硫酸乙酰肝素成骨作用及成骨机制的研究进展

Abstract

Objective

To discuss the role of heparan sulfate (HS) in bone formation and bone remodeling and summarize the research progress in the osteogenic mechanism of HS.

Methods

The domestic and abroad related literature about HS acting on osteoblast cell line in vitro, HS and HS composite scaffold materials acting on the ani-mal bone defect models, and the effect of HS proteoglycans on bone development were summarized and analyzed.

Results

Many growth factors involved in fracture healing especially heparin-binding growth factors, such as fibroblast growth factors, bone morphogenetic protein, and transforming growth factor β, are connected noncovalently with long HS chains. HS proteoglycans protect these proteins from protease degradation and are directly involved in the regulation of growth factors signaling and bone cell function. HS can promote the differentiation of stem cells into osteoblasts and enhance the differentiation of osteoblasts. In bone matrix, HS plays a significant role in promoting the formation, maintaining the stability, and accelerating the mineralization.

Conclusion

The osteogenesis of HS is pronounced. HS is likely to become the clinical treatment measures of fracture nonunion or delayed union, and is expected to provide more choices for bone tissue engineering with identification of its long-term safety.

骨骼作为一个动态的、多功能的、有自我更新和再生能力的器官，理论上发生骨折后一般 6～8 周后可以愈合，但因年龄、骨折部位、骨膜剥离程度等因素的影响，部分骨折不能愈合或延迟愈合，严重影响患者活动功能和生活质量。既往研究发现，在骨损伤修复早期，多种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）的基因表达均上调^[1]，该结果间接论证了硫酸乙酰肝素（hepa-ran sulfate，HS）参与了骨愈合。因此，了解 HS 的成骨机制，并在此基础上制定干预不愈合的治疗方法，已成为国内外学者研究热点。现对 HS 的成骨作用及成骨机制的最新研究进展进行综述。

1. HS 的结构和功能特点

HS 是由二糖基单元重复形成的高硫酸化结构的线型阴离子多糖，并以共价键形式连接于核心蛋白丝氨酸甘氨酸残基上^[2]，组成位于细胞表面和细胞外基底膜的 HSPGs。HSPGs 的 HS 长链含有非硫酸化的 N-乙酰化域、高硫酸化的 N-硫酸化域和非还原末端，这些域结构根据物种和组织来源的不同，其磺基的大小和数目也不相同^[3]。N-SO₃、2-O-SO₃、6-O-SO₃ 等特征性的硫酸化糖基簇聚可为各种生长因子、信号蛋白、部分重要的膜受体、趋化因子和细胞外基质蛋白提供结合位点^[4]，一方面保护蛋白质，另一方面调控蛋白质通过基底膜转运，介导蛋白质内置^[5]。HSPGs 自身也可在细胞表面快速转移，并根据细胞的变化改变自身结构，应答来自胞外的信号分子。这种结构特点是 HS 通过各种信号通路发挥生物学作用的重要基础。

HS 具有多种生物功能，除了研究最多的调节凝血功能外，还具有调节胚胎发育、病毒感染、细胞分化、组织再生、肿瘤进展、炎性反应等作用^[6-9]。在 HS 成骨方面，国内外相关研究从上世纪八九十年代已开始，且取得了显著成果。由于 HSPGs 的 HS 链带有高负荷，多糖链与蛋白质的结合力主要靠 HS 的阴离子部位与阳离子铵盐基、胍盐相互作用维持。HS 长链与许多参与骨折愈合的生长因子受体竞争性结合生长因子，通过非共价结合的方式进行结合，调节生长因子活性，保护这些生长因子免受蛋白酶的降解，并依靠维持稳定的信号分子浓度梯度来实现信号传递，影响许多生化过程^[10]。其自身成分也参与构成骨基质，参与发挥骨组织内部结构和功能的稳定作用^[11]。

2. HS 对骨形成的作用

2.1. HS 对成骨细胞系的影响

HS 对于成骨细胞系的分化以及基质的矿化能力具有正性作用。作为一种线性多糖，HS 除了具有促进成骨细胞分化、调节骨痂中骨再生生长因子的产量而调节骨形成、调控 BMP-4 的信号传递和活性等多种功能，还可以刺激成骨细胞重要来源细胞 BMSCs 的增殖，以及各类 MSCs 向成骨细胞的分化^[12]。HSPGs 可协调前成骨细胞 MC3T3-E1 的黏附迁移^[13]，与骨激活素（osteoactivin，OA）的结合可激活黏附斑激酶信号通路和细胞外调节激酶通路（extracellular signal-regulated kinase 2，ERK1/2），介导酪氨酸磷酸化级联反应，导致黏着斑的形成，进而促进成骨细胞黏附至 OA 基质^[14]。而 OA 作为一种黏附分子，经由整合素将细胞外基质的化学成分与力学状态传入细胞内，诱导细胞信号和功能的变化。

Runx-2 是 Runt 转录因子家族成员之一，已被证明是胚胎发生阶段成骨模式形成和成骨细胞分化进程必不可少的一种转录因子^[15-16]。HS 可以提高 MC3T3-E1 细胞中 Runx-2、ALP 和骨桥蛋白的表达，并促使细胞器从增殖型向分化型转变，提高成骨细胞的分化能力^{[13, 17]}。Manton 等^[18]研究表示，从正常成年人成骨细胞表面和基质中提取的 HS，体外能够抑制人成骨细胞的增殖和代谢，而且这种抑制作用只有在细胞的初始线性期（48 h 内）以及 HS 浓度在 500 ng/mL 以上才显现出来。这种抑制作用可能与 HSPGs 结合 TGF-β 的能力有关，其具体机制尚不明确。

但目前细胞表面和细胞外基质中的肝素酶（heparanase，HPSE）对成骨细胞的分化作用有两种截然不同的观点。一种观点认为，HPSE 增多抑制了 Wnt/β-catenin 信号通路，降低 Runx-2 转录因子的表达，并使骨祖细胞从向成骨细胞分化转向脂肪细胞分化，从而显著抑制成骨细胞分化，增强破骨细胞作用，阻碍基质矿化和体内骨质形成^{[16, 19]}；另一种观点则认为，HPSE 可消化 HS 的蛋白结合位点，促使 HS 结合生长因子的释放，包括 BMP 和 FGF，并且提高 pSMAD1/5/8 基因的表达，增强 BMP 通路，从而调节细胞的分化、黏附、增殖和细胞外基质重构，在骨软骨交界处促使软骨骨化和骨质形成^[20-24]。因此，HPSE 对成骨作用的具体机制尚未明确，仍需要进一步研究。

2.2. HS 及其复合支架材料对动物骨缺损模型的影响

HS 在骨缺损局部的应用可以募集内源性生长因子，并提高内源性生长因子的产出，从而增加缺损部骨合成代谢的潜力。Jackson 等^[25]利用 HS 对大鼠股骨中段骨折进行治疗，结果显示 5 μg HS 应用于骨折部位，2 周后可使骨小梁体积增加 20%，并且 ALP、Runx-2 等成骨细胞分化标志物的表达和许多肝素结合性生长因子的表达明显增加。同样在扁平骨（如颅骨）中，HS 亦有相同作用^[26]。然而，也有文献报道了 HS 对成骨并无作用，甚至存在抑制成骨信号蛋白的作用^[27]。

对于 HS 修饰支架材料，尽管目前相关研究不多，但绝大部分实验证明 HS 无论是与有机材料还是无机材料复合，对于骨缺损的修复作用均强于 HS 直接应用。Woodruff 等^[28]通过构建 HS-纤维蛋白胶原支架对大鼠颅骨缺损模型进行了深入研究，证实了 HS-纤维蛋白胶原支架在骨再生和促成骨细胞方面更为有效。在经 HS 处理的纤维蛋白胶原支架组中，所有样本骨缺损的边缘均可清晰观察到新生骨，同时缺损部位的成骨标志物包括Ⅰ型胶原、骨钙素和骨桥蛋白都均匀而明显地染色，Runx-2 和 ALP 的表达也显著提高；而对于只有纤维蛋白胶原支架的对照组，各测量结果均介于 HS 组和空白对照组之间。还有研究表明，无机物 β-三磷酸钙与 HS 的复合支架材料也显示出复合支架的成骨优势^[29]。

2.3. 基底膜蛋白多糖（Perlecan）/HSPG2亚等位基因敲除对骨祖细胞和骨组织的影响

在所有骨骼细胞中，骨细胞约占 90%，它们深嵌在矿化基质中，主要负责感知机械负荷并进行信息传递。矿化基质像隧道一样将骨细胞包绕连接起来，称作小管^[30]。每个小管连接到骨细胞胞体周围凹陷的矿化结构，并一起构成了骨陷窝-小管系统（lacunocanalicular system，LCS）。一般骨细胞和矿化基质的间隙被间质液和各种细胞外基质分子所填充，内部组织液的流动将直接影响其内部骨细胞的生理活动。含有蛋白多糖的细胞外基质可以调控 LCS 的溶质运输和机械传感性，促进骨基质的形成以及维持骨基质的稳定^[31]，其中即包括具有分泌作用的 Perlecan/HSPG^[32]。Thompson 等^[11]对敲除亚等位基因 Perlecan/HSPG2 的小鼠骨皮质 LCS 进行研究，镜下观测显示 HSPG2 缺乏组的皮质骨密度下降，骨细胞胞体周围区域的面积以及小管区域的总面积均明显变小。结果说明 HSPG2 是小鼠骨皮质 LCS 的组成部分，并发挥着保护 LCS 外周间隙尺寸的作用，HSPG2 的缺乏可能通过影响骨细胞周围区域基质的完整性改变骨细胞 LCS 的形态。除 LCS 的上述变化外，Lowe 等^[33]也对 Perlecan/HSPG2 基因突变胚胎干细胞的分化潜力和细胞外基质生长因子的影响进行了体外研究，HSPG2 基因突变组（细胞外基质含极少 HSPG2）的骨祖细胞比对照组（细胞外基质含大量 HSPG2）更倾向于向成骨细胞分化，且刺激细胞外基质中 BMP-2 表达增加，更能促进成骨作用。成年 Perlecan/HSPG2 突变小鼠则表现出严重的脊柱畸形、面部扁平、臀部变形、长骨骨腔扩大和长度缩短、骨骼脆性增大等异常发育^[34]。

3. HS 干预的成骨信号通路

HS 参与的成骨作用是由多个信号通路协同交互作用的结果，其中主要的信号通路包括：FGF/HS/FGF 受体（FGF receptor，FGFR）信号通路、Wnt 信号通路、蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）信号通路、BMP 信号通路、骨保护素（osteoprotegerin，OPG）/NF-κB 受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）/NF-κB 受体活化因子（receptor activator for nuclear factor-κB，RANK）信号通路、Hedgehog 信号通路和 TGF-β 信号通路等。

3.1. FGF/HS/FGFR 信号通路

作为研究最多的通路，FGF/FGFR 信号传递在骨发育和愈合过程中，以及在调节骨骼细胞的增殖、分化，维持骨骼细胞活性和功能中起着关键作用，而这些过程均受到 HS 的调控^[35-36]。FGF直接影响各种体内基质蛋白的表达，包括 ALP、骨钙素、BMP-2 和转录因子 Runx-2 等。尤其是 FGF-2、FGF-9 和 FGF-18 对骨和软骨的发育，以及关节的生物学健康存在极大影响^[37]。但是 FGF 和 FGFR 在 HS 长链上有自己的结合位点，而且只有当 FGF-HS-FGFR 三元复合物形成时，才能发挥促有丝分裂、提高细胞增殖能力的作用^[38]。

FGF-2 作为 FGF 家族最具特征性的成员，已被证实可以调节细胞的生长、分化和迁移等。FGF-2 通过激活 ERK1/2 信号通路，控制 Runx-2 转录因子的表达^[17]。FGF-2/HSPGs 与 FGFR-2 结合可激活多条信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶信号通路和 PKC 信号通路^[39]。而这些通路也被证实可以介导 FGF作用于成骨细胞^[40-41]。

3.2. PKC 信号通路

PKC 信号通路是成骨细胞成骨作用的通路之一。PKC 通路的激活可以参与细胞的多种生物功能调节，包括细胞的迁移、增殖、分化与凋亡等^[42]。宋淑军等^[43]通过 PKC 抑制剂抑制 PKC 通路，可完全阻断 HS 促成骨细胞增殖的作用，证实了其在 HS 促成骨过程中的重要作用。同时 PKC 可以介导 FGF 作用于成骨细胞，刺激 Cbfa1/Runx-2（一种多功能的骨形成调节基因）的表达^[41]。同样，FGF-2 作用于 PKC 后可以激活 PKC 通路，增强人成骨细胞 N-钙黏蛋白的表达^[39]。

3.3. OPG/RANKL/RANK 信号通路

OPG/RANKL/RANK 信号通路是目前骨质疏松方面研究最多的一条通路。OPG 作为成骨细胞分化的诱饵受体与 RANKL 发生竞争性结合，抑制 RANKL 与 RANK 的相互作用，从而封闭成骨细胞诱导的破骨细胞前体分化与融合，调控破骨细胞的分化增殖与凋亡，并影响其生理功能^[44]。Li 等^[45]研究显示，HS 作为 RANKL/RANK/OPG 信号通路不可或缺的调节器，它可以诱导 OPG 的二聚化，改变 OPG 构象，形成 HS、OPG 和 RANKL 三元复合物；并通过固定 OPG 于成骨细胞表面，降低 OPG 抑制 RANKL 的阈值，从而抑制破骨细胞的破骨作用。

3.4. BMP 信号通路

BMP-2 是骨折愈合中强有力的肝素结合性生长因子之一^[46]。HS 对 BMP 信号通路在成骨细胞系中的重要性一直存在争议。现阶段观点分为两种：Bramono 等^[47]从人 BMSCs 中分离提取出 HS，进行体外成骨细胞实验和动物体内骨缺损修复实验，发现骨髓诱导的 HS 可以显著增强 BMP-2 的成骨作用，降低抗凝副作用。此外，Murali 等^[48]发现 HS 可以抑制 BMP-2 拮抗物 Noggin 蛋白，延长 pSMAD 信号蛋白表达，提高 BMP 生物活性。另一种观点则相反，Jiao 等^[49]认为细胞表面 HS 结合 BMP-2 并阻碍其与 BMP-2 受体结合，可使 C2C12 细胞（一种鼠成肌细胞）向成骨细胞分化的能力降低。而 Manton 等^[23]通过酶破坏 HS 链可以明显刺激 BMP 信号通路，促进体外人 MSCs 向成骨细胞的分化，提高 ALP、Runx-2 和骨钙素等标志物的表达和增强基质矿化能力。因此，HS 在 BMP 信号通路中的具体影响机制需要进一步研究证实。

3.5. 其他信号通路

Hedgehog 信号通路主要在骨折修复阶段的软骨细胞中被激活，被认为可作用于成骨细胞^[50]。Levi 等^[51]研究发现，激活 Hedgehog 信号通路可显著上调 Runx2、ALP、Ⅰ型胶原酶相关基因的表达，促进骨质形成。同时，Wnt 信号通路可以促进成骨细胞分化，TGF-β/BMP 活化的 Smad 蛋白对骨形成也至关重要。HSPGs 同样被认为可以通过与 Wnt、Hedgehog、TGF-β 等发生交互作用，从而影响 Wnt 信号通路、Hedgehog 信号通路和 TGF-β 信号通路，但相关研究机制尚不确切。

4. 结论与展望

HS 介入的骨缺损愈合是由多种调节因子参与，成骨细胞和破骨细胞共同完成的一个非常复杂的修复过程。在愈合的某些特定阶段，生长、胶黏和酶的因素都可对其愈合程度进行调节，且参与骨形成的信号通路并不是相互孤立的，往往是协同交互式发挥作用。为了解 HS 的成骨机制，国内外学者已经进行了大量研究，但确切作用机制和局部长期应用的安全性仍存在一定分歧和空白，包括 HS 局部使用对 BMP 信号通路的影响、对局部感染发生的影响^[27]、与骨肿瘤形成的关系、对炎性因子的影响、远期对肝脾肾功能的影响等，仍需要进一步验证。此外，HS 修饰的复合支架材料的研究相对偏少，且极少涉及三元复合支架或更多元复合支架材料的研究。本实验室正在对 HS 应用于多元复合支架的成骨作用与成骨机制，以及使用的长期肝肾脾毒性进行研究。随着对 HS 成骨机制和安全性的不断探索完善，有望为 HS找到一种最适合用于临床修复骨缺损的应用方式，并为骨组织工程材料提供一种重要选择。

Funding Statement

国家自然科学基金面上项目（21574059）

National Natural Science Foundation of China (21574059)