重组人 BMP-2 缓释作用于基质血管成分细胞促进大鼠脊柱融合的实验研究

Abstract

目的

将重组人 BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）缓释作用于新鲜分离的大鼠基质血管成分细胞（stromal vascular fraction cells，SVFs），移植到大鼠腰椎横突后外侧，观察其促进脊柱融合的效果。

方法

取健康 4 月龄 SD 大鼠双侧腹股沟区皮下脂肪，采用 Ⅰ 型胶原酶消化法提取 SVFs。通过仿生磷灰石涂层方法，将 rhBMP-2 与β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）通过共价键结合制成缓释载体，通过 BCA 法测定其缓释效应。将 32 只大鼠随机分成 4 组，每组 8 只。采用 L₄、L₅ 横突去皮质化方法制备大鼠腰椎后外侧融合模型，分别于 A、B、C、D 组植入 PBS+脱钙骨基质（decalcified bone matrix，DBX）、rhBMP-2/β-TCP 缓释载体+DBX、SVFs+DBX 和 SVFs+rhBMP-2/β-TCP 缓释载体+DBX。术后 8 周获取腰椎融合标本，进行手法判断和 X 线片观察评价脊柱融合情况，以及 micro-CT 评价脊柱融合情况，并分析骨密度（bone mineral density，BMD）及骨体积分数；行 HE 染色、Masson 三色组织学染色，以及免疫组织化学染色检测骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）。

结果

2 周时 rhBMP-2/β-TCP 缓释载体的 rhBMP-2 体外累计释放量为 40% 左右，起到缓慢释放效果；而未经仿生磷灰石涂层的对照组 2 周时几乎停止释放 rhBMP-2。手法判断、X 线片和 micro-CT 评估一致，显示 D 组成骨能力最强，达 100% 融合（8/8），之后依次为 B 组（75%、6/8）、C 组（37.5%、3/8）、A 组（12.5%、1/8）。Micro-CT 分析示，D 组 BMD 和骨体积分数均显著高于其余 3 组，B 组显著高于 A、C 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。HE、Masson 三色染色和 OCN 免疫组织化学染色示，D 组有大量软骨细胞连接，伴有骨基质沉积、有活跃的成骨过程，类似长骨的矿化过程；B 组的骨形成相对 D 组较弱；A、C 组缺乏有效的新骨形成。

结论

新鲜分离的 SVFs 在 rhBMP-2 缓释作用下，显示出良好的骨生成能力，可有效促进脊柱融合，为临床应用提供理论基础。

脊柱融合是骨科常用手术方式，如何提高融合率一直是研究重点。自体骨移植可提供丰富的生物学环境，包括成骨细胞、MSCs 以及良好的骨传导作用，被认为是脊柱融合的金标准；但其也存在取骨区顽固性疼痛、出现感染可能、较高假关节形成发生率及骨量来源受限等问题^[1-2]。应用骨组织工程学方法是目前研究热点，有可能解决上述问题，可形成较高的骨质量并缩短骨融合时间^[3]。

按照临床实际需要，如果能从患者自身提取一类细胞，不通过体外扩增、纯化，采用“一步法”直接植入体内进行修复，是一种比较理想的方式；同时与一种高效、安全的生长因子结合是一种可能的解决办法。本研究基于上述设想，将携带重组人 BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）的 β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）与载体支架脱钙骨基质（decalcified bone matrix，DBX）复合，再与新鲜提取的基质血管成分细胞（stromal vascular fraction cells，SVFs）混合，提取的细胞不进行体外扩增，进行“一步法”移植于大鼠腰椎后外侧，在 rhBMP-2 缓释作用下促进脊柱融合，是一种组织工程学方法的尝试，以期为未来临床应用奠定理论基础。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及主要材料、仪器

健康 4 月龄 SD 大鼠 42 只，雌雄不限，体质量（200±15）g，由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物中心提供。rhBMP-2、BCA 法蛋白定量试剂盒（Sigma 公司，美国）。DBX 选择直径 212～850 μm 的同种异体冻干脱钙骨基质（上海贝奥路生物材料有限公司）与透明质酸钠混合而成；β-TCP（上海贝奥路生物材料有限公司）；骨钙蛋白（osteocalcin，OCN；Santa Cruz 公司，美国）。倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；Skyscan1172 micro-CT（SkyScan 公司，比利时）。

1.2. SVFs 提取

取 10 只 SD 大鼠双侧腹股沟区皮下脂肪，将脂肪组织用 PBS 反复冲洗除去血液，剔除血管。无菌操作下将脂肪倒入 50 mL 试管内，4℃ 以 215×g 离心 10 min；转移上层脂肪组织至新试管内，加入同体积 PBS 混匀，同上法离心 5 min。加入 0.1% Ⅰ 型胶原酶，于震荡箱内 37℃ 消化 40 min；然后同上法离心 10 min，保留细胞集落。用 PBS 悬浮细胞，200 目滤网过滤，以 150×g 离心 5 min。去除上清液，加入 10 mL 红细胞裂解液，室温孵育 10 min；加入 2 倍体积含 5 mmol/L EDTA 的 PBS，200 目滤网过滤，150×g 离心 5 min，保留沉淀，PBS 混匀。用锥虫蓝拒染法检测细胞活性，计数细胞，备移植实验用。倒置显微镜观察 SVFs 形态。

1.3. rhBMP-2/β-TCP 缓释载体构建

1.3.1 仿生磷灰石涂层 β-TCP 的构建　按照文献[4]方法，经过 2 次过饱和模拟体液（supersaturated simulated body fluid，SBF）浸泡处理方法构建仿生磷灰石涂层 β-TCP。具体方法：① SBF1 配制：CaCl₂ 0.347 g、MgCl₂·6H₂O 0.380 g、NaHCO₃ 0.441 g 及 K₂HPO₄ 0.285 g 加入 250 mL 双蒸水中进行溶解，调整溶液 pH 值为 6；继续加入 Na₂SO₄ 0.089 g、KCl 0.280 g 和 NaCl 10.01 g，并调整 pH 值至 6.5。② SBF2 配制：CaCl₂ 0.347 g 和 K₂HPO₄·3H₂O 0.285 g 加入 250 mL 双蒸水中进行溶解，调整溶液 pH 值至 6；最后加入 NaCl 10.01 g，并调整 pH 值至 6.8。③ 仿生磷灰石涂层 β-TCP 构建：保持上述 2 种 SBF 温度为 37℃，移植实验所用的 β-TCP 放入 SBF1 浸泡 24 h 后，再放入 SBF2 浸泡 24 h，然后用双蒸水冲洗去除过多金属阳离子，通过干燥机干燥后得到仿生磷灰石涂层 β-TCP 粉末。

1.3.2 rhBMP-2 体外缓释效应测定　rhBMP-2/β-TCP 缓释载体构建：取 10 μg rhBMP-2（200 μg/mL）与 50 mg 仿生磷灰石涂层 β-TCP 粉末（直径 200～300 mm）混合（实验组），–180℃ 保存 12 h，然后在真空干燥机内风干，经 17×g 离心使粉末集中。将上述缓释载体粉末分别加入 6 个 U 型试管中，加入 1 mL PBS 溶液（pH7.4）适度震荡，每个试管分别于 0、1、4、7、10、14 d 取上清液，每个时间点重复 3 次，按照 BCA 法蛋白定量试剂盒说明书方法，测定 rhBMP-2 蛋白累积释放量，绘制累积释放曲线；以未经仿生磷灰石涂层的单纯 50 mg β-TCP 颗粒与 10 μg rhBMP-2 混合作为对照组。

1.4. 动物实验分组及方法

1.4.1 移植样品术前准备　rhBMP-2 经过处理构建为 rhBMP-2/β-TCP 缓释载体用于以下移植实验。A 组 PBS+DBX：取 300 mL DBX 与 50 mL PBS 混合。B 组 rhBMP-2+DBX：取 300 mL DBX 与 10 μg rhBMP-2（200 μg/mL）混合。C 组 SVFs+DBX：取 300 mL DBX 与 1×10⁵ 个/μL SVFs 混合。D 组 rhBMP-2+SVFs+DBX：取 300 mL DBX 与 10 μg rhBMP-2（200 μg/mL）和 1×10⁵ 个/μL SVFs 混合。具体步骤以 D 组为例：经仿生磷灰石涂层处理的含有 10 μg rhBMP-2/β-TCP 与 300 mL DBX 混合，放入无菌 Eppendorf 管中并封口备用；由 2 名术者同时进行手术，根据手术进度，提取的 SVFs 被送入手术室，由助手将 1×10⁵ 个/μL SVFs+10 μg rhBMP-2/β-TCP+300 mL DBX 混合为移植使用。所有操作都在细胞培养超净台内进行，避免样品污染。

1.4.2 实验分组及手术方法　将 32 只 SD 大鼠随机分为 4 组，每组 8 只。A、B、C、D 组移植物分别为 PBS+DBX、rhBMP-2+DBX、SVFs+DBX 和 rhBMP-2+SVFs+DBX。手术方法：采用氯胺酮（40 mg/kg）联合地西泮（2 mg/kg）腹腔注射麻醉。麻醉成功后，取腰背侧正中入路，双侧髂嵴对应 L₆ 椎体，手术切口以 L_4、5 为中心，长约 4 cm。距棘突两侧约 2 mm 各作一旁正中切口切开筋膜，用神经剥离子沿棘突钝性分离椎旁肌至关节突关节，显露双侧 L₄ 和 L₅ 横突并切断横突间韧带，用高速磨钻打磨横突皮质至松质骨面点状渗血，术中防止用力过猛以免发生横突骨折。无菌生理盐水冲洗伤口后，于双侧横突间植入各组移植物。4-0 Vicryl 可吸收缝线逐层关闭切口，术后大鼠自由活动。术后连续 3 d 给予颈部皮下注射止痛药卡洛芬，2 次/d，每次 0.2 mg；口服复方新诺明抗生素药水 1 周后改用正常纯净水。

1.4.3 X 线片观察脊柱融合情况　术后 8 周行 X 线片评估脊柱融合情况，两侧横突间存在骨性连接为融合，两侧或单侧未融合为失败融合。

1.4.4 手动触诊评价脊柱融合情况　术后 8 周，32 只大鼠采用 CO₂ 窒息法处死各组动物，取出腰椎标本后，由 3 名有经验的脊柱外科医生独立进行标本屈曲、伸展和侧屈活动测试，对抗融合节段是否产生活动，有活动出现及任何一侧有活动则认为是失败融合。

1.4.5 micro-CT评估　手动触诊评价后将各组标本置于 10% 甲醛浸泡 48 h 以上，然后行 micro-CT 扫描获得高分辨率图像，扫描分辨率 19.73 mm、电压 55 kV、电流 181 mA，横突间存在骨性连接为骨融合。运用 micro-CT 中 CTAn、CTVol 和 Data-Viewer 3 种软件进行骨形成情况的三维重建和数据分析，根据每侧腰椎形成骨块确定感兴趣区域范围，分析骨密度（bone mineral density，BMD）以及骨体积分数（为感兴趣区域内代表骨块结构体素的总体积与区域内所有体素的总体积之比）。

1.4.6 组织学观察　取 10% 甲醛浸泡 48 h 后的各组脊柱标本，修剪 L_4、5 间的融合骨块后，用 Cal-Ex 脱钙处理 1 周左右，经石蜡包埋、切片（片厚 5 μm），行 HE 染色及 Masson 三色染色（矿化组织呈红色，连接组织呈蓝色）观察骨形成情况。

1.4.7 免疫组织化学染色观察　取上述部分切片，行 OCN 免疫组织化学染色，镜下观察新骨形成情况（阳性染色为棕黄色）。

1.5. 统计学方法

采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法；计数资料以率表示，组间比较采用 χ² 检验；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. SVFs 形态观察

倒置显微镜观察示，新鲜分离的细胞绝大部分形态为小圆形。接种 4 h 开始贴壁，6～18 h 细胞处于生长停滞期，24 h 完全贴壁。24 h 后细胞开始伸展，增殖加速，形态由圆形变为梭形，胞体形成突起。48 h 后细胞伸展明显，多数呈成纤维细胞样梭形，部分呈三角形。培养 7 d 细胞达 85% 融合，然后进行传代培养。见图 1。

图 1.

Morphological observation of the fresh SVFs (Inver- ted microscope×100)

新鲜分离的 SVFs 形态学观察（倒置显微镜×100）

2.2. rhBMP-2 蛋白体外缓释效应测定

对照组 rhBMP-2 蛋白于 1 d 时累积释放量已达 87% 左右，为爆发性释放，之后 2 周内几乎释放静止；而实验组经仿生磷灰石涂层的 β-TCP 可使 rhBMP-2 缓慢释放，14 d 时 rhBMP-2 蛋白体外累计释放量为 40% 左右。见图 2。

图 2.

Cumulative release curve of rhBMP-2 in coated β- TCP and uncoated β-TCP

经仿生磷灰石涂层及未经涂层的 β-TCP 中 rhBMP-2 的累积释放曲线

2.3. 动物实验相关观测

2.3.1 X 线片观察　A 组 L_4、5 横突间缺乏骨性连接；C 组横突间仅有少量骨性连接；B、D 组横突间均呈现出融合，D 组融合骨形态更密实、结构更紧凑。见图 3。A、B、C、D 组融合率分别为 12.5%（1/8）、75.0%（6/8）、37.5（3/8）、100%（8/8），组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。

图 3.

X-ray film observation in each group at 8 weeks

术后 8 周各组大鼠 X 线片观察

a. A 组（箭头示横突间存在明显间隙）；b. B 组；c. C 组（箭头示横突间存在间隙）；d. D 组

a. Group A (Arrow for the obvious gap between the transverse processes); b. Group B; c. Group C (Arrow for the obvious gap between the transverse processes); d. Group D

2.3.2 手动触诊评价　手动触诊评价显示，A、B、C、D 组融合率分别为 12.5%（1/8）、75.0%（6/8）、37.5（3/8）、100%（8/8），组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2.3 micro-CT 观察　A 组无骨桥连接两侧横突；C 组仅见单侧脊柱融合；B、D 组可见骨桥连接形成融合，D 组形成的骨质量优于 B 组。见图 4。A、B、C、D 组融合率分别为 12.5%（1/8）、75.0%（6/8）、37.5（3/8）、100%（8/8），组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。

图 4.

Spinal fusion observation in each group at 8 weeks by micro-CT

术后 8 周各组大鼠 micro-CT 评估脊柱融合情况

从左至右分别为 A、B、C、D 组 a. 三维重建；b. 冠状面图像

From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. Three-dimensional reconstruction; b. Coronal plane image

A、B、C、D 组 BMD 分别为（1.37±0.05）、（1.50±0.04）、（1.45±0.09）、（1.61±0.44）g/cm³，骨体积分数分别为 10.58%±2.25%、17.55%±3.23%、13.20%±2.81%、23.07%±5.59%。BMD 及骨体积分数 D 组显著高于其余 3 组，B 组高于 A、C 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A、C 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3.4 组织学观察　① HE 染色：A 组 DBX 间仅为纤维组织连接；B 组 DBX 间有软骨细胞连接；C 组 DBX 间有血管基质层细胞存在，但因缺乏生长因子刺激，未形成有效骨连接；D 组 DBX 间有大量软骨细胞连接，且在 DBX 之间有软骨内骨化形成的“骨桥”形成。见图 5。② Masson 三色染色：A 组包含大量未矿化的 DBX 颗粒，其边缘较锐利，之间仅以纤维组织连接；B 组 DBX 颗粒边缘被侵蚀，新生的肥大软骨细胞参与骨塑形过程；C 组 DBX 颗粒间以细胞连接为主，为植入的 SVFs；D 组有大量软骨细胞出现，塑形过程中有类似骨髓空洞形成，伴有骨基质沉积，类似长骨的矿化过程，见图 6。

图 5.

HE staining observation in each group at 8 weeks (×200)

术后 8 周各组 HE 染色观察（×200）

a. A 组（箭头示纤维组织连接）；b. B 组（箭头示肥大软骨细胞）；c. C 组（箭头示 SVFs）；d. D 组（箭头示肥大软骨细胞）

a. Group A (Arrow for fiber connection); b. Group B (Arrow for hypertrophic chondrocytes); c. Group C (Arrow for SVFs); d. Group D (Arrow for hypertrophic chondrocytes)

图 6.

Masson trichrome staining observation in each group at 8 weeks (×200)

术后 8 周各组 Masson 三色染色观察（×200）

箭头示新骨形成　a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组

Arrow for new bone formation　a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D

2.3.5 OCN 免疫组织化学染色观察　B、D 组塑形的 DBX 周围有大量 OCN 染色阳性表现，D 组表达量更高；A、C 组 OCN 染色强度较低。见图 7。

图 7.

OCN immunohistochemical staining observation in each group at 8 weeks (×400)

术后 8 周各组 OCN 免疫组织化学染色观察（×400）　

箭头示 OCN 阳性表达　a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组

Arrow for OCN positive expression　a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D

3. 讨论

3.1. SVFs 作为种子细胞的优势

在组织工程研究中，种子细胞是非常重要的一环。目前干细胞研究是主流方向，如 BMSCs 和脂肪来源干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs），但对于临床实际应用仍有一定距离，如 BMSCs 来源受限，且取材对自体损伤较大^[5]；ADSCs 可避免上述问题，但提取后需要体外培养、传代及纯化，人为增加了感染风险，限制了其实际应用^[6-7]。本实验采用 SVFs 作为移植细胞，SVFs 是从新鲜脂肪组织提取的混杂细胞群，主要包括 ADSCs、内皮细胞、血管平滑肌细胞/周细胞和其他部分血液来源细胞（粒细胞、单核细胞、淋巴细胞及造血干细胞等）等^[8-9]。SVFs 与 ADSCs 比较具有以下优点：① 无需经 2～3 周传代培养，提取分离操作在数小时内即可完成，并能即时用于临床治疗；② 取材容易，来源充分，并可分泌多种细胞因子；③ 含有大量多向分化潜能的基质干细胞，可向软骨细胞、骨细胞等多种成体细胞分化，是组织工程学较理想的种子细胞。Varma 等^[10]进行了一项对比研究，从人的脂肪组织中分离出 SVFs 和 ADSCs（第 4 代），从细胞表型分析两者基本近似，主要是 CD34⁺ CD117⁺ HLADR⁺；体外诱导成骨能力方面，基因表达（Runx2）、ALP 活性以及 OCN 形成等方面两者也基本相同。所以，本实验选择 SVFs 作为种子细胞，不需要通过体外纯化，可应用“一步法”直接移植进行脊柱融合。

3.2. 构建具有缓释作用的 rhBMP-2

rhBMP-2 是目前被美国食品和药物管理局（FDA）同意应用于人身上的一类生长因子，具有良好的骨修复和骨再生效果；但因其是水溶性蛋白并且半衰期较短，在体内降解较快，为获得良好的融合效果，临床上常使用超生理剂量，这种大剂量使用出现了一些不良反应，如局部炎性反应、异位骨化、软组织水肿以及激发破骨细胞活跃等^[11-13]，影响治疗效果。如何使 rhBMP-2 在体内缓慢释放，维持植入部位较高药物浓度，提高骨融合率的同时避免并发症的发生，是目前研究热点。

为使生长因子或蛋白达到持续作用或缓释效果，有采用干细胞转染生长因子基因的方法，如 Wang 等^[14]通过腺病毒携带的 rhBMP-2 转染 BMSCs，Hsu 等^[15]通过腺病毒携带的 rhBMP-2 转染 ADSCs，虽然都取得了不错的结果，但很难在临床实际中应用，主要问题是体外需要较长时间构建，此外还有病毒载体的问题^[16]。除了基因转染的方法，还可使生长因子包裹或吸附至释放载体或支架上^[17-18]，从而阻止多肽链解离。为了使 rhBMP-2 达到局部缓慢释放的作用，本实验选用 β-TCP 作为载体，通过仿生磷灰石方法使 rhBMP-2 涂层至 β-TCP 颗粒上^{[4, 19]}，然后应用冻干法使 rhBMP-2 结合到 β-TCP 上。体外实验结果表明该方法可使 rhBMP-2 持续释放，14 d 达 40% 左右释放，而单纯 rhBMP-2 结合 β-TCP 几乎在 1～2 d 时间内达到完全释放，观察的 2 周内近乎零释放。因此该方法使 rhBMP-2 达到了缓释作用于 SVFs 获得骨再生的效果。

3.3. rhBMP-2 缓释作用 SVFs 在脊柱融合中的优势

骨组织形成有两种方式，即膜内成骨和软骨内成骨^[20]。前者的新生骨组织在结缔组织膜中由间充质细胞直接形成，后者是指结缔组织内的间充质细胞首先分化为软骨组织，然后在软骨组织的基础上进行钙化成骨。从本实验结果看，主要以软骨内成骨方式形成新骨，植入 SVFs 与 rhBMP-2，rhBMP-2 除了直接作用于移植的 SVFs，也可使体内 BMSCs 向成骨转化，提高了成骨效率，从成骨质量上 D 组优于 B 组。

对脊柱融合效果进行分析时，我们选取横突之间作为检测范围，与 Boden 等^[21]报道相一致，他们认为脊柱融合的外围部分即邻近横突处，最易形成骨性连接，而在融合范围的中央部分最易形成假关节，因为横突细小，对移植物的中央部位血液供应少，需要血管再化生。本实验通过 micro-CT 和组织学检测提示达到了良好的骨融合效果。实验中发现单纯细胞移植组骨融合率较低，既往报道也显示，单纯使用 BMSCs 以及 ADSCs 与可吸收性胶原海绵结合也未发生融合，而且成骨量几乎可以忽略不计^[14-15]。Lin 等^[22]也认为，单纯应用干细胞进行骨修复及再生成骨能力有限，除非干细胞预先进行成骨诱导或者与骨诱导因子共同作用。所以我们认为在脊柱融合方面，单纯干细胞移植成骨能力有限，需要与生长因子结合才能发挥有效的作用。

综上述，本研究结果表明，从大鼠脂肪组织中提取 SVFs，不经过体外培养直接与骨诱导因子 rhBMP-2 结合，可有效促进脊柱融合，为临床应用提供实验基础。但本研究也存在以下不足：本实验直接植入提取的 SVFs，为避免外在因素对 SVFs 的影响，未对 SVFs 进行示踪标记，影响了对所移植 SVFs 的体内观察；此外，人来源的 SVFs 可能与大鼠来源的 SVFs 存在差异，在未来研究工作中需要进一步论证，如提取人来源的 SVFs，选用无胸腺大鼠（为避免排斥反应）作为实验动物进行对比研究等。

Funding Statement

上海市浦东新区卫生系统学科带头人培养计划（PWRd2015-02）；上海健康医学院种子基金项目（HMSF-16-21-025）；上海市卫生和计划生育委员会科研课题面上项目（201440387）；上海市医学重点专科建设项目（ZK2015A14）

Training Planned Fund of Academic Leaders, Shanghai Pudong New Area Health System (PWRd2015-02); the Seed Fund Program of Shanghai University of Medicine & Health Sciences (HMSF-16-21-025); Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (201440387); Shanghai Municipal Key Specialty Construction Fund of Shanghai Municipal Health Bureau (ZK2015A14)