静电纺丝石墨烯/丝素蛋白纳米膜的构建及体外生物相容性研究

Abstract

Objective

To explore the construction and biocompatibility in vitro evaluation of the electrospun-graphene (Gr)/silk fibroin (SF) nanofilms.

Methods

The electrostatic spinning solution was prepared by dissolving SF and different mass ratio (0, 5%, 10%, 15%, and 20%) of Gr in formic acid solution. The hydrophilia and hydrophobic was analyzed by testing the static contact angle of electrostatic spinning solution of different mass ratio of Gr. Gr-SF nanofilms with different mass ratio (0, 5%, 10%, 15%, and 20%, as groups A, B, C, D, and E, respectively) were constructed by electrospinning technology. The structure of nanofilms were observed by optical microscope and scanning electron microscope; electrochemical performance of nanofilms were detected by cyclic voltammetry at electrochemical workstation; the porosity of nanofilms were measured by n-hexane substitution method, and the permeability were observed; L929 cells were used to evaluate the cytotoxicity of nanofilms in vitro at 1, 4, and 7 days after culture. The primary Sprague Dawley rats’ Schwann cells were co-cultured with different Gr-SF nanofilms of 5 groups for 3 days, the morphology and distribution of Schwann cells were identified by toluidine blue staining, the cell adhesion of Schwann cells were determined by cell counting kit 8 (CCK-8) method, the proliferation of Schwann cells were detected by EdU/Hoechst33342 staining.

Results

The static contact angle measurement confirmed that the hydrophilia of Gr-SF electrospinning solution was decreased by increasing the mass ratio of Gr. Light microscope and scanning electron microscopy showed that Gr-SF nanofilms had nanofiber structure, Gr particles could be dispersed uniformly in the membrane, and the increasing of mass ratio of Gr could lead to the aggregation of particles. The porosity measurement showed that the Gr-SF nanofilms had high porosity (>65%). With the increasing of mass ratio of Gr, the porosity and conductivity of Gr-SF nanofilm increased gradually, the value in the group A was significantly lower than those in groups C, D, and E (P<0.05).In vitro L929 cells cytotoxicity test showed that all the Gr-SF nanofilms had good biocompatibility. Toluidine blue staining, CCK-8 assay, and EdU/Hoechst33342 staining showed that Gr-SF nanofilms with mass ratio of Gr less than 10% could support the survival and proliferation of co-cultured Schwann cells.

Conclusion

The Gr-SF nanofilm with mass ratio of Gr less than 10% have proper hydrophilia, conductivity, porosity, and other physical and chemical properties, and have good biocompatibility in vitro. They can be used in tissue engineered nerve preparation.

周围神经损伤是临床常见问题，在创伤患者中发病率约 2.8%^[1-2]。周围神经一定程度上能够再生^[3]，但较长周围神经缺损的修复仍存在许多障碍^[4-5]。组织工程神经有望解决这一难题，目前已进行了大量研究^[6-7]。但组织工程神经通常不具备活性，修复较长神经缺损的效果仍远不及自体神经。因此，制备理想的支架材料是一个具有挑战性的任务。考虑到神经组织本身的结构和电生理特性，合适的支架材料不仅需具有独特表面形貌，以改善神经细胞和支架之间的相互作用、调控细胞生长，同时也需要与在体神经形成良好的电生理整合^[8-9]。

伴随着生物材料研究的快速发展，新型导电纳米材料已应用于组织工程神经研究领域，其中碳基材料，如石墨、富勒烯、纳米管和纳米带等，因具有良好的机械性能和导电性，受到了研究人员的关注^[10]。石墨烯（graphene，Gr）是碳基材料的重要成员，是具有蜂窝晶格结构的 sp²杂化碳原子的二维单层片材，其特殊的分子构型使其具有优越的物化性质，如高电导率和热导率、高机械强度以及强光电性^[11-12]；但因存在高疏水性、难以均匀分散、化学稳定难以与化学试剂反应以及缺乏生物相容性等缺点，应用大大受限^[13]。为克服这些缺点，有研究将天然生物大分子结合至 Gr 表面^[14]。丝素蛋白（silk fibroin，SF）具有优越的理化性能，越来越多应用于组织工程支架的制备^[15-16]。静电纺丝技术环节少、设备简单、操作方便，是制备纳米/微米纤维膜的简便方法，采用静电纺丝制备的纳米纤维支架材料已广泛应用于骨、血管、神经、软骨、皮肤等组织工程研究领域^[17-19]。

本研究利用静电纺丝技术制备 Gr-SF 纳米膜并检测其理化性能，探讨不同浓度 Gr 对 Gr-SF 纳米膜理化性能的影响；同时通过 L929 细胞毒性和雪旺细胞共培养实验，探讨细胞相容性好、促进神经细胞生长的 Gr 最佳浓度，为神经组织工程研究奠定基础。

1. 材料与方法

1.1. 主要试剂及仪器

DMEM 培养基、FBS、青链霉素、胰蛋白酶（GIBCO 公司，美国）；多聚赖氨酸（Sigma 公司，美国）；天然蚕丝（南通海安鑫缘蚕丝有限公司）；Gr 纳米片层粉末[型号 G0441；梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]；EdU 剂盒（广州锐博生物科技有限公司）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；Dojindo 公司，日本）。DSA20 测角器（Gmbh Hambur 公司，德国）；激光扫描共聚焦显微镜（Leica 公司，德国）；酶标仪（Bio-Tek 公司，美国）。

1.2. Gr-SF 静电纺丝溶液的配制及检测

1.2.1 不同质量分数Gr-SF静电纺丝溶液的配制　取天然蚕丝，经 0.5% Na₂CO₃ 水溶液 100℃ 煮沸 30 min，重复 3 次，获得 SF 纤维。根据 Yang 等^[20]方法制备 SF 溶液：将 SF 纤维溶于 CaCl₂/H₂O/EtOH（1∶8∶2）三元体系中，80℃、1 h；随后于透析袋（截留分子量 12 000～14 000）中室温透析 3 d。然后将 SF 溶液置于不锈钢皿中风干成膜，再溶解至 98% 甲酸中获得 SF 质量分数为 13% 的静电纺丝溶液。将 Gr 纳米片层粉末溶于 13% 静电纺丝溶液中，分别制备 Gr 质量分数为 0、5%、10%、15%、20% 的 Gr-SF 静电纺丝溶液，磁力搅拌器室温搅拌，然后用超声波发生器进行超声处理 60 min，720 W 进行声波降解，频率 20 kHz。

1.2.2 静态接触角测定　用 DSA20 测角器，采用滴液法^[21]测量不同质量分数（0、5%、10%、15%、20%）Gr-SF 静电纺丝溶液的静态接触角，测量前 1 h 制备溶液。各 Gr-SF 静电纺丝溶液设 3 个平行样，每个样品测量 3 次，取均值。

1.3. Gr-SF 纳米膜制备及化学处理

自制静电纺丝接收装置，由一高电压供应装置组成，包括用 1 个毛细管针（内径 0.9 mm，针尖内装有静电纺丝溶液的液滴）制成的阳极发生器和 1 个绝缘收集板制成的阴极收集器；发生器针尖和收集器间距离为 7～13 cm，通过注射泵维持恒定体积流速为 0.3 mL/h，使静电纺丝溶液维持于针管内。使用针尖对阳极发生器施加 20 kV 高压，最终在绝缘不锈钢负载的载玻片上形成静电纺丝膜。取静电纺丝膜置于无水乙醇中 10 min 以诱导构象转变，随后用蒸馏水 37℃ 洗涤 72 h，去除残余甲酸。采用上述方法制备 0、5%、10%、15%、20%Gr-SF 纳米膜（分别设为 A、B、C、D、E 组）。

1.4. Gr-SF 纳米膜观测指标

1.4.1 Gr-SF纳米膜表面性状观察　大体观察各组 Gr-SF 纳米膜颜色，光镜及扫描电镜下观察 Gr-SF 纳米膜表面、纤维排列以及 Gr 颗粒分散情况。

1.4.2 电导率检测　采用电化学工作站循环伏安法，于室温下检测各组 Gr-SF 纳米膜电导率。实验采用典型的三电极系统[包括铂网电极、Ag/AgCl 电极（饱和 KCl）参考电极和玻碳工作电极]，在含 5.0 mmol/L Fe（CN）₆^4–/3–的 0.1 mol/L KCl 中测量膜表面电化学性能（100～600 mV），扫描速率 100 mV/s，探针间距 10 mm。各组取 3 个样品，每个样品测 3 次，取均值。

1.4.3 孔隙率检测　采用溶液置换法^[22]检测各组 Gr-SF 纳米膜孔隙率。以正己烷溶液作为置换液，将 Gr-SF 纳米膜浸于已知体积（V₁）的正己烷溶液中 5 min，记录总体积（V₂）；将膜取出，记录剩余体积（V₃）。按以下公式计算 Gr-SF 纳米膜孔隙率：（V₁–V₃）/（V₂–V₃）×100%。

1.4.4 体外细胞毒性检测　① Gr-SF 纳米膜浸提液的制备：将灭菌后的各组 Gr-SF 纳米膜分别置于离心管中，按 GB/T16886-ISO10993 标准以表面积 6 cm²Gr-SF 纳米膜加 1 mL 培养基的比例加入含 10%FBS 的 DMEM 培养基，（37.0±0.5）℃ 浸泡（72.0±0.5）h，制备的浸提液必须在 12 h 内使用。② 体外细胞毒性检测：根据 ISO-10993 标准采用 MTT 法检测 Gr-SF 纳米膜体外细胞毒性。取 L929 细胞（中国科学院上海生命科学研究院），然后按照 5 000 个/孔密度接种于 96 孔板中，分别与 100 μL 各组 Gr-SF 纳米膜浸提液于 37℃ 下孵育 1、4、7 d，每组设 6 个复孔，完全培养基为对照组，无细胞孔为调零孔，实验重复 3 次。孵育后各时间点去除培养基，PBS 洗涤细胞 3 次；每孔加入 5 mg/mL MTT 溶液 20 μL，继续培养 4 h；弃上清液，每孔加入 100 μL DMSO；用 EIX-800 Microelisa 读数器，在 570 nm 波长下测量吸光度（A）值，以每孔与调零孔 A 值的差值作为最终 A 值，取均值。

1.5. Gr-SF 纳米膜对雪旺细胞形态及增殖的影响

1.5.1 雪旺细胞分离培养　参照文献[23]方法分离培养雪旺细胞：新生 1～3 d SD 大鼠 6 只，雌雄不限，由南通大学实验动物中心提供。无菌条件下取出大鼠两侧坐骨神经，剥膜后置于 1 mg/mL 胶原酶和 0.125% 胰蛋白酶消化 30 min，以 1×10⁶个/mL 密度接种于多聚赖氨酸包被的培养皿中；置于 37℃、5%CO₂ 培养箱中，24 h 后更换为含 10 μmol/L β-阿糖胞苷的 DMEM 培养基，培养 24 h 后更换为含 2 mmol/L Forskolin、10 ng/mL Heregulin 及 10%FBS 的 DMEM 培养基，每 3 天换液 1 次；3～5 d 待细胞生长至融合后，消化收集细胞悬液，加成纤维细胞特异性抗体 Thy 1.1（按照 1∶1 000 比例稀释于含 10%FBS 的 DMEM 培养基）；冰上孵育 2 h，离心半径15 cm，1 000 r/min 离心 5 min，弃上清，加补体（按照 1∶3 比例稀释于 DMEM 培养基）重悬，37℃ 孵育 1 h；DMEM 培养基清洗 2 次，接种于多聚赖氨酸包被的培养皿中。将纯化后的雪旺细胞培养 1～2 d，0.125% 胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液后计数，备用。

1.5.2 甲苯胺蓝染色观察　取各组 Gr-SF 纳米膜用 75% 乙醇处理 30 min，PBS 洗涤 2 次，转移至 24 孔板中；每孔按 5×10⁴ 个/mL 密度接种 1 mL 雪旺细胞悬液。培养 3 d，PBS 洗涤细胞 2 次，4% 多聚甲醛固定，甲苯胺蓝染色观察雪旺细胞形态及分布。

1.5.3 CCK-8 法检测细胞活力　取各组 Gr-SF 纳米膜置于 24 孔板中，每孔按 1×10⁴个/mL 密度接种 1 mL 雪旺细胞悬液。培养 3 d 后弃培养基，PBS 洗涤 1 次，加入 500 μL CCK-8 试剂（按 1∶10 比例与 PBS 配置），37℃ 孵育 4 h，取 150 μL 上清加入 96 孔板中，用酶标仪在 450 nm 处测定各孔 A 值，设无细胞孔为调零孔。以各孔与调零孔 A 值差值作为最终 A 值，取均值。

1.5.4 EdU/Hoechst33342 染色观测细胞增殖情况　取各组 Gr-SF 纳米膜置于 24 孔板中，每孔按 1×10⁴ 个/mL 密度接种 1 mL 雪旺细胞悬液。培养 3 d 后弃去培养基，50 mmol/L EdU 标记试剂（按 1∶1 000 比例与培养基配置）孵育 12 h。之后细胞用 4% 多聚甲醛处理 30 min，甘氨酸孵育 5 min，PBS 洗涤，抗-EdU 工作液室温处理 30 min，含 0.5%Triton X-100 的 PBS 溶液洗涤，5 mg/mL Hoechst33342 染液室温孵育 30 min。激光扫描共聚焦显微镜下观察，各组取 3 孔，随机取 10 个区域计算 EdU 阳性细胞染色百分比。

1.6. 统计学方法

采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. Gr-SF 静电纺丝溶液静态接触角测定

0、5%、10%、15%、20% Gr-SF 静电纺丝溶液的静态接触角分别为（64.78±4.06）、（78.84±2.70）、（82.90±0.57）、（98.7±1.41）、（117.51±7.49）°，其中 15%、20%Gr-SF 静电纺丝溶液的静态接触角显著大于纯 SF（0）静电纺丝溶液，差异有统计学意义（P<0.05）。其余 Gr-SF 静电纺丝溶液间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。

2.2. Gr-SF 纳米膜相关检测

2.2.1 表面性状观察　光镜观察示：A 组纤维具有圆形横截面和光滑表面，由大量随机取向的纤维组成；B 组可见纳米膜颜色加深，纤维结构中均匀分布少量 Gr 颗粒；C 组纳米膜颜色进一步加深，纤维中镶嵌大量 Gr 颗粒；D 组 Gr 颗粒呈小团块状聚集；E 组团块状聚集更明显。见图 1。

图 1.

Light microscope observation of Gr-SF nanofilms (×100)

Gr-SF 纳米膜光镜观察（×100）

a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组

a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E

扫描电镜观察示：A 组纳米膜表面呈纳米纤维结构，纤维连续、均一；B 组纤维连续，表面规则，并可见少量 Gr 颗粒均匀镶嵌其中；C 组纤维交错规则，Gr 颗粒镶嵌其中；D 组纳米膜中可见大量 Gr 颗粒镶嵌其中，部分 Gr 颗粒成簇分布；E 组纳米膜中大量 Gr 颗粒聚集成簇。见图 2。

图 2.

Scanning electron microscope observation of Gr-SF nanofilms

Gr-SF 纳米膜扫描电镜观察

a. A 组（×5 000）；b. B 组（×2 000）；c. C 组（×500）；d. D 组（×2 000）；e. E 组（×5 000）

a. Group A（×5 000）; b. Group B（×2 000）; c. Group C（×500）; d. Group D（×2 000）; e. Group E（×5 000）

2.2.2 电导率检测　A、B、C、D、E 组 Gr-SF 纳米膜的电导率分别为（1.02±0.14）、（2.25±0.09）、（2.82±0.35）、（3.23±0.19）、（3.65±0.12）×10^–4/Ω，B、C、D、E 组电导率显著高于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、C、D、E 组电导率逐渐上升，但差异均无统计学意义（P>0.05）。

2.2.3 孔隙率检测　A、B、C、D、E 组 Gr-SF 纳米膜的孔隙率分别为 70.24%±2.17%、72.46%±1.39%、75.89%±1.44%、82.33%±2.06、85.76%±1.92%，各纳米膜孔隙率均>65%。B、C、D、E 组孔隙率显著高于 A 组，除 B 组外，其余各组与 A 组比较差异有统计学意义（P<0.05）；C、D、E 组间比较差异无统计学差异（P>0.05）。

2.2.4 体外细胞毒性检测　培养 1、4、7 d，各组 A 值均呈逐渐增加趋势。1、4 d 时各组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）；7 d 时 D、E 组A 值低于其余各组，但各组间 A 值比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 3。

图 3.

Cell growth curve of different groups by MTT assay

MTT法检测各组细胞生长曲线

2.3. Gr-SF 纳米膜对雪旺细胞形态及增殖的影响

2.3.1 甲苯胺蓝染色观察　培养 3 d，A、B、C 组雪旺细胞呈长梭形，胞体形状正常、表面透亮光洁，贴附于纳米纤维生长态势良好，且能穿过纤维之间的孔隙增殖生长；D、E 组细胞成团生长，细胞胞体逐渐减小，折光性降低，细胞数量少于 A、B、C 组。见图 4。

图 4.

Toluidine blue staining observation of each group at 3 days after culture (×200)

培养 3 d 各组甲苯胺蓝染色观察（×200）

a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组

a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E

2.3.2 CCK-8 法检测细胞活力　培养 3 d，A、B、C、D、E 组 A 值分别为 1.12±0.17、1.24±0.39、1.33±0.15、1.09±0.06、0.86±0.12，E 组与 A、B、C 组比较差异有统计学意义（P<0.05）。其余各组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。

2.3.3 EdU/Hoechst33342 染色检测细胞增殖　培养 3 d，EdU/Hoechst33342 染色示，A、B、C 组细胞致密且 EdU 阳性细胞逐渐增多；D、E 组细胞减少，且 EdU 阳性细胞亦减少。见图 5。定量检测示，A、B、C、D、E 组 EdU 阳性细胞染色百分比分别为 25.52%±1.23%、25.38%±1.81%、29.50%±1.87%、17.65%±2.35%、14.28%±1.09%。A、B、C 组 EdU 阳性细胞染色百分比逐渐增大，D、E 组低于其余各组，其中 E 组与 A、B、C 组比较，D 组与 C 组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。其余组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。

图 5.

EdU/Hoechst33342 staining observation of each group at 3 days after culture (Confocal laser scanning microscope×200)

培养 3 d 各组 EdU/Hoechst33342 染色观察（激光扫描共聚焦显微镜×200）

a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组

a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E

3. 讨论

神经再生研究的关键是寻找理想的组织工程神经支架材料，伴随着生物材料研究的快速发展，新型导电材料已逐渐应用到组织工程研究领域。Gr 具有优异的电化学性能、力学性能，但存在生物相容性差、不可降解、缺少活性基团等缺点^[24-25]。通过引入生物相容性优良及降解可控的分子等方式对 Gr 进行修饰可以弥补上述不足。SF 是一种源于蚕丝的天然高分子纤维蛋白质，有良好的生物相容性和力学性能，已被广泛应用于生物医学领域^[26]。理想的组织工程支架材料需兼顾材料与结构两方面^[27]。Gr-SF 纳米膜能否作为周围神经再生支架材料，促进神经再生，需要进一步研究其对周围神经细胞相容性的影响。

材料表面亲疏水性可通过接触角进行评价。一般情况下，亲水性表面更利于细胞黏附，亲水性越强、接触角越小，反之接触角越大。本实验通过静电纺丝技术制备 Gr-SF 纳米膜，由于 Gr 的疏水性^[28]，其加入后会降低 Gr-SF 纳米膜表面的亲水性。当 Gr 质量分数达 15%、20% 时其静态接触角>90°，亲水性下降。因此，为了保证 Gr-SF 纳米膜的细胞亲和性，建议 Gr 质量分数不超过 10%。

对于神经组织再生，高密度细胞接种需要高孔隙度基质，也需要足够的氧气和营养供给细胞^[29]。相比低孔隙率支架材料，高孔隙率支架材料可为细胞和组织提供更多的空间和营养。我们采用静电纺丝技术构建的 Gr-SF 纳米膜具有大量无规则纵横纤维，类似细胞外基质中的大分子胶原纤维和弹性蛋白，有良好贯通的孔隙，具有较高的孔隙率（均达 65% 以上），使该支架比表面积高，符合组织工程支架对高孔隙率的要求。但是支架孔隙率过高也会削弱机械强度^[30]，因此构建支架时也需要权衡孔隙率和机械强度。

根据 ISO-10993 标准，小鼠成纤维细胞 L929 细胞是一种常用的细胞毒性评价细胞系。本研究也采用 L929 细胞评价 Gr-SF 纳米膜细胞毒性。体外培养 1、4、7 d 结果显示，各时间点各纳米膜组和对照组间差异无统计学意义，但培养 7 d 时，D、E 组 A 值较其他组有所下降，说明其细胞毒性有所增加。研究表明 Gr 的浓度和分散效果差异对细胞活性有影响^[31]，团聚的 Gr 可能使细胞不能进行代谢活动，进而导致其活性受损，而分散较好的 Gr 则对细胞活性无影响。因此，为了保证细胞活性，Gr 质量分数不宜超过 10%。

神经损伤发生时，雪旺细胞发生一系列形态及行为改变，同时发生增殖和表型变化，为轴突再生提供了理想的微环境。因而 Gr-SF 纳米膜能否作为支架材料运用到外周神经修复的实验中，需观察其对雪旺细胞生长、增殖的影响。本研究发现共培养后，0、5%、10%Gr-SF 纳米膜中的雪旺细胞不仅形态未发生改变，细胞生长活力和增殖能力也未受影响。

综上述，Gr 质量分数为 10% 的 Gr-SF 纳米膜具有较好的亲水性，有较高的孔隙率和电活性，Gr 颗粒可均匀分散在纳米膜中；同时也具有良好生物相容性，可促进雪旺细胞存活和增殖。下一步我们将优化 Gr-SF 纳米膜的设计并应用于周围神经再生研究。

Funding Statement

国家自然科学基金面上项目（81671823、81371687）；国家自然科学基金重点研发计划项目（2016YFC1101603）；南通市科技计划项目（MS12016056）

National Natural Science Foundation of China (81671823, 81371687); Key Research Project of National Natural Science Foundation of China (2016YFC1101603); Science and Technology Foundation of Nantong City (MS12016056)