能进一步影响内侧软骨下骨中硬化蛋白表达水平，两者互为影响因素。因此，我们认为膝内翻畸形的发生虽然与下肢力线、骨关节炎进展等因素有关，也可能与内、外侧软骨下骨中硬化蛋白表达水平改变有一定联系。
在明确内翻畸形膝关节骨关节炎软骨下骨结构变化的基础上，我们以硬化蛋白为基点，进一步探究软骨下骨结构变化的原因。据文献报道，骨关节炎软骨下骨中骨重塑的改变与成骨、破骨失衡有关，其中 sost 基因编码的硬化蛋白是一种重要的骨重塑调节因子[14, 17]。研究发现，软骨下骨中 sost 的表达与骨关节炎具有相关性[18]。硬化蛋白可以通过阻断 Wnt/β-catenin 信号通路抑制成骨细胞的活性，减少成骨活动，其抑制剂可以抑制硬化蛋白的活性从而刺激成骨[14]。因此，硬化蛋白抑制剂在治疗骨折不愈合与骨质疏松方面具有广阔前景[19-21]。本研究免疫组织化学染色以及实时荧光定量 PCR 检测提示，骨关节炎越严重、软骨下骨硬化越明显，硬化蛋白表达水平越低，说明硬化蛋白可能通过调节软骨下骨骨重塑进而影响骨关节炎进程。这一结果对于临床判断骨关节炎软骨下骨骨重塑情况具有指导意义。
综上所述，硬化蛋白是影响软骨下骨骨重塑的重要因素，与膝关节骨关节炎的发生、进展密切相关。膝关节软骨下骨的骨结构改变与关节炎进展、结构破坏以及关节置换紧密相关[22]，因此软骨下骨有望作为治疗骨关节炎的重要靶组织，硬化蛋白也可能作为治疗的靶分子而发挥作用。
Funding Statement
上海市卫生和计划生育委员会基金资助项目（20164Y0270）
Shanghai Municipal Health and Family Planning Commission Funds (20164Y0270)
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