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. 2017 Apr;31(4):437–442. [Article in Chinese] doi: 10.7507/1002-1892.201611059

超声微泡转基因技术促增强型绿色荧光蛋白基因在骨缺损处转染的实验研究

Research of enhanced green fluorescent protein gene transfer with ultrasound-mediated microbubble destruction in bone defects

Shiwei LI 1, Xiaoli XIE 2, Xiaodong YANG 1, Lijun LIU 1, Xueyang TANG 1,*
PMCID: PMC8498166  PMID: 29798609

Abstract

Objective

To investigate the effect of ultrasonic irradiation time on enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene transfection efficiency and local tissue in bone defects using ultrasound-mediated microbubble destruction.

Methods

Thirty 3-month-old New Zealand rabbits (2.5-3.0 kg in weight) were randomly divided into 5 groups (n=6) and bone defect models were made on the right ulna. At 10 days after modeling, suspension of microbubbles and EGFP plasmids were locally injected (0.3 mL/kg) and then ultrasound was performed on defect at a frequency of 1 MHz, a intensity of 0.5 W/cm2, and a duty ratio of 20% for 1, 2, 3, 4, and 5 minutes respectively (in 1, 2, 3, 4, and 5 minutes groups respectively). The survival condition was observed. Rabbits were sacrificed for gross observation at 7 days after transfer. The gene expression was observed by fluorescence staining. HE staining and transmission electron microscopy were used to observe the local tissue damage.

Results

The animals all survived. New soft tissue formed in bone defects area at 1 week after transfer, the surrounding muscle tissue was partly filled in it. Green fluorescence expression was observed in all rabbits. The expression was the strongest in 2 minutes group, and was the weakest in 1 minute group. The absorbance (A) value showed significant differences when compared 1 minute and 2 minutes groups with other groups (P<0.05), but no significant difference was found between 3, 4, and 5 minutes groups (P>0.05). Tissue damage was observed in all groups and it was aggravated with the increase of irradiation time.

Conclusion

EGFP transfection efficiency in bone defect by ultrasound-mediated microbubble destruction is related to irradiation time. EGFP gene can be efficiently transfected without obvious toxicity at 1 MHz, 0.5W/cm2, and duty ratio of 20% for 2 minutes in bone defects of rabbits.

Keywords: Bone defect, ultrasound-mediated microbubble destruction, gene transfer, enhanced green fluorescent protein, rabbit

外伤、感染及肿瘤等导致的骨缺损是矫形外科治疗难题[1-3]，临床常用的自体或同种异体骨移植修复仍有骨不连发生风险[4]；带血管蒂骨移植及骨搬运技术治疗长段骨缺损有一定优势，但愈合时间较长[5-6]。如在这些治疗方法基础上辅以刺激骨再生方法，则有望提高骨缺损愈合率以及缩短愈合所需时间。

有研究表明，病毒载体介导的 BMP-2 基因治疗可以促进骨缺损愈合[7-8]。但病毒载体转染存在潜在毒性及免疫原性问题，限制了临床应用。超声微泡转基因技术是一种新型基因转染方法，具有安全、高效、靶向、易重复等优点[9-10]。目前该技术已用于肝脏、肾脏、血管、跟腱等领域的研究[11-14]，但罕见应用于骨缺损相关研究的报道。超声微泡转基因技术转染效率受超声基本参数（辐照时间、辐照强度、占空比）影响，不恰当的参数设置不仅会降低转染效果，甚至会导致组织损伤[11, 15-18]。此外，不同组织和器官其适用的超声参数也不同，骨缺损断端间早期以纤维骨痂及嵌入的骨骼肌为主，肝脏、肾脏及跟腱等组织的最适参数难以直接应用于骨缺损。为此，本研究旨在探讨超声微泡转基因技术介导增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因在兔骨缺损处转染时的最佳辐照时间，以期为该技术用于骨缺损修复奠定实验基础。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及主要试剂、仪器

3 月龄雄性新西兰大白兔 30 只，体质量 2.5～3.0 kg，由四川大学动物实验中心提供。pEGFP-C1 质粒（北京天漠科技有限公司）；戊巴比妥钠（Sigma 公司，美国）；注射用六氟化硫微泡（商品名：声诺维；Bracco 公司，意大利）；质粒小提试剂盒（Takara 公司，日本）。超声治疗仪（OG Giken 公司，日本）；光学显微镜（Olympus 公司，日本）；荧光显微镜（Leica 公司，德国）；透射电镜（Hitachi 公司，日本）；Image-Pro Plus 6.0 病理图像分析软件（Media Cybernetics 公司，美国）。

1.2. 实验方法

1.2.1 EGFP 质粒微泡混悬液配置　pEGFP-C1 质粒转化大肠杆菌 DH5α，经过筛选，参照质粒小提试剂盒说明书进行提取、纯化，使最终质粒浓度为 1 μg/μL，–20℃ 保存。注射用六氟化硫微泡加入生理盐水震荡均匀，使其浓度为 5 mg/mL，密度为（2～5）×108 个/mL。将制备的 EGFP 质粒与微泡按体积比 1∶2 混匀，制成 EGFP 质粒微泡混悬液，4℃ 保存。

1.2.2 骨缺损模型制备　取 30 只新西兰大白兔，耳缘静脉注射 3% 戊巴比妥钠溶液（40 mg/kg）麻醉后，仰卧位固定于手术台，右前肢剃毛，切开皮肤皮下，钝性分离肌肉，显露尺骨中段。用线锯于尺骨中段连同骨膜一并切除，制备长度为 2 cm 的骨缺损模型。术前 30 min 及术后 24、48 h 分别肌肉注射青霉素 40 万 U 预防感染，麻醉清醒后正常饲养。

1.2.3 EGFP 基因转染　造模后第 10 天，动物同上法麻醉后固定于手术台，向骨缺损处注射 EGFP 质粒微泡混悬液（0.3 mL/kg）。注射后立即用超声治疗仪辐照，超声频率 1 MHz，超声强度 0.5 W/cm2，占空比 20%。根据辐照持续时间，将动物模型随机分为 5 组（n=6），分别持续 1、2、3、4、5 min（分别为 1、2、3、4、5 min 组）[9, 19]。转染后 1 周，经耳缘静脉注射过量麻醉药物处死各组动物取材进行观测。

1.3. 观测指标

1.3.1 一般情况　造模后观察动物存活、进食、活动及切口愈合情况。

1.3.2 大体观察　转染后 1 周，按照原切口入路，肉眼观察骨缺损处软组织形态特点。

1.3.3 荧光显微镜观察　取骨缺损处软组织，OTC 包埋剂包埋，—20℃ 连续切片，切片厚度 5 μm，丙酮固定、晾干，DAPI 染色后在荧光显微镜下观察切片中绿色荧光表达情况。每只兔选取 3 张绿色荧光表达最强切片，于 200 倍镜下每张切片随机选取 5 个荧光表达最强的视野，采图后用 Image-Pro Plus 6.0 病理图像分析软件进行分析，计算吸光度（A）值，取均值。

1.3.4 组织学观察　取骨缺损处软组织，于 4% 多聚甲醛固定 24 h，脱水、透明、包埋、切片，片厚 4 μm，常规 HE 染色后，光镜下观察组织细胞形态特点。

1.3.5 透射电镜观察　取液氮保存的骨缺损处软组织，经固定、脱水、浸透包埋后切片，片厚 70 nm，枸橼酸铅染色后用透射电镜观察组织细胞形态特点。

1.4. 统计学方法

采用 SPSS16.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用 Tamhane 检验；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. 一般情况

各组动物均存活至实验完成。所有动物麻醉清醒后恢复自由饮水和进食。1 周内各组动物术肢均活动受限；4 d 内术肢有肿胀，4 d 后肿胀逐渐消失。切口均愈合良好，无渗液及化脓。

2.2. 大体观察

大体观察各组无明显差异，骨缺损断面处均有软组织生长，两断面间未连接，周围肌肉部分内陷填充于骨缺损断端之间。

2.3. 荧光显微镜观察

各组兔骨缺损处均有绿色荧光表达，其中 2 min 组表达最强，其次依次为 4 min 组、3 min 组、5 min 组，1 min 组表达最弱，见图 1。1、2、3、4、5 min 组 A 值分别为 0.030±0.001、0.046±0.004、0.034±0.002、0.039±0.004、0.032±0.001；2 min 组明显高于其他各组，比较差异有统计学意义（P<0.05）；1 min 组低于 3、4、5 min 组，比较差异有统计学意义（P<0.05）；3、4、5 min 组间差异无统计学意义（P>0.05）。

图 1.

图 1

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Fluorescence microscope observation of each group (×200)　a. 1 minute group;  b. 2 minutes group;  c. 3 minutes group;  d. 4 minutes group;  e. 5 minutes group

各组荧光显微镜观察（×200）　a. 1 min组；b. 2 min组；c. 3 min组；d. 4 min组；e. 5 min组

2.4. 组织学观察

1 min 组及 2 min 组组织稍水肿，可见少量炎性细胞浸润，未见细胞溶解、核碎裂及炎性细胞吞噬等肌细胞坏死现象。3 min 组及 4 min 组组织明显水肿，可见较多炎性细胞浸润，偶见肌细胞被炎性细胞吞噬。5 min 组组织水肿程度和 3、4 min 组相似，但肌纤维减少，结缔组织增生，可见到更多炎性细胞浸润及肌细胞被炎性细胞吞噬。见图 2。

图 2.

图 2

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Histological observation of each group (HE×200)　a. 1 minute group;  b. 2 minutes group;  c. 3 minutes group;  d. 4 minutes group; e. 5 minutes group

各组组织学观察（HE×200）　a. 1 min组；b. 2 min组；c. 3 min组；d. 4 min组；e. 5 min组

2.5. 透射电镜观察

1 min 组小部分肌细胞呈损伤后修复状态，肌丝排列尚整齐，可见肌丝间隙增宽，线粒体形态基本正常，偶见肌浆网呈空泡状肿胀。2 min 组和 1 min 组表现相似，但可见少量线粒体略肿胀。3 min 组更多肌细胞呈变性后修复状态，肌丝排列尚整齐，肌丝间隙宽，肌质网、线粒体等细胞器肿胀程度较 2 min 组明显，偶见线粒体嵴消失。4、5 min 组肌丝排列紊乱，可见肌丝溶解、肌丝间隙增宽，肌质网、线粒体肿胀。见图 3。

图 3.

图 3

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Transmission electron microscope observation of each group (×1 500)　a. 1 minute group;  b. 2 minutes group;  c. 3 minutes group;  d. 4 minutes group;  e. 5 minutes group

各组透射电镜观察（×1 500）　a. 1 min组；b. 2 min组；c. 3 min组；d. 4 min组；e. 5 min组

3. 讨论

超声微泡转基因技术作为一种非病毒载体可将目的基因转染至多种组织及细胞[11-14]。骨缺损部位存在组织破坏与修复，针对这样的组织给予一定强度、不同时间的超声辐照促进微泡破碎，是否能促进基因的有效转染与表达，或是否加重骨缺损部位的组织损害，是采用 BMP-2 等相关成骨基因转染治疗骨缺损研究中必须考虑的问题。

基因转染效率和超声总能量相关，即超声强度、辐照时间、占空比都是转染效率的影响因素[9, 17, 20]。有研究表明，随着辐照时间延长，细胞基因转染率升高，但同时细胞成活率降低[11, 17-18, 20]。但也有研究表明，在促进目的基因有效转染的条件下，无目前可探测的损伤[9, 21]。不同研究间的矛盾可能是由于超声参数、动物年龄、动物种类及靶器官的差异所造成的。Qiu 等[9] 在研究超声微泡转基因技术促 EGFP 基因在兔跟腱组织转染的实验中，使用的占空比与我们实验相同，但辐照时间更长，超声强度更高，也未发现细胞损伤。Delalande 等[19] 使用超声微泡转基因技术促进基因在小鼠跟腱的表达，结果显示在频率 1 MHz、占空比 40% 的条件下，辐照 10 min 可以安全无毒促进基因转染与表达。

本实验显示，接受不同时间超声辐照后，各组兔骨缺损部位均观察到组织损伤。随着超声辐照时间的增加，骨缺损处软组织的炎性反应逐渐加重。其损伤可能既包括手术造模引起的破坏，也包括超声辐照微泡破碎造成的组织细胞损害。由于各组除辐照时间外实验条件相同，可以认为组间破坏程度的逐渐加重与辐照时间延长直接相关。

超声微泡转基因技术促基因转染的主要原理是微泡在超声辐照下产生空化效应，使细胞膜通透性可逆性地增加，从而增强微泡对基因的转移[10, 22]。本实验中虽然超声辐照时间为 2 min 时，组织细胞损伤较 1 min 时明显，但其最终获得的目的基因表达强度却最强，超声辐照时间为 3、4、5 min 时目的基因表达无统计学差异。究其原因，可能是 2 min 辐照时间所产生的能量恰好使足够多的微泡产生空化效应，从而使目的基因最大量的进入靶细胞。当辐照时间不足 2 min 时，可能不足以使足够多的微泡产生空化效应，因而进入细胞内的目的基因数量较前者减少。而辐照时间超过 2 min 时，虽然进入细胞的基因已达到阈值，但随着辐照时间的延长，过强的能量给组织带来的损伤逐渐加重，从而影响靶细胞的基因表达。

总之，利用超声微泡转基因技术促 EGFP 在兔尺骨骨缺损处表达时，超声微泡破碎会给组织带来一定损伤，并且损伤的程度随着超声辐照时间的延长而加重，而目的基因表达强度不因此而依次增强。考虑到组织损伤低水平而基因转染效能最强化的要求，兔骨缺损活体超声微泡破碎技术转基因实验研究中，在合适的辐射强度等实验条件下，宜选择 2 min 辐照时间。在后续实验中我们将进一步筛选最适的辐照强度及占空比等超声参数，并在此基础上利用超声微泡转基因技术促 BMP-2 基因在兔骨缺损处转染，从而诱导骨再生，以期为临床骨缺损修复提供新的思路。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（81071475）

National Natural Science Foundation of China (81071475)

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