煅烧异种骨的生物相容性研究

Abstract

目的

探讨煅烧异种骨材料的生物相容性，为其应用于临床提供实验依据。

方法

取健康成年牛松质骨，采用脱蛋白、高温煅烧方法制备煅烧异种骨。将煅烧异种骨材料浸提液与 L929 细胞体外共同培养，于第 2、4、7 天评价其细胞毒性。L929 细胞接种至煅烧异种骨，培养 4 d 后扫描电镜观察细胞在材料表面贴附及增殖情况，评价其细胞相容性。于 10 只新西兰大白兔双侧后肢胫骨钻孔，左侧孔内植入煅烧异种骨（实验组），右侧植入羟基磷灰石生物陶瓷（对照组）；术后 4、26 周取材行大体观察及组织学观察，评价煅烧异种骨生物相容性。

结果

细胞毒性实验显示，煅烧异种骨浸提液细胞毒性为 0～1 级。细胞相容性实验显示，L929 细胞在煅烧异种骨表面贴附良好，并向孔隙内部生长。体内植入实验显示 4 周时两组均有轻度或中度炎性反应，可见新骨形成；26 周时两组均无炎性反应且有不同程度新骨形成。

结论

煅烧异种骨具有良好生物相容性，有望用于临床骨缺损修复。

在临床上，自体骨移植被认为是骨缺损修复的“金标准”^[1]，但存在二次创伤、移植材料稀缺等不足，因而来源丰富的异种骨成为研究热点^[2-3]。理想的骨缺损修复材料必须有良好的生物相容性、骨传导性、生物降解性^[4]、低免疫原性以及类似天然骨的孔隙结构。牛松质骨经高温煅烧制得的煅烧异种骨是一种骨无机物有序晶体，其主要成分是高纯度的羟基磷灰石^[5]，具有与人骨相似的钙磷比和孔隙结构^[6]，高温煅烧在有效去除抗原的同时保留了天然多孔结构，为新生骨组织和血管的长入提供了理想的通道^[7-8]，是一种潜在的理想骨缺损修复材料。对煅烧骨的制备工艺以及理化性质的研究已有诸多报道^[9-10]，为了解煅烧异种骨的生物相容性，本实验按照国际标准化组织 ISO10993 医疗器械和生物材料生物学评价试验指南（ISO10993-1）标准^[11]，选择了细胞毒性、细胞相容性与组织相容性试验来进行评价，以期为煅烧骨作为骨缺损修复材料用于临床提供实验依据。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及主要试剂、仪器

健康成年新西兰大白兔 10 只，体质量（3.0±0.2）kg，雌雄不限，购自北京市昌扬西山养殖场；中国辐射防护研究院 GLP 实验中心负责饲养，实验中对动物的处置符合动物伦理学要求。

L929 小鼠成纤维细胞株（中国科学院上海细胞生物学研究所）。L-DMEM 培养液、FBS（HyClone 公司，美国）。3111 型 CO₂ 培养箱（Thermo 公司，美国）；JSM-6360LV 型扫描电镜（日本电子株式会社）；IX71 倒置相差显微镜及照相系统、VANOX 型显微镜（Olympus 公司，日本）；680 型酶标仪（Bio-Rad 公司，美国）；KD-TS1 型生物组织自动脱水机（浙江金华科迪仪器设备有限公司）；BMJ-A 型包埋机（常州中威电子仪器有限公司）；RM2015 型石蜡切片机（Leica 公司，德国）。

1.2. 煅烧异种骨的制备

取市售新鲜健康成年牛松质骨，去除软组织，加工成大小为 5 mm×5 mm×5 mm 的松质骨块和直径 2 mm、长 6 mm 的松质骨柱。经清洗、脱蛋白后置于马弗炉内高温煅烧 4～6 h，自然冷却至室温，纯化水清洗、烘干后分装并经辐照灭菌备用，见图 1a。

图 1.

The appearance of materials

两种材料外观

a. 煅烧异种骨；b. 羟基磷灰石生物陶瓷

a. TBC; b. HA

以直径 2 mm、长 6 mm 的羟基磷灰石生物陶瓷（四川大学生物材料中心）作为对照，材料孔隙率约 70%，经过辐射灭菌备用，见图 1b。

1.3. 细胞毒性实验

参照 GB/T16886.5-2003 医疗器械生物学评价第 5 部分：体外细胞毒性试验^[12]相关规定，对煅烧异种骨细胞毒性进行检测。

① 取煅烧异种骨，按照 0.2 g/mL 浸提比例置于不含血清的 L-DMEM 培养液中，37℃ 培养箱中浸提 72 h，获得材料浸提液^[13]。② 取 L929 小鼠成纤维细胞株，复苏后培养至第 3 代，贴壁细胞经 0.25% 胰蛋白酶消化后离心富集（离心半径 10 cm，1 200 r/min 离心 3 min）。用培养液调整细胞密度为 2×10⁴ 个/mL，制备细胞悬液，接种至 96 孔培养板，每孔 100 μL，37℃、CO₂ 培养箱内培养 24 h；弃培养液，加入含 10%FBS 的材料浸提液，每孔 200 μL；以单纯含 10%FBS 的培养液作为空白对照组。两组各设 3 个平行，每个平行 5 孔；实验重复 3 次。③ 继续培养至第 2、4、7 天，采用 MTT 法检测波长 490 nm 处细胞吸光度（A）值，按照公式计算细胞相对增殖率（relative growth rate，RGR），RGR=材料浸提液组 A 值/空白对照组 A 值。参照有关医用材料生物学评价方法中推荐的细胞毒性反应分级标准^[14]判断材料细胞毒性。其中 RGR>100%，细胞毒性为 0 级；80%～99%，1 级；50%～79%，2 级；30%～49%，3 级；1%～29%，4 级。细胞毒性 0 级或 1 级为合格，2 级应结合细胞形态分析，综合评价；3～4 级为不合格。

1.4. 细胞相容性实验

将煅烧异种骨块置于含 10%FBS 的培养基中，常温浸泡 24 h 后置于 6 孔培养板中，每孔 3 块。然后将浓度为 1×10⁶ 个/mL 的 L929 细胞悬液滴至骨块上，每块滴加 200 μL；37℃、CO₂ 培养箱内培养 4 h 后，加含 10%FBS 的培养基至淹没骨块；继续于 37℃、CO₂ 培养箱内培养 4 d 后；取出骨块用 2.5% 戊二醛缓冲溶液固定 72 h，纯化水冲洗 3 次，冷冻干燥后扫描电镜下观察细胞在材料表面的生长情况，评价材料细胞相容性。

1.5. 组织相容性实验

参照 GB/T16886.6-1997 医疗器械生物学评价第 6 部分：植入后局部反应试验^[15]相关规定，对煅烧异种骨组织相容性进行检测。

将 10 只新西兰大白兔耳缘静脉注射 3% 戊巴比妥钠（1.0 mg/kg）麻醉后，双侧后肢胫骨内侧剃毛，手术区域聚维酮碘溶液消毒，逐层切开并分离皮肤、皮下组织、肌肉、骨膜；用低速牙科钻在胫骨内侧皮质上钻 3 个孔，孔直径为 2 mm、孔间间距为 10 mm，穿透一侧骨皮质达骨髓腔。左侧孔内植入煅烧异种骨（实验组），右侧植入羟基磷灰石生物陶瓷（对照组）；材料垂直植入钻孔内，直至与胫骨面平齐，见图 2。术后纱布包扎切口，单笼饲养，允许患肢负重；连续 3 d 肌肉注射庆大霉素（1.5 万 U/kg），每天 1 次。

图 2.

Operation procedure

实验操作步骤

a. 牙科钻在胫骨内侧皮质上钻孔；b. 植入材料

a. Drilling holes on the cortical of medial tibia by a dental bur; b. Implanting the material

术后 4、26 周各取 5 只动物，过量麻醉处死。观察切口愈合情况，然后按照原切口入路，大体观察并取材。将包含植入材料及其周围组织的组织块置于 4% 甲醛缓冲液中固定，1 周后转至 50% 甲酸中脱钙 7～14 d，常规系列乙醇脱水，石蜡包埋。垂直植入体长轴方向进行连续切片，制备组织学切片，HE 染色，光镜下观察材料/组织界面炎症程度、炎性细胞类型以及骨形成情况，评价材料组织相容性。

2. 结果

2.1. 细胞毒性实验

培养第 2、4、7 天，细胞贴壁生长良好，密度均匀，胞体呈圆形、梭形或不规则三角形，无细胞溶解或死亡，细胞膜完整，细胞毒性为 0～1 级，合格。见图 3。

图 3.

Observation of L929 cells cultured with the leaching liquor of TBC at different days (Inverted phase contrast microscope×100)

L929细胞于煅烧异种骨浸提液中培养各时间点观察（倒置相差显微镜×100）

a. 第 2 天； b. 第 4 天； c. 第 7 天

a. At the 2nd day; b. At the 4th day; c. At the 7th day

2.2. 细胞相容性实验

L929 细胞接种于煅烧异种骨表面 4 d 后，扫描电镜下观察可见细胞在材料表面附着生长，胞体不规则，有长短不一的细胞突起与其他胞体相连，并向孔洞中生长。见图 4。

图 4.

Scanning electron microscopy observation of L929 cells proliferation after cultured on surface of the TBC for 4 days

L929 细胞接种至煅烧异种骨 4 d 后扫描电镜观察

a. 细胞在材料表面增殖（×430）；b. 细胞向材料孔洞内爬行生长（×750）

a. L929 cells proliferated on the surface of TBC (×430); b. L929 cells have migrated into the pores (×750)

2.3. 组织相容性实验

2.3.1 大体观察　术后 4 周，实验动物切口处均已有体毛覆盖，愈合良好，无红肿及瘢痕增生；切开皮肤可见肌肉色泽正常、弹性良好，无萎缩、硬化。取材后可见植入位置有不同程度骨痂形成。术后 26 周，实验动物切口处观察情况与 4 周一致，切开皮肤可见材料周围组织颜色、质地正常，材料植入部位均有不同程度骨痂形成。两组大体观察情况无明显差异。

2.3.2 组织学观察　术后两时间点两组观察结果基本一致。术后 4 周，两组植入材料周围组织均排列正常，材料孔隙均被骨髓组织填充，未见纤维性包裹，材料周围组织无充血、坏死、积液、化脓等反应；均可见少量淋巴细胞浸润，未见巨噬细胞，炎性反应为中度或者轻度；均可观察到成骨细胞及新骨形成（图 5、6）。

图 5.

HE staining observation of control group after HA implanted for 4 weeks

对照组术后 4 周 HE 染色观察

a. 材料周围组织排列正常，孔隙被骨髓组织填充（×40）；b. 材料孔内有大量新骨形成（×400） 红箭头示新生骨组织，黑箭头示羟基磷灰石生物陶瓷材料； c. 可见整齐排列的成骨细胞（箭头）（×400）；d. 材料孔隙内可见淋巴细胞（箭头）（×1 000）

a. The tissue arranged around HA was regularly, and the porosity was filled with bone marrow (×40); b. New bone formation were observed (×400)　Red arrow showed the new bone, black arrow showed the HA; c. Osteoblasts (arrow) were observed (×400); d. Lymphocyte (arrow) were observed in pores (×1 000)

图 6.

HE staining observation of experimental group after TBC implanted for 4 weeks

实验组术后 4 周 HE 染色观察

a. 材料周围组织排列正常，孔隙被骨髓组织填充（×40）；b. 材料孔内有新骨形成（×400）　红箭头示新生骨组织，黑箭头示煅烧异种骨材料；c. 可见整齐排列的成骨细胞（箭头）（×400）；d. 材料孔隙内可见淋巴细胞（箭头）（×1 000）

a. The tissue arranged around TBC was regularly, and the porosity filled with bone marrow (×40); b. New bone formation were observed (×400)　Red arrow showed the new bone, black arrow showed the TBC; c. Osteoblasts (arrow) were observed (×400); d. Lymphocyte (arrow) were observed in pores (×1 000)

术后 26 周，两组材料周围组织排列正常，材料孔隙被骨髓组织填充；均未观察到炎性细胞，无组织反应或者轻微组织反应；材料孔隙内可见大量新生骨组织（图 7）。

图 7.

HE staining observation of 2 groups after 26 weeks

两组术后 26 周 HE 染色观察

a. 实验组材料周围组织排列正常（×100）；b. 实验组材料孔隙内可见大量新骨新生骨组织（箭头），未见炎性细胞（×400）；c. 对照组材料周围组织排列正常（×100）；d. 对照组材料孔隙内可见大量新生骨组织（箭头），未见炎性细胞（×400）

a. The tissue arranged around TBC was regularly in experimental group (×100); b. New bone (arrow) formation were observed in experimental group, no inflammatory cells was observed (×400); c. The tissue arranged around HA was regularly in control group (×100); d. New bone (arrow) formation were observed in control group, no inflammatory cells was observed (×400)

3. 讨论

目前，同种异体骨被临床广泛使用，但其来源相对不足，更多学者开始关注其替代材料的研究，其中以人工合成材料和异种骨的研究较多。常见人工骨材料为磷酸钙类合成物质，如羟基磷灰石、β-磷酸三钙等，此类物质具有良好的生物相容性^[16-17]，但结构上与天然骨有较大差异且生物降解性差^[18]，限制了其在骨缺损修复中的广泛应用。

异种骨具有与人骨组织相似的结构，可作为骨移植替代材料，但难点在于如何消除或降低其抗原性。研究表明，异种骨的各种细胞成分是其抗原性的主要来源，胶原成分抗原性弱，矿物质成分无抗原性^[19-20]。常用的异种骨去抗原处理方法有深低温冷冻、反复冻融、煅烧、交联、脱蛋白、辐照或多种方法联合运用等^[21]，其中高温煅烧可以有效去除抗原性。经高温煅烧的牛松质骨材料，保留了骨的天然孔隙结构，与人骨相似。刘斌钰等^[22]的研究表明，煅烧骨异种骨孔隙率达 80% 以上，孔隙大小为 190～750 μm，均为>100 μm 的有效孔^[7]。而多孔结构为成骨细胞增殖提供了较大的表面，有利于骨单位形成，也有利于材料降解，适宜新生骨组织细胞的长入，具有良好的骨传导性^[18]。

郑启新等^[23]通过溶血试验、全身急性毒性试验等，证明煅烧牛松质骨有可靠的生物安全性；高媛等^[24]将煅烧牛骨与成骨细胞共同培养，结果表明煅烧牛骨有良好的成骨细胞亲和性；许永华等^[25]将兔骨膜成骨细胞接种至煅烧牛骨表面并培养，结果表明煅烧牛骨与成骨细胞有良好的组织相容性。本研究中采用脱蛋白联合高温煅烧方法制备来源于牛的煅烧异种骨，通过细胞毒性和生物相容性实验表明，煅烧异种骨无细胞毒性，有良好的细胞相容性。Li 等^[26]研究表明，羟基磷灰石生物陶瓷材料有良好的生物相容性，因此本研究采用该材料作为对照组。实验结果表明，煅烧异种骨材料和羟基磷灰石生物陶瓷材料都具有良好组织相容性，植入 4 周后 HE 染色可见成骨细胞与新生骨组织，26 周后有大量新生骨组织。

综上述，煅烧异种骨材料具有良好的生物相容性，并且具有天然孔隙结构和一定的骨传导性。目前国外已有将煅烧异种骨产品成功运用于口腔学和创伤学的报道^[27-28]，国内也有采用煅烧异种骨产品修复额骨缺损的报道^[29]，提示煅烧异种骨是一种理想的骨修复材料，在骨缺损修复领域有一定的应用前景。但因煅烧骨材料力学强度不够且缺乏骨诱导活性，目前仅能应用于非负重部位的植骨，其力学性能和骨诱导活性的改进仍有待进一步研究。