椎间盘内源性干细胞在椎间盘组织修复再生中的研究进展

Abstract

目的

总结近年椎间盘内源性干细胞的相关研究进展，讨论利用内源性干细胞修复治疗椎间盘退行性疾病的潜在可能性。

方法

查阅近年椎间盘内源性干细胞参与椎间盘组织修复再生的相关文献，分析椎间盘内源性干细胞的修复再生潜能，总结体外提取和培养椎间盘内源性干细胞的方法，并展望其临床应用前景。

结果

椎间盘组织内存在干细胞巢，内源性干细胞在微环境改变下归巢或迁移至受损组织，并参与组织的修复再生；椎间盘内源性干细胞的迁移募集活动能够被趋化因子系统所诱导。椎间盘的组织特异性干细胞逐渐得到确认，并成功分离、培养与鉴定，为椎间盘内源性干细胞的临床应用奠定了基础。

结论

椎间盘内源性干细胞在椎间盘组织修复再生中发挥重要作用，基于椎间盘内源性干细胞的生物学修复策略具有广阔应用前景。

下腰痛与椎间盘退变密切相关，超过 80% 的人群曾有不同程度下腰痛困扰，是威胁人类健康的重大问题^[1]。研究表明，超过 40% 的下腰痛症状由椎间盘退变引起^[2-4]。严重的椎间盘退行性疾病不仅使患者丧失劳动能力，影响生活质量，而且给社会带来巨大经济负担^[5]。但目前仍缺乏椎间盘退变的有效治疗手段，以缓解疼痛为主的保守治疗以及手术治疗的长期效果并不令人满意。近年来，随着对疾病研究的深入，生物工程与再生医学得到迅速发展，为椎间盘退行性疾病的治疗提供了新的方向。其中，椎间盘内源性干细胞的发现及其在椎间盘组织修复再生中的作用得到广泛关注，通过椎间盘内源性修复途径诱导椎间盘组织再生的治疗策略展现出巨大潜力。

内源性修复是指当组织受损或发生退变时，通过释放细胞因子来募集组织特异性干细胞或祖细胞，在一定微环境下完成增殖和分化，从而进行组织自我修复与更新，是机体内许多组织或器官再生过程中的重要一环^[6-7]。内源性修复过程中，干细胞主要通过脉管系统及骨髓输送到有自我更新能力的组织器官中，参与其修复再生过程。而椎间盘是一种复杂而特殊的关节，由位于中央区域的髓核、外围的纤维环以及上下侧的软骨终板共同组成，作为人体内最大的无脉管结构，细胞主要通过扩散作用汲取邻近椎体血管内的氧气及营养物质，因此来自血液及骨髓的外源性干细胞难以到达椎间盘组织中^[8]。此外，椎间盘微环境与其他组织不同，表现为细胞量少、葡萄糖含量低、低氧、低 pH 值、缺乏营养物质等^[9-11]。这些因素均会对干细胞的迁移、黏附以及分化造成不利影响。因此，相对于其他组织，椎间盘常被认为因缺乏足够的组织特异性干/祖细胞而缺少自我修复能力，导致其退变发生率高^[12]。随着近年来对椎间盘内源性修复机制以及组织特异性干/祖细胞的深入研究，生物工程与再生疗法在治疗椎间盘退变方面展现出独特的优势与潜力，为椎间盘退行性疾病带来全新的治疗策略。以下就椎间盘内源性干细胞在椎间盘组织修复再生中的研究进展作一综述。

1. 椎间盘组织的再生潜能

来自血液及骨髓的干细胞，是大部分具有自我修复能力的器官进行组织更新与再生的主要细胞源^[13]。由于椎间盘组织中无血管系统，从血液及骨髓等周边组织募集干细胞进入受损或退变的椎间盘参与修复再生受到极大限制。因此，学者们近年来致力于椎间盘组织内源性修复再生的研究，发掘存在于椎间盘内的组织特异性干/祖细胞的潜能，并探索其是否参与椎间盘组织的内源性修复再生过程。

Henriksson 等^[14]在兔椎间盘组织中，探测细胞增殖区域及椎间盘细胞对 5’-BrdU 的标记保留情况，随后采用免疫组织化学染色对兔、大鼠、猪的正常椎间盘组织以及人退变椎间盘组织进行干细胞标记物检测，发现在中央髓核区及外周纤维环区均存在持续而缓慢的细胞增殖情况，而各物种的椎间盘组织中均有 Notch1、Delta4、Stro-1 等干/祖细胞标记物的表达。该研究团队还发现，早期有大量 5’-BrdU 标记阳性细胞存在于纤维环边缘靠近韧带及软骨膜的区域，随时间延长，标记保留细胞数量逐渐减少；而干/祖细胞标记物表达阳性的细胞也被检测到分布于纤维环外周，邻近软骨终板，这与 5’-BrdU 所标记区域一致，因此将该区域定义为干细胞巢。

椎间盘干细胞巢的存在对于椎间盘组织修复再生有重大意义。对人体而言，特异性的干细胞巢存在于不同组织器官中，是其修复再生过程的主要参与者。在干细胞巢中，干细胞处于休眠状态，增殖缓慢，可被 5’-BrdU 标记为标记保留细胞而被检测出来；当干细胞从干细胞巢迁移出后，可到达特定部位完成增殖分化，参与组织修复再生^[15]。因此，椎间盘干细胞巢能够在人体椎间盘组织的修复再生过程中发挥重大作用。Henriksson 等^[16]进一步研究显示，在不同年龄兔的椎间盘组织中均发现了软骨形成标记物 Sox-9、生长分化因子-5 和细胞迁移标记物 SNAI1、SLUG、整合素 β₁ 等与细胞增殖、迁移、分化相关的基因表达，这些标记物出现在干细胞巢区域以及外周纤维环和中央髓核区；而在前期对椎间盘组织的 5’-BrdU 标记保留细胞分布的研究中，同样发现 5’-BrdU 标记保留细胞在最开始存在于上述干细胞巢区域，随着时间推移，5’-BrdU 标记保留细胞出现在纤维环周围区域及中央髓核区，进一步证实椎间盘干细胞从干细胞巢到中央髓核区及纤维环周围完成了迁移活动。

这一系列研究都证实了椎间盘组织内组织特异性干细胞巢的存在，干/祖细胞可从干细胞巢募集与迁移至椎间盘组织，参与椎间盘内源性修复再生过程，这也为治疗椎间盘退变、诱导椎间盘修复再生提供了新靶向。

2. 椎间盘内源性干细胞迁移参与椎间盘组织修复

在许多椎间盘退变的动物模型以及一些早期临床试验中，MSCs 移植被证实能够延缓或抑制椎间盘退变进程，改善椎间盘功能，维持椎间盘结构稳定^[17-21]。移植的 MSCs 能够在适宜的微环境中向椎间盘类细胞分化，提高髓核细胞的生存能力，帮助退变的椎间盘组织修复与再生^[22]。同时移植的 MSCs 能够释放生物活性因子促进椎间盘细胞的新陈代谢，并抑制降解酶及炎性因子的表达，从而减少细胞外基质降解，增加细胞外基质合成，维持椎间盘的微环境^[23]。尽管 MSCs 移植疗法在研究中取得巨大成果，其在临床应用时仍存在限制：自体 BMSCs 的获取和移植均需通过有创途径，可能引起移植细胞在移植靶点的回漏和骨赘形成等相关潜在并发症风险；此外，对干细胞的体外培养和加工是一个复杂且耗费极大的过程，而干细胞移植后的存活率较低，对干细胞疗法的运用也将产生极大限制^[24-25]。

因此，如何募集椎间盘内源性干/祖细胞参与修复椎间盘退变，成为了研究新方向。对内源性干/祖细胞的动员是椎间盘内源性修复过程的重要环节，然而目前对椎间盘内源性干/祖细胞存在的数量及其再生能力所知有限，尤其是在疾病发展阶段^[26]。当细胞或组织受损或退变后，细胞会释放多种信号分子促进组织修复与再生。一些细胞趋化因子能够显著动员周边组织的干细胞巢，诱导干细胞介导的组织内源性修复^[27]。而对于椎间盘组织，由于无脉管系统，来自血液或骨髓的干细胞需迁移很长一段距离才能进入纤维环或到达髓核组织，因此干细胞很难通过募集作用迁移到椎间盘组织内参与修复再生。近年来有研究表明，退变的椎间盘组织能够通过释放具有趋化作用的细胞因子对干细胞产生募集作用，IGF-1、TGF-β、基质细胞衍生因子-1（stromal cell derived factor 1，SDF-1）、趋化因子配体5（chemokine ligand 5，CCL-5）等均能够促进 MSCs 的迁移^[28-30]。

在一项对体外退变椎间盘器官培养的研究中，Pereira 等^[31]发现 SDF-1 能够诱导 MSCs 穿过软骨终板完成迁移。研究人员将荧光标记的 BMSCs 与 SDF-1 一同搭载于一种热可逆水凝胶中，置于体外椎间盘组织软骨终板表面并孵育 48 h，通过显微镜观察到，用水凝胶搭载 SDF-1 的细胞组向椎间盘内部迁移的活动明显强于单用水凝胶或 SDF-1 的细胞组；此外，研究还发现 BMSCs 的募集作用同时存在于纤维环及髓核组织，提示迁移活动在纤维环及髓核的细胞外基质中均有发生。此研究表明诱导 MSCs 向受损的椎间盘中央区募集是能够实现的；同时，由特定的水凝胶和有效的趋化因子组成的趋化因子传导系统，能够加强 MSCs 的募集作用。此类组织特异性趋化因子是当椎间盘组织受损或退变时产生的，为了进一步了解椎间盘组织受损时细胞因子的释放与干细胞募集的关系，研究者在体外诱导退变的椎间盘组织中进行了蛋白组学分析，发现诱导退变的条件下椎间盘组织分泌的 CCL-5 浓度高于生理条件下的分泌量^[32]。

研究证实 CCL-5 的表达的确与椎间盘退变密切相关。Gruber 等^[33]采用基因芯片技术分析正常与退变的椎间盘组织差异，证实退变椎间盘组织中 CCL-5 的表达量明显上调；此外，免疫组织化学分析结果显示除了部分髓核组织外，大部分 CCL-5 阳性区域集中在纤维环组织；后续实验中，他们发现使用 IL-1β 和 TNF 刺激椎间盘组织可使 CCL-5 表达上调。Kepler 等^[34]通过对比导致疼痛的退变腰椎间盘组织和正常腰椎间盘组织，同样发现前者 CCL-5/RANTES（调节活化正常 T 细胞表达与分泌的趋化因子）表达量显著高于后者，且与 IL-1β 的表达量关系密切。值得注意的是，Pattappa 等^[32]在体外趋化性实验中发现，在退变椎间盘组织中抑制 CCL-5 的功能将显著减弱 MSCs 的化学趋向性活动，表明 CCL-5 对再生性干细胞的募集过程起关键性作用。此外，Li 等^[35]对退变椎间盘分泌细胞因子的检测中发现，除 CCL-5 表达增高外，CXCL-10、IL-6 和 IL-8 等趋化因子均存在高水平表达。Phillips 等^[36]发现随着椎间盘组织学退变程度的增加，趋化因子 CCL-2、CCL-7、CXCL-8 的表达量均有明显增加，可通过其表达水平评估椎间盘退变程度，但是否对椎间盘干细胞的募集作用产生影响仍需进一步研究。

综上，特异性炎性趋化因子或许是椎间盘退行性改变和椎间盘内源性修复再生的重要影响因素。目前，多项研究成果均已表明，椎间盘组织内存在内源性干/祖细胞的迁移募集活动，并能够被趋化因子系统所诱导。然而机体内也存在干细胞迁移的抑制因素，Xiong 等^[37]经过分离鉴定软骨终板源干细胞后，发现巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）及其受体 CD74 能够抑制软骨终板源干细胞的迁移活动。因此，未来研究中仍需进一步发掘最有效的化学驱动因子，排除迁移抑制因素的干扰作用。对内源性干细胞的动员及募集将成为研究椎间盘内源性修复机制的重要课题。

3. 椎间盘干细胞的分离与鉴定

目前的研究成果证实了椎间盘内源性干/祖细胞的存在并参与椎间盘组织修复再生过程。而如何实现对椎间盘内源性干/祖细胞的分离、提纯和鉴定，成为研究椎间盘组织修复再生的重要课题。现阶段，研究者已能够从髓核组织、纤维环及软骨终板中分离培养出与 MSCs 细胞表型相似的细胞，这部分细胞在体外培养中表现出多向分化能力和自我更新潜能。

Blanco 等^[38]从人退变的椎间盘组织中分离出了髓核 MSCs，发现其形态、细胞表型及分化潜能等方面与 BMSCs 相似，而髓核 MSCs 成脂分化能力较弱。Erwin 等^[39]从犬椎间盘髓核组织中分离得到椎间盘髓核祖细胞，占椎间盘细胞总数的 1%，这些细胞能够表达干细胞表面标记物 Sox2、Pou5f1、Nanog、CD133、Nestin 以及 CD56，但与 MSCs 相比，Nanog 表达水平更高；体外培养中，此类椎间盘髓核祖细胞表现出多向分化能力，可分化为软骨、脂类及神经性细胞；而体内实验中也可分化为少突胶质细胞、神经元、星状胶质细胞的特异性前体细胞。Feng 等^[40]从纤维环中分离得到具有多向分化能力的纤维环 MSCs。Liu 等^[41]分离得到软骨终板 MSCs，与 BMSCs 相比具有更强的成骨与成软骨能力。

研究者又针对不同的椎间盘干细胞作生物学行为的比较。Wang 等^[21]分别从人椎间盘组织中分离出纤维环 MSCs、髓核 MSCs、软骨终板 MSCs，并在兔椎间盘退变模型中与 BMSCs 比较修复再生能力。以上干细胞提取后分别在体外进行扩增，随后搭载海藻酸盐凝胶注入经髓核抽吸处理后的兔椎间盘中，6 个月后通过 MRI、X 线片及组织学分析发现，软骨终板 MSCs 具有最强的修复再生能力，髓核 MSCs 和 BMSCs 能力稍弱，而纤维环 MSCs 效果最差。随后，Wang 等^[42]又将纤维环 MSCs、髓核 MSCs、软骨终板 MSCs 与 BMSCs 进行生物学分析，发现其增殖能力相似，细胞表型也仅存细微差别，成骨能力由软骨终板 MSCs、纤维环 MSCs、BMSCs、髓核 MSCs 依次减弱，成软骨能力与之一致，而成脂能力由 BMSCs、髓核 MSCs、软骨终板 MSCs、纤维环 MSCs 依次减弱。Liu 等^[43]同样比较了髓核 MSCs、软骨终板 MSCs、纤维环 MSCs 3 种干细胞的生物学特性，发现软骨终板 MSCs 具有最强的迁移能力，并且 CXCR4 的表达量最高。

而对于椎间盘干细胞的鉴定，Risbud 等^[44]于 2007 年首先在人退变的椎间盘组织中发现了表达干细胞表型特征（包括 CD105、CD166、CD63、CD49a、CD90、CD73、p75 以及 CD133/1）的髓核及纤维环细胞，并且这些细胞能够向成骨、成软骨、成脂方向分化；此后，Henriksson 等^[16]发现在兔、大鼠、人等椎间盘组织中存在增殖能力强的细胞，表达 Notch1、Delta4、Jagged1、CKIT 和 STRO-1 等干细胞表面标记物。目前已有越来越多研究证实了椎间盘内源性干/祖细胞的存在，但始终缺乏组织特异性细胞表面标记物来鉴别。

值得关注的是，近几年 Sakai 等^[45]在该领域研究中取得突破性进展，他们首次提出了椎间盘内源性干/祖细胞的组织特异性表面标记物 Tie2 和 GD2，他们还发现随着年龄增大及椎间盘退变程度加重，表达椎间盘干细胞表面标记物 Tie2 的细胞数量逐渐减少。他们从椎间盘组织中得到的 Tie2⁺GD2⁺ 细胞具有多向分化能力，并能够产生蛋白聚糖和Ⅱ型胶原酶，被认为是椎间盘内源性干/祖细胞；Tie2⁺GD2^– 细胞是 Tie2⁺GD2⁺ 细胞的前体细胞，CD24 是其下游的细胞表面标记物，这些表面标记物（Tie2、GD2、CD24）随着椎间盘内源性干/祖细胞的分化而呈现出不可逆的改变。尽管 Tie2 的表达意义仍需进一步研究，但其作为年龄相关性椎间盘退变的敏感标记物，可通过其表达量的变化评估椎间盘内源性干细胞的数量及其功能，从而评估椎间盘退变程度，也可为椎间盘内源性干/祖细胞的内源性治疗提供基础。该研究还发现，在体外人椎间盘内源性干/祖细胞培养中，Tie2/ANG-1 信号通路对椎间盘内源性干/祖细胞起调控作用，因此 Tie2/ANG-1 信号通路可作为细胞治疗或基因治疗的靶点，为椎间盘内源性修复再生疗法提供新思路。然而，随着年龄增长以及椎间盘退变程度的加重，Tie2⁺ 细胞数量逐渐减少，表明椎间盘内源性干/祖细胞的缺乏，这也将成为内源性修复再生疗法的主要问题。

此外，Yasen 等^[46]研究发现，兔髓核及纤维环细胞表达增殖标记物和干细胞标记物 PCNA、C-kit、CD166、Notch1 和 Jagged1，并且随着年龄增长，以上标记物表达逐渐减少。Brisby 等^[47]研究发现，人退变椎间盘组织中存在的内源性干/祖细胞表达多向分化潜能的表面标记物 POU5F1 和 Notch-1，以及 MSCs 表面标记物 CD105、CD90 和 STRO-1。进一步研究显示，当退变的椎间盘细胞与 MSCs 共培养时，以上表面标记物表达量升高；而与正常椎间盘细胞共存时，又可促进蛋白聚糖的产生。Guan 等^[48]成功从髓核细胞中分离出干/祖细胞，鉴定其具有干细胞表面标记物及多向分化潜能，当使用 TGF-β₁ 干预时，其细胞表面标记物 CD24 表达量显著增高，表明此椎间盘内源性干/祖细胞向成熟椎间盘细胞分化。

综上，越来越多研究证实了椎间盘内源性干/祖细胞的存在，椎间盘中不同类型的干细胞也被成功分离与鉴定，对椎间盘内源性干/祖细胞的生物学特性研究取得了重大研究成果，其修复再生能力也在动物实验模型中得到充分认定。然而目前对椎间盘内源性干/祖细胞的研究仅停留在体外细胞实验和动物模型阶段，如何将其转化至临床运用阶段仍需进一步研究。

4. 椎间盘干细胞用于内源性修复再生的展望

目前，椎间盘内靠近软骨终板区域的干细胞巢已得到多项研究确认，干细胞巢的存在对椎间盘组织修复再生的研究将产生深远意义。椎间盘组织特异性干/祖细胞也在近年被成功分离与鉴定，并对 3 种类型椎间盘干细胞（髓核 MSCs、软骨终板 MSCs、纤维环 MSCs）的生物学特性进行了深入比较与分析。同时，椎间盘干细胞具有多向分化的细胞表型，可向多个方向增殖分化。另一方面，随着生物与再生医学中分子疗法的深入研究，具有趋化作用的细胞因子在体外组织培养干/祖细胞的募集活动中发挥出重要作用，如何在体内实现对椎间盘内源性干细胞的募集将是椎间盘内源性修复再生领域的重大课题。

目前，我们面临的主要问题是如何将体外实验及动物模型实验的成果转化到临床应用中。因此，椎间盘组织内源性修复再生的生理过程仍需进一步研究，以便采取更安全有效的方法模仿生理性修复过程治疗椎间盘退变。此外，生物工程与再生疗法的最佳治疗时期是椎间盘退变早期，此时椎间盘尚存在一定修复再生能力，且未发生结构性病变。所以，针对早期椎间盘退变的无创性诊断方法也将是今后重要研究方向^[49]。对于椎间盘源性下腰痛的患者以及行椎间盘手术的患者，同样可使用生物治疗策略促进椎间盘组织修复再生，并防止相邻节段的椎间盘组织发生退变。我们可以预见，随着对椎间盘退行性疾病发病机制的进一步揭示，以及对椎间盘内源性干/祖细胞的深入研究，椎间盘内源性修复再生疗法在椎间盘退行性疾病的临床治疗中具有极大潜力与发展空间。

Funding Statement

科技部国家重点研发计划资助项目（2016YFC1100100）

State Key Development Program of Ministry of Science and Technology (2016YFC1100100)