核定位信号肽偶联核激酶底物短肽修饰壳聚糖介导微小 RNA-140 对兔关节软骨细胞作用的研究

Abstract

Objective

To investigate the effects of nucleus localization signal linked nucleic kinase substrate short peptide (NNS) conjugated chitosan (CS) (^NNSCS) mediated the transfection of microRNA-140 (miR-140) in rabbit articular chondrocytes in vitro.

Methods

Recombinant plasmid GV268-miR-140 and empty plasmid GV268 were combined with ^NNSCS to form ^NNSCS/pDNA complexes, respectively. Chondrocytes were isolated and cultured through trypsin and collagenase digestion from articular cartilage of newborn New Zealand white rabbits. The second generation chondrocytes were divided into 3 intervention groups: normal cell control group (group A), ^NNSCS/GV268 empty plasmid transfection group (group B), and ^NNSCS/GV268-miR-140 transfection group (group C). ^NNSCS/GV268 and ^NNSCS/GV268-miR- 140 complexes were transiently transfected into cells of groups B and C. After transfection, real-time fluorescent quantitative PCR (RT-qPCR) was used to detect the expressions of exogenous miR-140; Annexin Ⅴ-FITC/PI double staining and MTT assay were used to detect the effect of exogenous miR-140 on apoptosis and proliferation of transfected chondrocytes; the expressions of Sox9, Aggrecan, and histone deacetylase 4 (Hdac4) were detected by RT-qPCR.

Results

RT-qPCR showed that the expression of miR-140 in group C was significantly higher than that in groups A and B (P<0.05). Compared with groups A and B, the apoptosis rate in group C was decreased and the proliferation activity was improved, Sox9 and Aggrecan gene expressions were significantly up-regulated, and Hdac4 gene expression was significantly down-regulated (P<0.05). There was no significant difference in above indexes between groups A and B (P>0.05).

Conclusion

Exogenous gene can be carried into the chondrocytes by ^NNSCS and expressed efficiently, the high expression of miR-140 can improve the biological activity of chondrocytes cultured in vitro, which provides important experimental basis for the treatment of cartilage damage diseases.

关节软骨损伤是临床骨科常见疾病，因关节软骨缺乏血管、神经及淋巴组织，自身修复能力有限，其损伤后的有效治疗是骨科一大难题。近年来，采用局部转基因方法治疗关节软骨损伤受到较多关注^[1-6]。微小 RNA（microRNA，miRNA）参与调控软骨细胞的分化，在软骨的生长发育过程中起着关键作用^[7-9]。其中，miR-140 是软骨组织中特异性表达的 miRNA，参与调控软骨发育及维持软骨内稳态，同时也与骨关节炎的发生发展密切相关^[10-11]，但 miR-140 在修复软骨损伤中的作用尚未明确。

基因运输载体的选择与治疗效果密切相关，非病毒基因转移载体壳聚糖（chitosan，CS）因具有良好的生物相容性和可生物降解性受到较多关注，但因转染效率相对较低，限制了作为基因运输载体的使用。许多研究者尝试通过改性 CS 增加其携带外源 DNA 进入细胞的能力，在一定程度上提高了转染效率^[12-13]。本课题组前期使用核定位信号肽偶联核激酶底物短肽（nucleus localization signal linked nucleic kinase substrate short peptide，NNS）修饰 CS（^NNSCS），体外实验结果表明 ^NNSCS 能够携带更多的质粒 DNA（plasmid DNA，pDNA）进入细胞核并高效表达^[14]。本研究选择使用 ^NNSCS 携带外源基因 miR-140 转染正常兔关节软骨细胞，检测其对软骨细胞的作用，以期为后期体内实验及临床应用提供相关实验依据。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及主要试剂、仪器

新生新西兰大耳白兔 10 只，雌雄不限，体质量 70～80 g，购于济南金丰实验动物有限公司。重组质粒 GV268-miR-140（含长度为 210 bp 的人 pri-miR-140 序列）、NNS（基序为 PKKRKVREEAIKF-SEEQRFRR），均由本实验室构建并保存^[14]；质粒 GV268（上海吉凯基因化学技术有限公司）；DMEM/F12 培养基 （GIBCO 公司，美国）；FBS（HyClone 公司，美国）；Ⅱ型胶原酶（Sigma 公司，美国）；RNAiso Plus、miRNA 逆转录及 SYBR Green 荧光染料定量试剂盒（Takara 公司，日本）；MTT（北京索莱宝科技有限公司）；Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（Invitrogen 公司，美国）。

Sox9：上游引物 5'-TGTAGAGGACGCATT-TGGTAAG-3'，下游引物 5'-TAAGACCGCAGC- AAACCAC-3'，扩增产物 157 bp；聚集蛋白聚糖（Aggrecan）：上游引物 5'-AGAACAGCGC-CATCATTGC-3'，下游引物 5'-CTCACGCCAGGG-AACTCATC-3'，扩增产物 171 bp；组蛋白去乙酰化酶 4（histone deacetylase 4，Hdac4）：上游引物 5'-GCTCGCCCAACAACAACAG-3'，下游引物 5'-GGATGGCGACGTGTAGAGAG-3'，扩增产物 152 bp；内参基因 β2-微球蛋白（β-2-microglobulin，B2m）：上游引物 5'-AACGTGGAACAGTCA-GACC-3'，下游引物 5'-AGTAATCTCGATCCCA-TTTC-3'，扩增产物 157 bp；miR-140：上游引物 5'-CGCGCCAGTGGTTTTACCCT -3'；以上引物均由北京奥科生物技术有限公司合成。miR-140 下游引物和内参基因 U6 引物均来自定量试剂盒。

普通 PCR 仪、iQ5 荧光定量 PCR 仪、酶标仪（Bio-Rad 公司，美国）；流式细胞仪（BD 公司，美国）；倒置显微镜（上海光学仪器厂）；CO₂ 培养箱（Thermo Fisher 公司，美国）；GeneQuant100 微量分光光度计（Biochrom 公司，英国）。

1.2. 实验方法

1.2.1 ^NNSCS/pDNA 纳米复合物的制备　将重组质粒 GV268-miR-140 和空质粒 GV268 分别与 ^NNSCS 按照质量比 1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5 制备 ^NNSCS/pDNA 纳米复合物。1% 琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示当 pDNA 与 ^NNSCS 的质量比≤1∶2 时，^NNSCS/pDNA 纳米复合物在电泳时失去了向正极泳动的能力，表明 pDNA 所携带的负电荷被 ^NNSCS 完全屏蔽（图 1）。筛选出最佳质量比为 1∶2。参照本课题组前期报道方法^[14]，制备最佳质量比 ^NNSCS/GV268-miR-140 和 ^NNSCS/GV268 纳米复合物用于后续研究。

图 1.

Agarose gel electrophoresis of the ^NNSCS/pDNA-complexes

^NNSCS/pDNA 纳米复合物琼脂糖凝胶电泳

1：裸 pDNA　2～8：分别为质量比为 1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5 的 ^NNSCS/pDNA 纳米复合物

1: Free plasmid DNA 2-8: pDNA: ^NNSCS (W/W)=1∶0.5, 1∶1, 1∶1.5, 1∶2, 1∶2.5, 1∶3, 1∶3.5, respectively

1.2.2 ^NNSCS/pDNA 纳米复合物转染关节软骨细胞　实验分为 3 组，分别为正常细胞对照组（A 组）、^NNSCS/GV268 空载体转染组（B 组）、^NNSCS/GV268-miR-140 转染组（C 组）。按照本课题组前期报道方法^[15]，无菌条件下，取 10 只兔膝关节软骨，采用胰蛋白酶和胶原酶联合消化法分离培养原代软骨细胞；37℃、5%CO₂ 及饱和湿度下，置于含 10%FBS 的 DMEM/F12 培养基中培养，待细胞生长至 85%～90% 融合后传代。取第 2 代关节软骨细胞，分别以 1×10⁶ 个/孔和 5×10⁴ 个/孔密度接种至 6 孔板和 96 孔板。待培养孔板中的细胞接近 75% 融合时，于 B、C 组中分别加入对应的 ^NNSCS/pDNA 纳米复合物。转染 24 h 后，弃除孔内培养液，向各孔内加入含 10 ng/mL IL-1β、10%FBS 的 DMEM/F12 培养基，放入培养箱继续培养，于不同时间点进行相关指标检测。其中，6 孔板中细胞用于检测软骨细胞凋亡及 miR-140、Sox9、Aggrecan 和 Hdac4 基因表达，96 孔板中细胞用于软骨细胞增殖检测。

1.3. 观测指标

1.3.1 实时荧光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR）检测软骨细胞 miR-140 表达水平　转染 72 h 后，每组取 6 孔，弃去孔内培养液，Trizol 法提取细胞总 RNA，使用 miRNA 逆转录试剂盒逆转录获得 cDNA。普通 PCR 分别扩增各组 miR-140 及其内参基因 U6，扩增条件：95℃、5 min；94℃、40 s，62℃、20 s，72℃、20 s，35 个循环；72℃、5 min。1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 扩增产物并行 DNA 序列分析。随后 RT-qPCR 分析 cDNA 样本，反应体系 20 μL：cDNA 模板 1.0 μL、上、下游引物（10 pmol/μL）各 1.0 μL、SYBR Green Mix 10.0 μL、灭菌双蒸水 7.0 μL。扩增条件：95℃、10 s；95℃、5 s，60℃、20 s，72℃、20 s，40 个循环。在每个循环延伸末检测荧光信号，计算各 cDNA 样本的 miR-140 及 U6 的 Ct 值，将 miR-140 Ct 值与相对应的 U6 Ct 值相减得到 ∆Ct 进行标准化，用于校正各样本之间 RNA 质量及逆转录效率的差异，采用公式 2^–∆∆Ct计算得到 miR-140 相对表达量。

1.3.2 Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染色法检测软骨细胞凋亡　转染 72 h 后，每组取 6 孔，用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化并收集细胞，冷 PBS 漂洗后，100 μL 结合缓冲液重悬细胞，然后加入 5 μL Annexin Ⅴ 及 1 μL PI，室温、避光反应 15 min，最后加入 400 μL 结合缓冲液，流式细胞仪检测。

1.3.3 MTT 检测软骨细胞增殖　转染 48 h 后，每组取 6 孔，每孔加入 15 μL MTT 溶液（5 mg/mL），同时设置不含细胞的空白调零孔。放入培养箱继续孵育 4 h 后，弃除孔内培养液，各孔加入 150 μL DMSO 溶液，室温振荡 10 min 充分溶解结晶物，570 nm 波长测定吸光度（A）值，按照以下公式计算细胞增殖活力，公式为：（实验组 A₅₇₀–调零孔 A₅₇₀）/（A 组 A₅₇₀–调零孔 A₅₇₀）×100%，其中实验组表示 B 组或者 C 组。

1.3.4 RT-qPCR 检测软骨细胞内成软骨相关基因表达　转染 72 h 后，每组取 6 孔，弃去孔内培养液，Trizol 法提取细胞总 RNA，逆转录成 cDNA。RT-qPCR 分别扩增 Sox9、Aggrecan、Hdac4 及内参基因 B2m，同 1.3.1 方法操作。扩增各 cDNA 样本后，将各基因 PCR 扩增 Ct 值与相对应内参基因 B2m 的 Ct 值相减得到 ∆Ct 进行标准化^[16]，以公式 2^–∆∆Ct计算得到各基因相对表达量。

1.4. 统计学方法

采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. 软骨细胞 miR-140 的表达检测

RT-qPCR 检测显示，A、B、C 组 miR-140 基因相对表达量分别为（1.00±0.11）、（1.27±0.14）及（5.87±0.54）倍。其中，C 组 miR-140 表达水平较 A、B 组明显上调，比较差异有统计学意义（P<0.05）；A、B 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2. Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染色法检测软骨细胞凋亡

流式细胞仪检测示，C 组软骨细胞凋亡率较 A、B 组明显降低，比较差异有统计学意义（P<0.05）；A、B 组间比较差异无统计学意义（P> 0.05）。见图 2。

图 2.

Apoptosis in rabbit chondrocytes by Annexin Ⅴ-FITC/PI assay after transfected with ^NNSCS/pDNAcomplexes for 72 hours

转染 72 h 后 Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染色法检测各组软骨细胞凋亡

a. 从左至右分别为 A、B、C 组流式细胞图；b. 各组细胞凋亡率比较

a. From left to right for flow cytometry map in groups A, B, and C, respectively; b. Comparison of the apoptosis rate between groups

2.3. MTT 检测软骨细胞增殖

MTT 检测示，A、B、C 组细胞增殖活力分别为 100.0%±5.6%、107.3%±5.3% 及 150.3%±10.3%。C 组软骨细胞增殖活力较 A、B 组明显提高，比较差异有统计学意义（P<0.05）；A、B 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.4. RT-qPCR 检测 Sox9、Aggrecan 和 Hdac4 基因表达

与 A、B 组比较，C 组 Sox9、Aggrecan 基因相对表达量明显上调、Hdac4 基因相对表达量明显下调，比较差异有统计学意义（P<0.05）； A、B 组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 3。

图 3.

Gene expressions in each group by RT-qPCR detection after transfected with ^NNSCS/pDNA for 72 hours

转染 72 h 后 RT-qPCR 检测各基因相对表达量

a. Sox9; b. Aggrecan; c. Hdac4

a. Sox9; b. Aggrecan; c. Hdac4

3. 讨论

在众多基因转移载体中，CS 因其良好的生物相容性而成为备受关注的基因运输载体，但目前相对较低的转染效率限制了其在基因治疗中的应用。本课题组一直致力于提高 CS 的转染效率。NNS 序列包括 1 个 SV40 核定位信号肽和 1 个潜在可磷酸化的丝氨酸残基，此短肽在哺乳动物细胞内能够被选择性磷酸化。核定位信号肽可促进 CS 携带外源基因进入细胞核，核激酶底物短肽被核内激酶有效磷酸化，促进外源基因在核内从 CS 中解离、释放，提高 CS 转染效率。前期研究采用体外培养的小鼠成肌细胞 C2C12，证实 ^NNSCS 能够携带更多的外源基因进入细胞核，并高效表达^[14]。因此，本研究选择 ^NNSCS 作为基因运输载体。RT-qPCR 检测结果显示，^NNSCS/GV268-miR-140 转染组软骨细胞内外源 miR-140 可高效表达，表明 ^NNSCS/pDNA 纳米复合物可以将外源基因有效转入软骨细胞内。

大量研究已证实，miR-140 在正常软骨细胞中特异性高表达，在骨关节炎软骨细胞内的表达量明显降低^[17-18]。miR-140 基因敲除小鼠出生后骨骼发育异常，出现关节软骨内蛋白聚糖降低及纤维化等老年性骨关节炎样变化^[10]，这些结果均表明 miR-140 在软骨细胞生长发育和维持正常功能中发挥重要作用。在骨关节炎软骨细胞内，致炎因子 IL-1β 能够促进分解代谢相关基因的表达^[19]，抑制内源性 miR-140 表达^[20]。研究显示通过给予 IL-1β 干预，可诱导关节软骨细胞退变^[21]。本研究在 ^NNSCS/pDNA 转染 24 h 后给予 IL-1β 干预，旨在检测 miR-140 对软骨细胞的作用。结果显示，外源 miR-140 的表达可以明显抑制 IL-1β 诱导的软骨细胞凋亡，提高软骨细胞的增殖活力。

Sox9 是参与软骨细胞分化和软骨形成的主要转录调控因子，在关节发育期的软骨细胞内高表达，随着年龄的增长，表达量逐渐降低^[22]。人骨关节炎早期阶段的软骨细胞内，Sox9 的表达水平增加^[23]。高表达的 Sox9 能够促进关节软骨主要细胞外基质 Aggrecan 和Ⅱ型胶原蛋白的合成，促进软骨损伤的修复^[24]。转录辅阻遏物 Hdac4 在骨关节炎软骨组织内的表达水平明显高于正常组织^[25]。在人骨关节炎软骨细胞内，通过抑制 Hdac4 可以明显降低 IL-1β 及 IL-1 诱导的基质金属蛋白酶-13 等分解代谢相关基因的表达^[26]。Aggrecan 是软骨细胞外基质中具有重要作用的蛋白聚糖分子，常被用作软骨形成的标志分子之一^[27]。软骨损伤会导致 Aggrecan 降解增加^[28]。因此，维持 Aggrecan 正常结构与含量是实现软骨损伤修复的主要途径之一。本研究结果表明，过表达 miR-140 的软骨细胞内，Sox9 与 Aggrecan mRNA 相对表达量显著增加，Hdac4 mRNA 相对表达量显著降低，在抑制 IL-1β 诱导关节软骨细胞退变中发挥重要作用。提示 miR-140 在损伤软骨修复过程中发挥重要作用。

综上述，^NNSCS 可携带外源基因 miR-140 进入体外培养的软骨细胞并实现高效表达，高表达的 miR-140 可促进软骨细胞的合成代谢，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，为进一步探究 miR-140 体内治疗软骨损伤奠定了良好的实验基础。

Funding Statement

山东省自然科学基金资助项目（ZR2015HL025、ZR2012HQ034）；国家自然科学基金资助项目（81770915、81301737）

Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2015HL025, ZR2012HQ034); National Natural Science Foundation of China (81770915, 81301737)