不同电刺激波形对脂肪间充质干细胞定向排列的影响

Abstract

目的

探讨不同电刺激波形对脂肪间充质干细胞（adipose derived mesenchymal stem cells，ADSCs）定向排列和细胞存活率的影响。

方法

取 5 周龄 SD 大鼠（体质量 100～150 g）体外分离培养 ADSCs。用第 3～5 代细胞制备细胞爬片，放入自制电场生物反应器中，分别施以电场强度为 1、2、3、4、5、6 V/cm 的直流电刺激（分别设为 A1、A2、A3、A4、A5、A6 组）；电场强度 6 V/cm、占空比 50%、频率 1 Hz 和 2 Hz 的方波电刺激（分别为 B1、B2 组）；电场强度 6 V/cm、脉宽 2 ms、频率 1 Hz 和 2 Hz 的双相脉冲波电刺激（分别为 C1、C2 组）。对照组（D 组）不施加电刺激。采用倒置显微镜定时拍照法观察 ADSCs 在电场作用过程中的形态学变化，计算细胞排列的平均对齐指数（orientation factor，OF）；采用罗丹明-鬼笔环肽荧光染色分析电场刺激后细胞的骨架排列；活死染色法分析细胞存活率；钙离子荧光染色标识电刺激中细胞内钙离子分布，分析细胞钙离子活动功能。

结果

ADSCs 对直流电刺激的响应与电场强度相关，电场强度越高，形成垂直排列的细胞越多；各时间点 B1、B2 组及 C1、C2 组均未发现明显的细胞定向排列现象。除 A5、A6 组平均 OF 显著高于 D 组（P<0.05）外，其余各组平均OF 与 D 组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。细胞骨架染色分析表明，A5、A6 组细胞形成紧密的束状细胞骨架结构，且趋向于垂直电场矢量方向排列。细胞活死染色显示，除 A4、A5、A6 组细胞存活率显著低于 D 组（P<0.05）外，其余各组细胞存活率与 D 组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。钙离子荧光染色显示，A4、A5、A6 组细胞内的钙离子荧光强度稍高于 D 组，其余各组细胞内的钙离子荧光强度与 D 组比较无显著差别。

结论

直流电场强度 5 V/cm 和 6 V/cm 刺激可引起 ADSCs 定向排列，直流电场强度低于 5 V/cm 以及方波和双相脉冲波均未引起细胞定向排列；电刺激后细胞存活率与电场强度成负相关。

细胞排列在细胞骨架重组、膜蛋白重定位、细胞核基因表达和细胞外基质重塑等多种细胞行为中起着关键性作用，并且对组织的修复和再生具有重要影响^[1]。细胞有序排列的重要性在临床上已得到证实，例如因肥厚性心肌病引起的心肌紊乱，在临床上首先表现为心肌细胞定位失调，进而失去有序排列状态^[2]；而且伴随着心肌紊乱，心肌细胞之间原本有规律的缝隙连接结构（闰盘结构）也出现紊乱，最终导致心律失常^[3]。

在体外细胞培养中，诱导细胞产生有序排列可采用力学拉伸、培养表面雕刻条纹、表面化学修饰以及电刺激等方法^[1]，其中电刺激方式由于其电气参数设定相对方便而受到较大关注。迄今为止，在细胞定向排列方面对于直流电场的研究较多，而对其他电刺激波形，例如方波和双相脉冲波的研究较少（图 1）。脂肪间充质干细胞（adi-pose derived mesenchymal stem cells，ADSCs）是从脂肪组织中分离获得的一种具有向脂肪、软骨、成骨、成肌、心肌细胞等多向分化潜能的干细胞^[4-6]。本文研究 ADSCs 对于不同电刺激波形（包括直流、方波和双相脉冲波）的细胞响应，采用倒置显微镜定时拍照法记录细胞电刺激响应过程，并计算细胞排列的平均对齐指数（orientation factor，OF）；罗丹明-鬼笔环肽荧光染色分析电刺激后细胞的骨架排列；活死染色法分析细胞存活率；钙离子荧光染色试剂标识电场刺激过程中的细胞内钙离子分布，分析细胞钙离子活动功能。通过上述研究以期提高对不同电刺激波形在细胞定向排列中作用的认识，为组织工程和再生医学的研究提供新的实验依据。

图 1.

Illustrations of electrical stimulation wave forms

电刺激波形示意图

a. 直流电；b. 方波；c. 双相脉冲波

a. Direct current; b. Square wave; c. Biphasic pulse wave

1. 材料与方法

1.1. 电刺激装置

细胞电刺激装置采用自制电场生物反应器^[7-8]。该反应器采用有机玻璃材料制作，包含细胞培养室和密封盖，培养室两端直接与培养液池相连。该反应器有 2 个盐溶液池，用来注入 Steinberg 缓冲液，在盐池中插入石墨电极并与外部直流电源相连。细胞培养室与 2 个盐溶液池之间通过沟槽型琼脂盐桥相连，这种特殊设计的琼脂盐桥可有效防止盐溶液池中电解产物向细胞培养室扩散，避免电解产物对细胞造成影响。反应器盖板用于防止培养液和 Steinberg 缓冲液蒸发；反应器盖板预留测试探针通孔，可插入数字万用表探针实时监测细胞培养室两端的电势差，以确定细胞培养室的电场强度。细胞电刺激所使用的直流电场由一台输出电压可调的电泳仪电源（DYB-1；上海博通化学科技有限公司）提供，实测细胞培养室电场强度调节范围为 0～10 V/cm。方波和双相脉冲波均由自行设计的脉冲发生器产生，输出频率可调（1～10 Hz），电压幅值可调（0～10 V），脉宽可调（1～5 ms）。

1.2. 实验动物及主要试剂、仪器

5 周龄清洁级 SD 大鼠 2 只，雌雄不限，体质量分别为 100 g 和 150 g，由四川大学实验动物中心提供。Ⅰ型胶原酶、DAPI、钙黄绿素-AM、碘化丙啶、Hoechst33342（Sigma 公司，美国）；FBS（Invitrogen 公司，美国）；H-DMEM（HyClone 公司，美国）；25 cm² 培养瓶、100 mm 细胞培养皿（Corning 公司，美国）；罗丹明-鬼笔环肽（Cytoskeleton 公司，美国）；抗荧光淬灭封片剂（碧云天生物技术研究所）；钙离子荧光试剂 Fluo-3/AM（AAT Bioquest 公司，美国）。CKX41 倒置显微镜、BX60 荧光显微镜（Olympus 公司，日本）；IBE2000 倒置显微镜（重庆光学仪器厂）；MD50 显微镜摄像头（广州明美光电技术有限公司）；XDS-30 倒置荧光显微镜（浙江舜宇光学有限公司）；Image Pro Plus 6.0 图像分析软件（Media Cybernetics 公司，美国）。

1.3. ADSCs 分离培养及鉴定

参照文献[9-11]方法分离培养 ADSCs：取 SD 大鼠皮下脂肪组织，剪碎成 1 cm³ 大小的颗粒；加入 0.1%Ⅰ型胶原酶，37℃ 振荡消化 45 min；加入 2 倍体积的基础培养液（含 10%FBS 的 H-DMEM 培养基）中和消化液，收集细胞悬液，283×g 离心 8 min；弃上清获得细胞沉淀物，加入适量基础培养液重悬细胞，同上法离心 1 次；弃上清，加入完全培养液（含 15%FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 H-DMEM 培养基）重悬细胞；经 200 目细胞滤网过滤后接种至 25 cm² 培养瓶，于 37℃、5% CO₂、饱和湿度培养箱培养，隔天换液；当细胞铺满接近融合状态时，用含 0.02%EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶消化、传代，此后每隔 5～6 d 进行传代培养，取第 3～5 代细胞用于以下研究。参照文献[9]方法采用流式细胞仪鉴定分离培养的细胞为 ADSCs。

1.4. 实验分组及方法

根据不同电刺激波形将实验分为 4 组，A 组采用直流电刺激，B 组采用方波电刺激，C 组采用双相脉冲波电刺激，D 组无电刺激作为对照组。具体方法如下：

A 组：预先准备 10 mm×20 mm 血盖片，经过强酸和强碱浸泡、清洗、高压灭菌、烘干后放入超净台。取适量血盖片置于 100 mm 细胞培养皿，加入 0.1% 明胶包被溶液（溶于 0.01 mol/L PBS，过滤除菌）浸泡血盖片，于 37℃、5%CO₂、饱和湿度细胞培养箱中静置 30 min；弃包被液，PBS 清洗 3 次，晾干备用。用 0.25% 胰蛋白酶消化 ADSCs，将 200 μL 浓度为 1×10⁴ 个/mL 的细胞悬液接种于血盖片，制成细胞爬片，置于 37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱培养 4 h；待细胞完全贴壁后补充细胞培养液，继续培养 24 h。将细胞爬片放入电场生物反应器，盖好细胞培养室密封塞，在培养基储液池中加注电刺激细胞培养液{[在完全培养液中添加 25 mmol/L 羟乙基哌嗪乙磺酸[（N-（2-Hydroxyethyl）piperazine-N'-（2-ethanesulfonic acid），HEPES]}。在两个盐溶液池中注入 Steinberg 缓冲液，插入碳棒电极，连接电源。将反应器置于倒置显微镜操作平台上，选择观察视野；开启电泳仪电源，调节输出电压使得细胞培养室电场强度达到预设参数。开启显微镜摄像头进行定时拍照记录，拍照间隔为 1 min。分别给予 1、2、3、4、5、6 V/cm 电场强度刺激（分别设为 A1、A2、A3、A4、A5、A6 组），每组刺激时间为 6 h。各个测试条件至少完成 3 个重复样本的实验。

B 组：除了电刺激波形为方波外，其余细胞爬片的准备和实验方法同 A 组。设置 2 个亚组，电刺激条件分别为电场强度 6 V/cm、占空比 50%、1 Hz（B1 组）和电场强度 6 V/cm、占空比 50%、2 Hz（B2 组），每组刺激时间为 6 h。

C 组：除了电刺激波形为双相脉冲波外，其余细胞爬片的准备和实验方法同 A 组。设置 2 个亚组，电刺激条件分别为电场强度 6 V/cm、2 ms、1 Hz（C1 组）和电场强度 6 V/cm、2 ms、2 Hz（C2 组），每组刺激时间为 6 h。

D 组：同上法将细胞爬片放入电场生物反应器中，但不施加电刺激。

1.5. 观测指标

1.5.1 细胞形态变化观察　采用倒置显微镜观察各组各时间点细胞形态变化。

1.5.2 细胞排列的 检测　细胞排列的对齐程度采用 进行评估，参照文献[12]方法并作适当修改。将倒置显微镜采集到的细胞图像导入 Image Pro Plus 6.0 图像分析软件，每幅图像随机选择 30～50 个细胞进行分析。分别标示出每个待测细胞的长轴与电场矢量的夹角，然后用以下公式进行计算： 。其中 为平均 ， 为第 i 个细胞的 ，i 取值范围为 1～n；θ 为细胞长轴与电场矢量方向的夹角，θ_i 的取值范围为 –90～90°，因此 的取值范围为 –1～1（图 2）。例如：若细胞与电场矢量方向平行，θ_i=0°，则 =cos（2×0°）=1；若细胞与电场矢量方向垂直，θ_i=90° 或 θ_i=–90°，则 OF_i= cos（±2×90°）=–1。依次将所有细胞的 计算出来并取平均值，得到全部细胞的 。

图 2.

Illustrations of cellular orientation factor OF

细胞 OF 示意图

表示电场矢量 a. 当 θ_i 位于 0～90° 时，OF_i 取值范围为 1～–1；b. 当 θ_i 位于 –90～0° 时，OF_i 取值范围为 –1～1

The represents the electric field vector a. When θ_i lies in 0 to 90°, OF_i locates at 1 to –1; b. When θ_i lies in –90 to 0°, OF_i locates at –1 to 1

1.5.3 细胞骨架染色分析　电刺激结束后取出各组细胞爬片，选择一部分样本（A4、A5、A6 组和 D 组）采用细胞肌动蛋白丝染色法检测细胞形态学变化。将细胞爬片用 4% 多聚甲醛固定 10 min，PBS 漂洗 3 次，0.01%Triton X-100 对细胞膜打孔 10 min；PBS 漂洗 3 次，加入 100 nmol/L 罗丹明-鬼笔环肽，室温避光孵育 30 min；PBS 漂洗 3 次，加入 1 μg/mL DAPI 复染细胞核；弃多余水分，用抗荧光淬灭封片剂封片，然后置于连接 MD50 显微镜摄像头的荧光显微镜平台，观察罗丹明-鬼笔环肽标记的细胞肌动蛋白丝的分布状况。

1.5.4 细胞活死染色检测　取各组剩余细胞爬片置于新的 6 孔培养板中，每孔放置 1 片并加入 2 mL 完全培养液继续培养 2 h。取出爬片，PBS 漂洗 3 次，加入细胞活死染色液（每毫升 PBS 中加入 4 μmol/L 钙黄绿素-AM、4 μmol/L 碘化丙啶、1 μg/mL Hoechst33342），37℃、5%CO₂、饱和湿度细胞培养箱中孵育 30 min。弃染色液，PBS 漂洗 3 次后放置在连接 MD50 显微镜摄像头的倒置荧光显微镜平台观察，活细胞被染成绿色，死细胞被染成红色。每个样本随机选取 5 个视野，分别统计活细胞数和死细胞数，按以下公式计算细胞存活率：[活细胞数/（活细胞数+死细胞数）]×100%。

1.5.5 电刺激作用下细胞的钙离子活动检测　为探索细胞在电场刺激下定向排列的内在机制，采用钙离子荧光染色法^[13]对 ADSCs 内的钙离子活动进行染色分析。具体方法：按 1.4 描述的方法制备细胞爬片（未经电场刺激），加入含 10 μmol/L 钙离子荧光试剂 Fluo-3/AM 的 Tyrode 溶液（136 mmol/L NaCl、5.4 mmol/L KCl、0.33 mmol/L NaH₂PO₄、1.0 mmol/L MgCl₂、10 mmol/L HEPES、10 mmol/L Glucose、1.8 mmol/L CaCl₂，pH=7.4），在 37℃、5% CO₂、饱和湿度细胞培养室孵化 20 min。然后用无染色剂的 Tyrode 溶液漂洗 2 遍，将分组后的细胞爬片放入生物反应器，接通电刺激电源，给予相应电刺激，倒置荧光显微镜下观察。

1.6. 统计学方法

采用 SPSS14.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. 不同波形电刺激作用下细胞的定向排列

2.1.1 倒置显微镜观察　A 组：ADSCs 对直流电刺激的响应与电场强度相关，电场强度越高，形成垂直排列的细胞越多。A1～A4 组仅有少量细胞响应电场刺激而垂直于电场排列；A5 组许多细胞在 2 h 已呈现出垂直于电场排列的趋势，6 h 后绝大部分细胞垂直于电场的定向排列。提示在相同的直流电场刺激时间内，ADSCs 对电场刺激的响应存在阈值现象，此阈值可能在 4～5 V/cm 间。A6 组绝大多数细胞响应电场刺激，4 h 时基本上垂直于电场排列。在响应电场刺激的过程中，可观察到 ADSCs 通过细胞伪足的横向收缩和纵向延长来实现；一些原本呈现多边形的细胞在电场力作用下，逐渐形成垂直于电场的纺锤形细胞形态。另外，在电场刺激过程中，一些细胞保持正常的细胞分裂活动（如 A6 组中的一些折光性强的小圆形细胞）；说明 6 V/cm 直流电场强度是处于生理强度范围内的。有个别细胞不受电场的影响，保持其原来的细胞排列方向，推测可能与 ADSCs 中包含其他类型混杂细胞有关。见图 3。

图 3.

The morphological changes of cells in group A by inverted microscope at each time point (White arrow indicated the direction of electrical field)

倒置显微镜观察 A 组各时间点细胞形态变化（白箭头示电场方向）

从左至右依次为 0、2、4、6 h　a. A1 组（×10）；b. A2 组（×10）；c. A3 组（×25）；d. A4 组（×10）；e. A5 组（×10）；f. A6 组（×10）

From left to right for the images at 0, 2, 4, and 6 hours, respectively　a. Group A1 (×10); b. Group A2 (×10); c. Group A3 (×25); d. Group A4 (×10); e. Group A5 (×10); f. GroupA6 (×10)

各时间点 B1、B2 组，C1、C2 组及 D 组均未发现明显的细胞定向排列现象。另外，在双相脉冲作用下，细胞仍保持正常的细胞分裂和增殖，说明双相脉冲电场强度处于生理强度范围内。见图 4。

图 4.

The morphological changes of cells in groups B1, C1, and D by inverted microscope at each time point (White arrow indicated the direction of electrical field)

倒置显微镜观察 B1、C1、D 组各时间点细胞形态变化（白箭头示电场方向）

从左至右依次为 0、2、4、6 h　a. B1 组（×10）；b. C1 组（×10）；c. D 组（×10）

From left to right for the images at 0, 2, 4, and 6 hours, respectively　a. Group B1 (×10); b. Group C1 (×10); c. Group D (×10)

2.1.2 　D 组 为 –0.01±0.07。A1～A6 组分别为 0.02±0.14、–0.12±0.03、–0.18±0.09、–0.23±0.10、–0.71±0.08、–0.84±0.03，B1、B2 组分别为 0.06±0.19 和 –0.04±0.17，C1、C2 组分别为 –0.07±0.09 和 –0.07±0.18。除 A5、A6 组 显著高于 D 组，比较差异有统计学意义（P<0.05）外，其余各组 与 D 组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；A5、A6 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2. 细胞骨架染色分析

电刺激 6 h 后，A5、A6 组绝大部分细胞的肌动蛋白丝垂直于电场强度方向排列，并形成平行排列的条束状结构；一些原先呈圆形的细胞核在电场力作用下变为椭圆状，也倾向于垂直电场矢量方向。A1～4 组，B1、B2 组，C1、C2 组和 D 组细胞的肌动蛋白丝处于随机分布状态，单个细胞占有培养表面的面积较大。见图 5。

图 5.

Fluorescence staining of cytoskeleton in each group after 6 hours electrical stimulation (Fluorescence microscope×20)

电刺激 6 h 后各组细胞骨架染色分析（荧光显微镜×20）

红色示罗丹明-鬼笔环肽标记的细胞肌动蛋白丝，蓝色示 DAPI 标记的细胞核　a. A4 组；b. A5 组；c. A6 组；d. D 组

Cellular actin filaments were stained with rhodamin-phalloidin (red), nuclei were stained with DAPI (blue)　a. Group A4; b. Group A5; c. Group A6; d. Group D

2.3. 细胞活死染色检测

细胞活死染色检测示，各组绝大多数细胞为活细胞，死亡细胞很少。D 组细胞呈随机排列；A4 组有一些定向排列趋势，而 A5、A6 组大多数细胞垂直于电场方向排列。见图 6。

图 6.

Live/dead cell assay in each group after 6 hours electrical stimulation (Fluorescence microscope×20)

电刺激 6 h 后各组细胞活死染色检测（荧光显微镜×20）

绿色示钙黄绿素-AM 标记活细胞的细胞质，红色示碘化丙啶标记死细胞的细胞核，蓝色示 Hoechst33342 标记所有细胞的细胞核　a. A4 组；b. A5 组；c. A6 组；d. D 组

Cytoplasm of live cells were stained with calcein-AM (green), nuclei of dead cells were stained with propidium iodide (red), and the nuclei of all cells were stained with Hoechst33342 (blue)　a. Group A4; b. Group A5; c. Group A6; d. Group D

D 组细胞存活率为 95.73%±1.99%；A1～A6 组分别为 96.50%±1.15%、95.07%±2.01%、91.73%±1.56%、87.50%±1.21%、85.10%±2.10%、80.73%±2.46%；B1、B2 组分别为 93.47%±3.20%、92.47%±4.54%；C1、C2 组分别为 92.33%±2.06%、92.00%±3.20%。除 A4、A5、A6 组细胞存活率显著低于D组，比较差异有统计学意义（P<0.05）外，其余各组细胞存活率与 D 组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；A4、A5 组细胞存活率显著高于 A6 组，比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4. 电刺激作用下细胞的钙离子活动检测

A4、A5、A6 组细胞内的钙离子荧光强度稍高于 D 组，其余各组细胞内的钙离子荧光强度与 D 组比较无显著差别。见图 7。另外，在开通和关断 A6 组电刺激的瞬间，观察到部分细胞出现了钙离子振荡波，这些振荡波持续时间为 1～3 s，说明 6 V/cm 直流电刺激开关状态能够诱发细胞的钙离子振荡波；但持续给予直流电刺激并未出现更多钙离子振荡波，表明 ADSCs 尚未分化成具有电传导功能的细胞（如心肌细胞或神经细胞）。

图 7.

The fluorescence intensity of calcium ion in each group after 6 hours electrical stimulation (Fluorescence microscope×20)

电刺激 6 h 后各组细胞钙离子荧光强度检测（荧光显微镜×20）

a. A4 组；b. A5 组；c. A6 组；d. D 组

a. Group A4; b. Group A5; c. Group A6; d. Group D

3. 讨论

细胞有序排列在细胞骨架重组、基因表达和细胞外基质重塑等细胞行为中起关键作用，并影响组织的修复和再生。采用电场刺激是一种调控细胞有序排列的便捷手段。既往文献表明直流电场可促进细胞形态伸长并垂直于电场矢量方向排列^[14]。细胞由无序到有序排列的响应时间取决于所施加的电场强度。例如，给予内皮祖细胞直流电场连续作用 4 h，其有序排列程度与电场强度（1～4 V/cm）成正比，电场强度越高，细胞有序排列程度越高^[15]。电刺激还会影响细胞和组织的生物学功能，例如心肌细胞在电刺激作用下产生同步收缩，并逐渐形成有序排列的结构，从而降低兴奋阈值电压和增加收缩幅度^[16]。在分子水平上，电刺激还会增强心肌细胞的基因表达水平，增加缝隙连接蛋白 43、心肌肌钙蛋Ⅰ、肌球蛋白重链和横纹肌 α 肌动蛋白的表达，并显著增强组织工程心肌片的电脉冲传播^[17]。

在细胞定向排列研究方面，目前对于直流电场的研究文献较多，而对其他电刺激波形的研究较少。虽然方波和双相脉冲波已广泛应用于临床实践，但它们对细胞定向排列的影响目前所知甚少。方波本质是以一种周期性间断的直流电场，描述方波的电气参数一般用电压幅度、频率和占空比表示，标准方波是占空比为 50% 的矩形波，占空比<50% 的方波被称为矩形脉冲波或单相脉冲波，常用脉宽来标识其波形参数，脉宽与占空比和频率相关。双相脉冲波是指同时具有正负脉冲的波形，在电生理研究和临床上最常见的双相脉冲波是电荷平衡双相脉冲波。单个波形周期内正负脉冲相伴出现，以避免连续的单相脉冲波（正脉冲或负脉冲）造成刺激电极直流极化，进而产生电化学副作用。无论是方波还是双相脉冲波，在基础医学和临床医学中的应用都比较广泛。例如，方波可用于透皮给药，通过皮肤电穿孔促进药物渗透至皮下，实现无创或微创治疗^[18]；双相脉冲波常用于心脏起搏、除颤^[19-20]；双相脉冲波（2.5 V/cm、1 Hz、1 ms）能引起心肌成纤维细胞形态伸长，促进细胞增殖^[21]。与单相方波相比，双相脉冲波能够更有效地促进心肌祖细胞向心肌细胞分化^[22]，并促进 ADSCs 分化为心肌细胞样细胞^[9]。ADSCs 是从脂肪组织中分离获得的一种具有多向分化潜能的干细胞，其具有取材容易的特点，只需少量组织即可获得大量干细胞，适宜大规模培养，是一种比 BMSCs 更理想的成体干细胞^[23]。还有研究发现 ADSCs 能够在体外连续传代 20 次以上，且稳定保持其干细胞转录因子特征^[24]。

本研究观察了 ADSCs 在各种直流、方波和双相脉冲波作用下的细胞响应，结果显示在 5 V/cm 和 6 V/cm 直流电场作用下，ADSCs 响应电刺激垂直于电场矢量方向排列；直流电场强度低于 5 V/cm 时，以及方波（6 V/cm、1 Hz 和 6 V/cm、2 Hz）和双相脉冲波（6 V/cm、2 ms、1 Hz 和 6 V/cm、2 ms、2 Hz）均未能引起细胞的定向排列。从细胞的 分布来看，6 V/cm 直流电场作用下细胞具有最高的 ，5 V/cm 电刺激组次之，说明细胞的定向排列与电场强度密切相关。在 6 h 的电刺激时间段内，未观测到方波和双相脉冲波对细胞定向排列的影响，推测可能是因细胞受到的电刺激强度不够所致。虽然方波和双相脉冲波都具有 6 V/cm 的电场强度，但方波只有 50% 的占空比，在相同刺激电压下，方波电刺激组中细胞受到的平均电流仅有直流电场刺激的一半，因此较低的电流刺激不足以引起细胞的定向排列。双相脉冲波刺激组中的脉宽为 2 ms，当频率为 1 Hz 时占空比为 0.2%，当频率为 2 Hz 时占空比为 0.4%，显然施加到细胞中的平均电流比方波更弱，因此也未能引起细胞的定向排列。但这并不排除方波和双相脉冲波诱导细胞定向排列的可能性。在细胞响应电刺激过程中，还有一个重要因素应引起注意，即细胞膜的静息电位变化。实际上，双相脉冲波之所以能够用于心脏起搏或心肌除颤，就是因为脉冲信号引起细胞膜静息电位的改变，细胞膜去极化引起了细胞的电传导，从而调控细胞的力电行为。要进一步了解脉冲波对细胞定向排列的影响，需要对电刺激参数进行更多摸索。另外，延长刺激时间也是一个重要选项，而这一点恰恰是应用直流电场刺激的限制条件，长时间的直流电场刺激会造成刺激电极极化，引起细胞培养液的电解，产生电化学副作用，造成细胞凋亡。双相脉冲波是一种正负电荷平衡的波形，能够有效抑制电化学副作用，因此可对细胞施加更长时间的电刺激。

直流电场 6 V/cm 属于生理电场强度范围，已有研究表明，受损的角膜上皮组织能够产生相当于 5 V/cm 的内源性直流电场，进而动员周边细胞迁徙至伤口处来促进伤口愈合^{[14, 25-26]}。本研究的细胞骨架染色结果可见，定向排列的细胞形成比较紧密的细胞骨架结构，这有助于组织的修复和连接。若进一步提高直流电场强度，细胞定向排列的 可能会提高，但相应的电化学副作用也会增大。由于细胞培养液发生电解反应，pH 值变化，加上电流增大后产生的焦耳热，导致细胞凋亡率上升。本研究结果也可观察到，细胞存活率与所施加的直流电场强度成负相关，电场强度越高，存活率越低。但各实验组的细胞存活率均>80%，表明在实验中所采用的电刺激波形尚属生理电场强度范围以内。

细胞之所以能够形成垂直于电场矢量方向的定向排列，可能与细胞内的钙离子活动相关。本研究中钙离子荧光染色结果显示，5 V/cm 和 6 V/cm 电场刺激后细胞钙离子活动增强，据此推测，细胞质内带二价正电荷的游离钙离子，在直流电场作用下向电场矢量的负极聚集，细胞内带负电荷的氯离子向电场矢量的正极迁徙，形成细胞内正负离子的极化分布，导致细胞骨架的重新排列。同时细胞通过钙离子通道对细胞内外钙离子的流动进行调控，逐渐达到新的动态平衡，并使细胞伪足垂直于电场矢量方向排列。

综上述，在 3 种电刺激波形中，直流电场刺激促进 ADSCs 的形态学变化，在 5 V/cm 和 6 V/cm 电场强度作用下可使其垂直于电场矢量方向定向排列，并保持良好的细胞存活率；实验方案中的方波与双相脉冲电场可保持 ADSCs 具有良好的细胞存活率，但不能引起细胞的定向排列。这些实验研究有助于提高我们对不同电刺激波形在细胞定向排列中作用的认识，也为组织工程和再生医学的研究提供了新的实验依据。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（81500213）；四川省教育厅科技项目（17ZA0019）

National Natural Science Foundation of China (81500213); Science and Technology Support Program of Sichuan Provincial Education Department (17ZA0019)