载柚皮苷复合支架对兔骨软骨缺损修复的实验研究

Abstract

目的

探讨载柚皮苷复合支架的性能及其对兔骨软骨缺损修复的效果。

方法

利用 W/O/W 方法制备载柚皮苷和无载柚皮苷缓释微球；以凹凸棒石和 Ⅰ 型胶原蛋白为材料，通过“3 层夹心法”分别构建载柚皮苷、无载柚皮苷和载 TGF-β₁ 复合支架。分别利用体外缓释、扫描电镜和细胞计数试剂盒 8 法评价载柚皮苷微球的缓释效果、支架的形貌和细胞相容性。取 40 只日本大耳白兔随机分为 A、B、C、D 4 组，每组 10 只。于兔双侧股骨髁间窝处制备直径 4.5 mm、深 4 mm 的骨软骨缺损模型，A 组为缺损组（空白对照），B、C、D 组分别于骨软骨缺损处植入无载柚皮苷复合支架（阴性对照组）、载柚皮苷复合支架（实验组）及载 TGF-β₁ 复合支架（阳性对照组）。分别于术后 3、6 个月时取材，行大体、HE 染色、甲苯胺蓝染色，分别观察骨软骨缺损修复效果；Western blot 检测新生软骨 Ⅱ 型胶原蛋白表达水平。

结果

载柚皮苷微球具有良好的缓释效果；构建的骨软骨复合支架有较好的孔隙；载柚皮苷软骨层支架细胞的增殖率与无载柚皮苷支架比较明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。兔体内植入实验大体观察示，术后 3 个月 C、D 组缺损范围与 A、B 组相比明显缩小；术后 6 个月 C 组缺损处被新生软骨所覆盖，D 组新生软骨与周围正常软骨整合良好。组织学染色示，术后 3 个月 A、B 组缺损处被少量纤维组织填充，C、D 组可见少量软骨生成；术后 6 个月 C、D 组新生骨软骨组织与正常骨软骨类似，A、B 组缺损处以大量纤维组织为主。Western blot 检测示，术后 3、6 个月 C、D 组缺损处新生组织中 Ⅱ 型胶原蛋白表达量均显著高于 A、B 组，差异有统计学意义（P<0.05）；C、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

结论

载柚皮苷复合支架具有良好的组织相容性，并对兔关节骨软骨缺损有较好的修复效果。

骨软骨损伤临床十分常见，通常直径>4 mm 的软骨损伤不能自行修复^[1-2]，对患者的身心健康造成严重影响。组织工程技术的出现为骨软骨损伤修复和功能恢复带来希望。单层支架往往不能满足骨和软骨两种不同组织生长所需的细胞外环境，限制了其在骨软骨组织工程中的广泛应用^[3]。目前构建双层或多层复合支架用于修复骨软骨损伤成为骨软骨组织工程研究的热点之一。同时，有关复合生长因子的支架对骨软骨损伤的研究较多，且有较好的修复效果^[4-6]，但生长因子价格昂贵，临床应用也有限。传统中药骨碎补单体成分柚皮苷具有促进软骨细胞生长和增殖的作用^[7-8]，将其用于组织工程支架中修复骨软骨损伤，是一种新的创新和尝试。本实验利用柚皮苷作为缓释药物与胶原蛋白复合构建软骨层支架，凹凸棒石与胶原蛋白复合构建骨层支架，通过胶原蛋白将两者黏接成骨软骨 3 层复合支架，采用相应方法综合评价药物的缓释效果、支架表征及其对兔骨软骨缺损的修复效果，旨在为临床修复骨软骨缺损提供一种新型仿生复合支架。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及主要试剂、仪器

清洁级成年雄性日本大耳白兔 40 只，体质量 2.0～2.5 kg，由中国农科院兰州兽医研究所提供。

BMSCs（ATCC 公司，美国）；柚皮苷（Aladdin 公司，美国）；凹凸棒石（中科院兰州物理化学研究所）；聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]、TGF-β₁（Sigma 公司，美国）；Ⅰ 型胶原（猪皮中提取）由本实验室自制；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）（上海东仁化学科技有限公司）；甲苯胺蓝软骨染色液（北京雷根生物技术有限公司）；Ⅱ 型胶原小鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG（Abcom 公司，英国）。紫外分光光度仪（HP 公司，美国）；酶标仪（美国伯爵仪器有限公司）；冷冻干燥机（中国军事医学科学院实验仪器厂）；JSM-5600LV 低真空型扫描电镜（JEOL 公司，日本）；倒置显微镜（Olympus 公司，日本）。

1.2. 复合支架的构建

1.2.1 微球制备　称取 2 mg 柚皮苷溶于 2 mL 去离子水中作内水相，取 100 mg PLGA 溶于 4 mL 二氯甲烷中作油相；将内水相逐滴加至油相，迅速于超声波 100 W 超声 30 s，使混合相（W/O）变均匀。再取 20 mL 1% 聚乙烯醇溶液作外水相，将混合相逐滴加至外水相中，同时于超声波 100 W 超声 30 s，使混合液（W/O/W）变乳白色，再转至通风橱内磁力搅拌过夜。然后以离心半径 2.5 cm、13 000 r/min 离心 10 min，取试管底部沉淀物经去离子水洗涤、同上法离心、真空冷冻干燥制得载柚皮苷微球。同时用上述方法制备无载柚皮苷微球。

1.2.2 软骨层支架构建　称取载柚皮苷微球、壳聚糖、Ⅰ 型胶原各 0.6 g，溶入 15 mL 1% 冰乙酸溶液中，搅拌混合均匀，形成乳白色混合物；将其装入直径 4.5 mm 的特制圆柱体模具中，–20℃ 冷冻使其呈圆柱体棒状物，切成 2 mm 厚的圆形薄片，冷冻干燥制得载柚皮苷微球的软骨层支架。同时用上述方法构建无载柚皮苷微球的软骨层支架，保存备用。

1.2.3 骨层支架构建　称取凹凸棒石、聚己内酯、Ⅰ 型胶原各 0.6 g，溶于 15 mL 六氟异丙醇溶液中，磁力搅拌 2 h；加入 2.5 g NaCl 作致孔剂，搅拌混合均匀；待大部分六氟异丙醇挥发后，装入直径 4.5 mm 的特制圆柱体模具中，通风橱内使其凝固成圆柱体棒状物，切成 2 mm 厚的圆形薄片，37℃ 烘箱中烘干，除尽六氟异丙醇，再经去离子水脱盐后，冷冻干燥制得骨层支架，保存备用。

1.2.4 黏接层溶液构建　取聚己内酯、Ⅰ 型胶原各 0.6 g，溶于 10 mL 六氟异丙醇溶液中，搅拌混合均匀备用。

1.2.5 复合支架构建　将构建的软骨层、骨层支架的一面分别浸渍在黏接层溶液中，数秒后取出黏贴在一起，烘箱中烘干，制得直径为 4.5 mm、厚 4 mm 的软骨层-黏接层-骨层 3 层结构的复合支架，⁶⁰Co 辐照灭菌后，4℃ 保存。

1.3. 复合支架评价

1.3.1 药物缓释测定　精确称取 500 mg 载柚皮苷微球的软骨层支架，加入 50 mL PBS 中，密封置于 37℃ 恒温平板摇床中匀速摇动，分别于 1、2、4、6、8、12、24、48、72、96 h 时取出 0.5 mL 溶液保存待测，并补回 0.5 mL PBS。待所有时间点取样完毕后，紫外分光光度仪检测其吸光度（A）值，参考文献[9]方法计算柚皮苷缓释率。

1.3.2 细胞在软骨层支架上增殖检测　向无载柚皮苷微球的软骨层支架上逐滴加入 10 ng/mL TGF-β₁ 500 μL 作为阳性对照，烘箱中静置过夜。将无载柚皮苷微球（A 组）、载柚皮苷微球（B 组）、载 TGF-β₁ 软骨层支架（C 组）分别置于 96 孔板中，每组设 4 个复孔，DMEM/F12 培养基预湿；吸取 100 μL 浓度为 5×10⁵ 个/mL 的 BMSCs 悬液接种于支架上，分别于 1、2、3、4 d 将支架转移至新孔板中，再加入 10 μL CCK-8 试剂，孵育 4 h 后，每孔吸出 80 μL 至新孔板中，于酶标仪 450 nm 处测其 A 值。

1.3.3 扫描电镜观察表面形貌　随机选取载柚皮苷微球、载柚皮苷复合支架，制样、喷金，扫描电镜观察微球的形态、大小及复合支架的微观形貌。BMSCs 在载柚皮苷软骨层支架上增殖（同 1.3.2 方法）7 d 后取出，2.5% 戊二醛固定 24 h，洗涤、干燥，扫描电镜观察细胞在软骨层支架上的黏附情况。

1.4. 兔体内植入实验观察

1.4.1 实验分组及方法　将 40 只日本大耳白兔随机分为 4 组，每组 10 只。所有实验动物采用 10% 水合氯醛耳缘静脉注射（2 mL/kg）麻醉，双膝关节部剃毛、消毒，于膝关节内侧绕髌骨作弧形纵切口，充分暴露股骨髁间窝，利用电钻于髁间窝制备直径 4.5 mm、深 4.0 mm 的骨软骨全层缺损模型。其中 A 组为缺损组（空白对照），仅制备缺损模型，不作其他处理；B、C、D 组分别于骨软骨缺损处植入无载柚皮苷复合支架（阴性对照组）、载柚皮苷复合支架（实验组）及载 TGF-β₁ 复合支架（阳性对照组）。术后每日肌肉注射青霉素 20 万 U 至术后 7 d，每日观察损伤局部有无感染及兔饮食、活动情况。

1.4.2 大体观察　术后 3、6 个月时采用空气栓塞法每组分别处死 3 只动物，取出股骨髁间窝，肉眼观察骨软骨缺损处软骨修复效果。

1.4.3 组织学染色观察　术后 3、6 个月将取出的股骨髁间窝置于 4% 甲醛中固定 3 d，10%EDTA-Na₂ 液中脱钙 30 d，常规石蜡包埋、切片，行 HE 染色及甲苯胺蓝染色，倒置显微镜下观察。

1.4.4 Western blot 法检测 Ⅱ 型胶原蛋白表达　术后 3、6 个月采用空气栓塞法每组各处死 2 只动物，取出股骨髁间窝，于原骨软骨缺损处用电环钻取出直径 5 mm 圆柱状骨软骨组织，高效 RIPA 组织裂解液裂解，提取总蛋白，用 BCA 试剂对总蛋白进行定量；然后加上样缓冲液，煮沸 10 min，采用 SDS-PAGE 凝胶分离电泳，转硝酸纤维素膜上，封闭液封闭 2 h，用 Ⅱ 型胶原小鼠单克隆抗体（1∶400）室温孵育过夜，TBST 清洗，辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠 IgG（1∶10 000）室温孵育 2 h，TBST 清洗，ECL 显色，曝光。采用 Image-pro plus 软件计算各条带的 A 值，将与内参 β-actin 测定 A 值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.5. 统计学方法

采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. 复合支架相关观测

2.1.1 药物缓释测定　6 h 前载柚皮苷微球的软骨层支架中柚皮苷释放率迅速增加，出现突释现象，释放率达到 4.27%；12 h 后释放率趋于缓释水平，平均释放率为 4.39%。见图 1。

图 1.

Release curve of naringin

柚皮苷释放曲线

2.1.2 细胞在软骨层支架上增殖检测　CCK-8 法检测示，2～4 d 时 B、C 组促细胞增殖率显著高于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 2。

图 2.

Proliferation of BMSCs on each cartilage layer scaffold by cell countin kit 8

CCK-8 法检测 BMSCs 在各软骨层支架上的增殖情况

2.1.3 微球及复合支架表面特征观察　肉眼观察复合支架呈白色圆柱状，直径 4.5 mm，厚 4 mm，其中软骨层支架厚 2 mm，骨层支架厚 2 mm。见图 3。扫描电镜观察示微球表面光滑，大小均一，平均粒径 4.5 μm（图 4a）。复合支架结构分层明显，软骨层支架与骨层支架黏接处紧密相连；软骨层支架呈多孔片层结构，排列无规则且相互连通，微球均匀分散于软骨层支架中；骨层支架结构致密，有大小不等的孔径相通，孔径 200～300 μm（图 4b～d）。细胞呈扁平或多角不规则形黏附于软骨层支架内，有些细胞相互接触、聚集成片（图 4e）。

图 3.

General observation of composite scaffolds

复合支架大体观察

图 4.

Scanning electron microscope observation　a. Microspheres (×5 000); b. Composite scaffold (×35); c. Cartilage layer scaffold (×1 000); d. Bone layer scaffold (×50); e. Cells adhesion on the surface of cartilage layer scaffold (×500)

扫描电镜观察　a. 微球（×5 000）；b. 复合支架（×35）；c. 软骨层支架（×1 000）；d. 骨层支架（×50）；e. 软骨层支架表面细胞黏附情况（×500）

2.2. 兔体内植入实验观察

2.2.1 一般情况观察　术后 1 d 所有兔饮食恢复正常，无骨折脱位，无化脓、感染等，术后 7 d 创口愈合良好，活动自如。

2.2.2 缺损处大体观察　术后 3 个月各组均可见大小不等的软骨缺损，C、D 组缺损范围与 A、B 组相比明显缩小。术后 6 个月，A 组缺损处有大量结缔组织填充，边界仍清晰可见，缺损直径约 4 mm；B 组缺损处被少量新生软骨组织和大量结缔组织覆盖；C 组缺损处被平滑的新生软骨完全覆盖，且新生软骨与周围正常软骨融合；D 组新生软骨表面光滑，与周围正常软骨平齐，C、D 组新生软骨组织接近于正常软骨组织。见图 5。

图 5.

General observation of each group at each time point after repair　Arrow indicated osteochondral defects From left to right for groups A, B, C, and D respectively a. At 3 months after repair; b. At 6 months after repair

术后各时间点各组大体观察　箭头示骨软骨缺损处　从左至右分别为 A、B、C、D 组　a. 术后 3 个月；b. 术后 6 个月

2.2.3 组织学观察　术后 3 个月内复合支架已完全降解。HE 染色及甲苯胺蓝染色示，术后 3 个月，A、B 组可见缺损仍明显，缺损处被少量纤维组织填充；C、D 组可见厚薄不均的少量透明软骨生成，软骨表面有大小不一的裂隙，软骨细胞排列杂乱无规则，软骨下骨由少许骨痂组成。术后 6 个月，A、B 组可见缺损尚未修复，缺损处以大量纤维组织为主；C、D 组新生软骨细胞呈圆形或椭圆形，排列密集，可见软骨下有大量骨细胞成扁椭圆形排列。术后 3、6 个月 C 组缺损处新生骨软骨组织与 D 组类似。见图 6、7。

图 6.

HE staining observation of each group at each time point after repair　Yellow arrow indicated fibrous tissue, and black arrow indicated new cartilage a. Group A at 3 months (×40); b. Group B at 3 months (×40); c. Group C at 3 months (×100); d. Group D at 3 months (×100); e. Group A at 6 months (×40); f. Group B at 6 months (×40); g. Group C at 6 months (×100); h. Group D at 6 months (×100)

术后各时间点各组 HE 染色观察　黄箭头示纤维组织，黑箭头示新生软骨　a. 术后 3 个月 A 组（×40）；b. 术后 3 个月 B 组（×40）；c. 术后 3 个月 C 组（×100）；d. 术后 3 个月 D 组（×100）；e. 术后 6 个月 A 组（×40）；f. 术后 6 个月 B 组（×40）；g. 术后 6 个月 C 组（×100）；h. 术后 6 个月 D 组（×100）

图 7.

Toluidine blue staining observation of each group at each time point after repair　Yellow arrow indicated fibrous tissue, and black arrow indicated new cartilage a. Group A at 3 months (×40); b. Group B at 3 months (×40); c. Group C at 3 months (×100); d. Group D at 3 months (×100); e. Group A at 6 months (×40); f. Group B at 6 months (×40); g. Group C at 6 months (×100); h. Group D at 6 months (×100)

术后各时间点各组甲苯胺蓝染色观察　黄箭头示纤维组织，黑箭头示新生软骨　a. 术后 3 个月 A 组（×40）；b. 术后 3 个月 B 组（×40）；c. 术后 3 个月 C 组（×100）；d. 术后 3 个月 D 组（×100）；e. 术后 6 个月 A 组（×40）；f. 术后 6 个月 B 组（×40）；g. 术后 6 个月 C 组（×100）；h. 术后 6 个月 D 组（×100）

2.2.4 Western blot 法检测 Ⅱ 型胶原蛋白表达　术后 3、6 个月，C、D 组缺损处新生组织中 Ⅱ 型胶原蛋白表达量均显著高于 A、B 组，差异有统计学意义（P<0.05）；C、D 组间差异无统计学意义（P>0.05）。术后 6 个月 C、D 组缺损处新生组织中 Ⅱ 型胶原蛋白表达量显著高于术后 3 个月时，差异有统计学意义（P<0.01）。见图 8。

图 8.

Expression of collagen type II of each group at each time point after repair　a. Electrophoretic pattern at 3 months after repair 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D; b. Electrophoretic pattern at 6 months after repair 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D; c. Relative expression of collagen type II

术后各时间点各组 Western blot 检测Ⅱ型胶原表达a. 术后 3 个月蛋白印迹图 1: A 组 2: B 组 3: C 组 4: D 组；b. 术后 6 个月蛋白印迹图 1: A 组 2: B 组 3: C 组 4: D 组；c. Ⅱ 型胶原蛋白相对表达量

3. 讨论

目前针对骨软骨组织损伤的治疗虽取得一定进展，但临床疗效仍不确切。传统的保守疗法、自体或异体骨软骨移植术均存在治疗效果不佳、来源有限和潜在的异源性疾病感染等缺陷^[10]，无法满足骨软骨损伤患者的治疗需求。单层软骨支架存在机械强度不足、支架与软骨下骨界面耦合欠佳等缺陷^[11-12]。双层或多层复合支架以其独特优势被广泛用于组织工程骨软骨支架研究中。林建华等^[13]研究发现构建的胶原-壳聚糖/胶原-纳米羟基磷灰石仿生复合支架无细胞毒性、急性全身毒性，骨植入实验显示该复合支架具有良好的生物相容性。Da 等^[14]研究将胶原蛋白包裹 PLGA/β-磷酸三钙作为骨支架、牛关节软骨细胞外基质通过加工作为软骨支架，再将两者融合构建成骨软骨复合支架，发现其对兔骨软骨缺损有较好的修复效果。本实验结果显示，用“3 层夹心法”构建的凹凸棒石/胶原蛋白/柚皮苷骨软骨复合支架具有良好的加工和成型特点、较高的孔隙率、良好的生物相容性和促细胞增殖作用，载柚皮苷微球也具有良好的药物缓释效果。

柚皮苷是中药骨碎补的主要活性物质之一，为二氢黄酮类化合物^[15]。有研究发现柚皮苷可促进软骨细胞增殖，显著提高过氧化物歧化酶活性，降低一氧化氮合成酶活性，保护软骨细胞免受细胞因子的损伤^[7]。苏友新等^[8]研究发现柚皮苷可抑制小窝蛋白 1（caveolin-1）、磷酸化 p38 和磷酸化核转录因子-2 蛋白的表达，抑制 caveolin-p38 MAPK 信号通路，进一步降低 IL-1β 和 TNF-α mRNA 在 caveolin-p38 MAPK 信号通路的下游表达，进而起到保护软骨细胞的作用。柚皮苷对软骨组织和软骨细胞的保护作用可能还与抑制 NF-κB 信号通路相关^[16]。凹凸棒石是一种具有链层状结构的含水富镁铝硅酸盐的白色黏土矿物，呈土状，质地细腻，有油脂滑感，吸水性强，含有不定量的 Na⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Al³⁺ 等^[17]。因其具有纳米结构，比表面积大，可形成通道易于细胞生长和组织形成等特点，本课题组率先利用凹凸棒石作为骨支架进行了大量研究。张晓敏等^[18-19]研究发现凹凸棒石/胶原骨支架能促进细胞增殖及其成骨相关基因 Osterix、Ⅰ 型胶原、骨桥蛋白、ALP 等的表达，并对兔桡骨缺损具有较好的修复效果，显示出了该支架具有良好的生物相容性和骨诱导性。本实验利用柚皮苷和凹凸棒石促进软骨和骨细胞增殖的特点来构建骨软骨复合支架，并以具有显著促软骨生长作用的 TGF-β₁^[20-21]作为阳性对照，研究其对骨软骨缺损的修复效果。

术后大体观察、组织学染色结果均显示，术后 6 个月时，载柚皮苷复合支架组和载 TGF-β₁ 复合支架组对软骨损伤的修复效果明显好于无载柚皮苷复合支架组，其中载柚皮苷复合支架组与载 TGF-β₁ 复合支架组对骨软骨损伤的修复效果类似；同时软骨下骨有大量新生骨形成，表明以凹凸棒石/胶原蛋白构建的支架能促进骨形成，这与本课题组前期研究报道^[18-19]一致。利用 Western blot 检测缺损处新生软骨中 Ⅱ 型胶原表达，同样证明了组织学的上述结果，即在软骨修复过程中载柚皮苷复合支架组和载 TGF-β₁ 复合支架组 Ⅱ 型胶原蛋白的表达显著上调，其中术后 6 个月 Ⅱ 型胶原蛋白的表达水平明显高于术后 3 个月。以上结果提示，利用柚皮苷替代生长因子 TGF-β₁ 能促进软骨的再生和修复，具有与生长因子类似的效果。选择类似于柚皮苷的中药单体作为促进软骨生长和修复的诱导分子，具有价格低廉、不易失活和易于保存等优点，将其与组织工程技术有机结合具有一定创新性和临床应用价值。

综上述，本实验构建的凹凸棒石/胶原蛋白/柚皮苷骨软骨复合支架，不仅具有良好的细胞和组织相容性，同时对骨软骨缺损有较好的修复效果，通过后续对支架制备工艺的改造和提升，有望成为一种具有自主知识产权的新型组织工程骨软骨复合支架。

Funding Statement

甘肃省科技重大专项项目（1203FKDA036）

Major Projects Funds of Science and Technology of Gansu Province (1203FKDA036)