Abstract
目的
探讨 IL-10 基因修饰的 BMSCs 对大鼠脑缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）炎性因子及神经细胞凋亡的影响。
方法
取 SD 大鼠骨髓，采用贴壁培养法分离培养 BMSCs，经免疫组织化学染色鉴定后，取第 3 代 BMSCs 以重组腺病毒（recombinant adenovirus，Ad）介导 IL-10 基因转染（AdIL-10-BMSCs）。取 40 只清洁级成年 SD 雄性大鼠，采用线栓法制备大脑中动脉阻塞模型后随机分为 4 组，每组 10 只。模型制备后 3 h 于各组大鼠尾静脉注射 1 mL 含 10%FBS 的 L-DMEM 培养液（A 组）、61.78 ng IL-10（B 组）、1 mL BMSCs 悬液（细胞浓度为 2×106 个/mL，C 组）、1 mL AdIL-10-BMSCs 悬液（细胞浓度 2×106 个/mL，D 组）。C、D 组细胞移植前采用 BrdU 标记。7 d 后大鼠经颈总动脉灌注处死取脑组织，免疫染色法检测小胶质细胞（OX42）表达，ELISA 法测定 TNF-α、IL-1β含量，TUNEL 法检测神经细胞凋亡；取 C、D 组组织行 BrdU 免疫荧光染色观察。
结果
C、D 组脑组织中均见呈绿色荧光的 Brdu 阳性细胞，主要分布于梗死区周围的纹状体、大脑皮质、皮质下等。免疫组织化学染色示，B、C、D 组 OX42 阳性细胞数明显少于 A 组，D 组少于 B、C 组，比较差异有统计学意义（P<0.05）。ELISA 检测示 D 组大鼠脑组织中 TNF-α、IL-1β含量较其余 3 组明显降低（P<0.05）。TUNEL 法检测各组凋亡细胞（TUNEL 阳性细胞）主要见于梗死灶周围的纹状体及额顶皮质下脑组织（相当于缺血半暗带），D 组与 A、B、C 组比较差异有统计学意义（P<0.05）。
结论
AdIL-10-BMSCs 能通过抑制小胶质细胞分泌促炎性因子 TNF-α、IL-1β，抑制梗死灶周围脑组织神经细胞凋亡，对大鼠脑 IRI 起保护作用。
Keywords: BMSCs, IL-10, 大脑中动脉阻塞, TNF-α, IL-1β, 细胞凋亡, 大鼠
Abstract
Objective
To explore the effects of interleukin 10 (IL-10) gene modified bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) on the expression of inflammatory cytokines and neuronal apoptosis in rats after cerebral ischemia reperfusion injury.
Methods
BMSCs were cultured by whole bone marrow adherence screening method. The properties of BMSCs were identified by immunocytochemical methods. BMSCs at passage 3 were transfected with recombinant adenovirus IL-10 gene (AdIL-10-BMSCs). The model of middle cerebral artery occlusion was made in 40 adult male Sprague Dawley rats by thread embolism method. The rats were randomly divided into 4 groups (n=10). At 3 hours after modelling, the rats of groups A, B, C, and D received tail intravenous injection of 1 mL L-DMEM medium containing 10% FBS, 61.78 ng IL-10, 1 mL BMSCs suspension (2×106 cells/mL), and 1 mL AdIL-10-BMSCs cell suspension (2×106 cells/mL), respectively. The cells were labelled with BrdU before cell transplantation in groups C and D. At 7 days after reperfusion, the brain tissue was harvested to detect the expression of OX42 by immunohistochemical assay, to determine the concentration of tumor necrosis factor α (TNF-α) and IL-1β by ELISA, and to detect the apoptosis by TUNEL assay. BrdU labelled cells were observed by immunofluorescence staining in groups C and D.
Results
BrdU labelled positive cells with green fluorescence were observed in the brain tissue of groups C and D, which mainly distributed in the striatum, cerebral cortex, and subcortex around the infarction area. The number of OX42 positive cells was significantly less in groups B, C, and D than group A (P<0.05), and in group D than groups B and C (P<0.05). Compared with the other 3 groups, the contents of TNF-α and IL-1β significantly decreased in group D (P<0.05). TUNEL assay showed that the apoptotic cells (TUNEL positive cells) were mainly seen in the striatum and fronto parietal subcortical tissues (equivalent to ischemic penumbra). The number of TUNEL positive cells in group D was significantly less than that in groups A, B, and C (P<0.05).
Conclusion
AdIL-10-BMSCs can inhibit secretion of TNF-α and IL-1β from microglial cells and inhibit the nerve cell apoptosis around infarct brain tissue, which might contribute to its protective role upon cerebral ischemia reperfusion injury.
Keywords: Bone marrow mesenchymal stem cells, interleukin 10, middle cerebral artery occlusion, tumor necrosis factor α, interleukin 1β, apoptosis, rats
据报道，脑卒中已升为中国国民第 1 位死因，并且发病年龄呈年轻化趋势，严重威胁国民生命健康和生活质量[1]。其中 80% 脑卒中为缺血性，快速再灌注是缺血性脑卒中重要治疗策略，但溶栓治疗后出现的缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）会进一步加重原组织损伤，炎症损伤和凋亡基因激活是导致 IRI 的主要因素[2-3]。研究表明通过抑制炎性反应、小胶质细胞活性，降低梗死病灶周围炎性介质浓度水平，可以缩小脑梗死体积，显著改善神经功能[4-5]。
我们前期研究将携带 IL-10 基因的腺病毒载体（recombinant adenovirus IL-10，Ad IL-10）转染至 BMSCs（AdIL-10-BMSCs），并将其移植至大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）缺血 2 h 大鼠模型，结果显示 AdIL-10-BMSCs 对大鼠大脑 IRI 有保护作用[6]。本实验旨在进一步观察移植 AdIL-10-BMSCs 后，大鼠大脑缺血性病灶及周围组织内小胶质细胞、TNF-α、IL-1β表达变化，以及神经细胞凋亡情况，探讨 AdIL-10-BMSCs 对缺血性脑卒中的保护机制。报告如下。
1. 材料与方法
1.1. 实验动物及主要试剂、仪器
清洁级成年 SD 雄性大鼠 45 只，体质量 250～300 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。AdIL-10 由上海吉凯基因技术有限公司提供。BrdU（Sigma 公司，美国）；小鼠抗大鼠 OX42 单克隆抗体（Abcam 公司，英国）；TNF-α ELISA 试剂盒、IL-1β ELISA 试剂盒（R&D 公司，美国）；一步法 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒、DAPI 染色液、FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG（江苏碧云天生物科技有限公司）；小鼠抗 BrdU 单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
MCO-5AC 型 CO2 培养箱、酶标仪（SANYO 公司，日本）；倒置相差显微镜（Olympus 公司，日本）；荧光显微镜、CM1900 冰冻切片机、RM2015 石蜡切片机（Leica 公司，德国）。
1.2. AdIL-10-BMSCs 制备
取 5 只大鼠骨髓采用贴壁培养法分离培养 BMSCs[7]，取第 3 代细胞行免疫组织化学染色鉴定，显示细胞 CD44 阳性、CD34 阴性，提示培养细胞为 BMSCs。取第 3 代 BMSCs，参照本课题组方法[6] 将 AdIL-10 基因转染至细胞，制备 AdIL-10-BMSCs。均于移植前 24 h 制备，备用。
1.3. 实验分组及方法
取 40 只大鼠制备 MCAO 模型，10% 水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，选择右侧大脑中动脉，通过颈外动脉将线栓插入颈内动脉至大脑中动脉，栓子从颈内动脉和颈外动脉分叉处进入 1.8～1.9 cm。栓塞 2 h 后拔出栓子，制备 MACO 缺血 2 h 模型。然后，将大鼠模型随机分为 A、B、C、D 4 组，每组 10 只。模型制备后 3 h 于各组大鼠尾静脉注射对应试剂或细胞，A 组注射 1 mL 含 10%FBS 的 L-DMEM 培养液；B 组注射 61.78 ng IL-10（采用 ELISA 法测得 1 mL AdIL-10-BMSCs 中的 IL-10 表达量）；C 组注射 1 mL BMSCs 悬液，细胞浓度为 2×106 个/mL；D 组：注射 1 mL AdIL-10-BMSCs 悬液，细胞浓度 2×106 个/mL。C、D 组细胞移植前 72 h 采用 10 μg/mL BrdU 孵育标记。7 d 后大鼠经颈总动脉灌注处死，取脑组织进行以下观测。
1.4. 观测指标
1.4.1 一般情况 观察实验期间各组动物存活情况。
1.4.2 BrdU 免疫荧光染色观察 各组取 4 只大鼠脑组织置于 4% 多聚甲醛固定 24 h，放入脑模中，于视交叉处行冠状切片，片厚 2 mm。取前囟（2 片）及小脑（4 片）组织常规石蜡包埋，连续冠状切片，片厚 7 μm，制备石蜡切片。取 C、D 组部分切片常规脱蜡至水，0.04% 胃蛋白酶室温下修复 6 min，正常羊血清封闭，滴加小鼠抗 BrdU 单克隆抗体（1∶300），4℃ 过夜，滴加 FITC 标记的羊抗小鼠 IgG，防淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察绿色荧光细胞。
1.4.3 免疫组织化学染色观察 各组取 3 只大鼠脑组织按照顺序置于 4% 多聚甲醛固定 4 h，20% 蔗糖溶液 4 h，30% 蔗糖溶液中直至组织标本沉底； 0.01mol/L PBS 缓冲液冲洗后，将脑组织放入脑模中，同 1.4.2 方法切片。取前囟（2 片）及小脑（4 片）组织置于冰冻切片机，行冠状连续冰冻切片，片厚 20 μm。枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，3%H2O2 溶液消除内源性过氧化物酶活性，正常羊血清封闭，滴加小鼠抗大鼠 OX42 单克隆抗体（1∶500），4℃ 过夜，滴加生物素化山羊抗小鼠二抗工作液，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，DAB 避光显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。镜下观察 OX42 阳性细胞呈棕褐色，胞体大，突起短而粗，呈典型的“阿米巴样”。高倍镜下（×400），各组取 5 张切片，每张切片取 5 个视野，计数 OX42 阳性细胞。
1.4.4 ELISA 检测 TNF-α及 IL-1β含量 各组取 3 只大鼠脑组织加入 5 倍体积的 RIPA 裂解液，制备脑组织匀浆。匀浆液以离心半径 13.5 cm、2 500 r/min 离心 20 min。取上清液，采用 BCA 法参照试剂盒说明书测量 TNF-α、IL-1β含量。结果以每克蛋白所含细胞因子皮克数来表示，即 pg/g（pro）。
1.4.5 TUNEL 法检测梗死灶及其周围半暗带神经细胞凋亡 取 1.4.2 制备的各组石蜡切片，常规脱蜡至水，滴加蛋白酶 K 溶液，37℃ 孵育 20 min。加 50 μL TUNEL 检测液，37℃ 避光孵育 60 min，DAPI 复染。用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。取相同冠状位皮层切片，各组取 5 张切片，高倍镜下（×400），梗死灶周围随机选取 5 个非连续视野计数凋亡细胞（呈绿色荧光）。
1.5. 统计学方法
采用 SPSS16.0 统计软件进行分析；数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
2. 结果
2.1. 一般情况
麻醉后约 2 h 大鼠均完全清醒，出现神经功能缺损症状，实验期间各组大鼠均无死亡。
2.2. BrdU 免疫荧光染色观察
镜下观察示，C、D 组脑组织中均见呈绿色荧光的 BrdU 阳性细胞，主要分布于梗死灶周围的纹状体、大脑皮质、皮质下等部位。见图 1。
图 1.
Immunofluorescence staining of Brdu in group D (×400)
D 组 BrdU 免疫荧光染色观察（×400）
2.3. 免疫组织化学染色观察
镜下观察，各组均可见 OX42 阳性细胞（图 2）。A、B、C、D 组 OX42 阳性细胞数分别为（45.16±4.47）、（35.08±3.84）、（36.25±4.15）、（25.21 ±5.34）个/HP。其中，B、C、D 组 OX42 阳性细胞数明显少于 A 组，D 组少于 B、C 组，比较差异均有统计学意义（P<0.05），B、C 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
图 2.
Immunohistochemical staining of OX42 (×400) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
OX42 免疫组织化学染色观察（×400） a. A 组； b. B 组； c. C 组； d. D 组
2.4. ELISA 检测 TNF-α及 IL-1β含量
A、B、C、D 组 TNF-α含量分别为（1.27±0.21）×103、（1.02±0.09）×103、（1.05±0.11）×103、（0.82±0.04）×103pg/g（pro），IL-1β含量分别为（1.26±0.15）×103、（0.95±0.08）×103、（0.99±0.07）×103、（0.61±0.03）×103pg/g（pro）。D 组大鼠脑组织中 TNF-α、IL-1β含量较其余 3 组明显降低，B、C 组低于与 A 组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.5. TUNEL 法检测缺血病灶及其周围半暗带神经细胞凋亡
镜下观察，各组梗死灶位于大鼠脑额叶、颞叶、顶叶皮质和纹状体，凋亡细胞（TUNEL 阳性细胞）主要见于梗死灶周围的纹状体及额顶皮质下脑 组织（即缺血半暗带）。见图 3、4。
图 3.
TUNEL staining in each group (×400) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
各组 TUNEL 染色观察（×400） a. A 组； b. B 组； c. C 组； d. D 组
图 4.
TUNEL staining observation after being counterstained with DAPI in each group (×400) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
各组TUNEL染色DAPI复染后观察（×400） a. A 组； b. B 组； c. C 组； d. D 组
A、B、C、D 组 TUNEL 阳性细胞数分别为（51.26±5.17）、（37.12±4.35）、（38.65±4.42）、（29.67±3.98）个/HP，D 组与 A、B、C 组，B、C 组与 A 组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
3. 讨论
目前干细胞治疗脑卒中已进入临床试验阶段，主要有 3 条移植路线：脑实质内、血管和脑池内移植。脑实质内和脑池内移植操作复杂，而且可能发生严重并发症，如颅内压增高、癫痫发作、慢性硬膜下血肿等[8]，临床试验应用逐渐减少。静脉移植操作简便，对患者脑组织无二次损伤。急性脑梗死后血脑屏障完整性破坏，通透性增加并至少持续 2 周[9]，因此 BMSCs 能通过血脑屏障进入脑实质。研究表明经静脉移植后，随着血液循环约 75% BMSCs 聚集在缺血病灶中心，约 18.5% BMSCs 聚集在缺血半暗带内[10]。这种移植入体内的 BMSCs 向损伤及炎症区域迁移、聚集的能力，即为 BMSCs 的归巢特性。因此本实验采用 BrdU 对细胞进行标记后经尾静脉移植，移植后发现梗死区周边有 BrdU 阳性细胞，表明移植细胞迁移至损伤区域。
IRI 是一复杂的病理生理过程，主要包括自由基损伤、能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性、细胞内 Ca2+ 超载、炎性损伤和凋亡基因激活等[11-12]。脑缺血后的炎性反应包括小胶质细胞活化、中性粒细胞和单核巨噬细胞浸润以及大量细胞毒性物质（如活性氧、蛋白酶、细胞因子、黏附分子、趋化因子等）的释放[13-14]。这些炎性反应能改变脑微环境，引起脑微血管病变和脑血管痉挛、血脑屏障通透性增加，导致脑水肿，进一步加重脑损伤[15]。因此减轻炎性损伤成为治疗急性脑梗死的主要途径之一。
小胶质细胞是脑组织内重要的免疫效应细胞，属于单核-吞噬细胞系统，常处于静止状态，呈“分枝状”。小胶质细胞易被大脑任何类型的损伤或疾病活化，活化后的细胞体积变大，胞体呈圆形，细胞突起减少，呈“阿米巴状”。缺血缺氧是诱发小胶质细胞活化和增殖的重要因素之一[16-17]。研究表明在缺血性脑卒中急性期，小胶质细胞分泌各种炎性介质，造成神经细胞损伤，在后期可促进神经再生[18]。因此脑缺血再灌注早期，抑制小胶质细胞活性，可减少脑梗死体积，对脑组织起保护作用[19]。
TNF-α是脑缺血损伤中一种重要的促炎性细胞因子，中枢神经系统血管内皮细胞、星形胶质细胞以及小胶质细胞均可产生[20]。TNF-α可促进白细胞从血管内溢出，诱导脑缺血区神经胶质细胞和内皮细胞黏附分子表达，促使白细胞聚集在损伤组织，通过阻塞微血管、形成自由基、释放细胞毒素等多种机制，引起血脑屏障通透性增加，最终造成严重的脑组织损伤[21]。
正常脑组织内有少量 IL-1β，生理浓度的 IL-1β能保护神经元免遭兴奋性氨基酸毒性的损伤。缺血后活化的少突胶质细胞、小胶质细胞、星形细胞及浸润的巨噬细胞可分泌 IL-1β。持续表达的 IL-1β可以诱导黏附分子表达，促进内皮细胞和白细胞黏附，导致脑血流速度降低[22]。IL-1β还可导致白细胞释放自由基、基质金属蛋白酶等因子损害神经元，破坏血脑屏障，加重脑水肿[23]。
本研究结果显示，移植后 7 d D 组 OX42 阳性细胞数最少，TNF-α、IL-1β含量也明显降低，与其余 3 组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。表明 AdIL-10-BMSCs 能抑制脑缺血再灌注损伤中小胶质细胞活性，进而抑制促炎性因子 TNF-α、IL-1β的表达。另外，凋亡细胞主要见于梗死灶周围的纹状体及额顶皮质下脑组织（相当于缺血半暗带），D 组凋亡细胞数显著减少，与其余 3 组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。表明 AdIL-10-BMSCs 能够抑制梗死灶周围脑组织中神经细胞凋亡。
综上述，AdIL-10-BMSCs 通过抑制小胶质细胞分泌促炎性因子 TNF-α、IL-1β，减少单核细胞及巨噬细胞在缺血病灶周围聚集，缩小梗死灶面积，另外通过抑制梗死灶周围脑组织神经细胞凋亡，对大鼠脑 IRI 起保护作用。本实验为缺血性脑卒中的治疗提供了新思路。
Funding Statement
山东省医药卫生科技发展计划项目（2013WS0289）
Medical and Health Technology Development Plan of Shandong Province (2013WS0289)
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