Abstract
目的
比较大鼠骨髓来源与前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）来源的 MSCs 体外增殖及成骨、成软骨、成脂分化潜能的差异。
方法
取 SPF 级 6 周龄雄性 BN 大鼠 10 只，体质量 200～220 g，无菌条件下分别取大鼠骨髓及 ACL，贴壁法培养获取 BMSCs 与 ACL 来源 MSCs 并进行传代，倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。取生长良好的第 3 代细胞，流式细胞仪检测细胞免疫表型 CD34、CD45、CD90 和 CD29 表达；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）法检测细胞体外增殖能力，克隆形成实验检测细胞体外克隆形成能力；行成骨、成软骨及成脂体外诱导多向分化能力检测；实时荧光定量 PCR 检测成骨[ALP、骨钙蛋白、RUNX2、BMP-2、分泌性磷蛋白 1（secreted phosphoprotein 1，Spp1）]、成软骨[Ⅱ 型胶原 α1（collagen type Ⅱ α1，Col2α1）、软骨聚糖蛋白（Aggrecan，Acan）、Sox9]及成脂[过氧化物酶体增殖物激活受体 γ2（peroxisome proliferator activated receptor γ2，PPARγ2）、CCAAT/增强子结合蛋白 α]相关基因 mRNA 相对表达量。
结果
第 3 代 ACL 来源 MSCs 与 BMSCs 形态相似，均表现为贴壁生长的长梭形细胞。流式细胞仪检测示，两种细胞均表达 CD29、CD90，基本不表达 CD45 及 CD34。CCK-8 法检测示，ACL 来源 MSCs 的吸光度（A）值（1.11±0.08）显著高于 BMSCs（0.78±0.05），差异有统计学意义（t=3.599，P=0.023）；ACL 来源 MSCs 的细胞集落数[（53.00±5.51）个/孔]亦明显多于 BMSCs[（30.67±4.84）个/孔]（t=3.045，P=0.038）。经成骨、成软骨、成脂体外诱导培养 21 d 后，BMSCs 及 ACL 来源 MSCs 均表现为茜素红、甲苯胺蓝及油红 O 染色阳性。实时荧光定量 PCR 检测示，ACL 来源 MSCs 的 BMP-2、Spp1、Col2α1、Acan、Sox9 及 PPARγ2 mRNA 相对表达量显著高于 BMSCs，差异均有统计学意义（P<0.01）。
结论
ACL 来源 MSCs 比 BMSCs 具有更强的体外增殖能力，在相同体外条件下更易向软骨分化，是一种有潜力的促进腱骨愈合的种子细胞。
Keywords: BMSCs, 前交叉韧带来源 MSCs, 增殖分化, 大鼠
Abstract
Objective
To compare the biological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) and anterior cruciate ligament derived mesenchymal stem cells (ACL-MSCs) from rats in vitro.
Methods
Ten male SPF-level BN rats, weighing 200-220 g, were selected to obtain anterior cruciate ligaments and bone marrows, and ACL-MSCs and BMSCs were isolated for passage culture respectively under sterile condition. The cell morphology was observed, and the cells at passage 3 were used to detect the surface markers of CD34, CD45, CD90, and CD29 by flow cytometry, the ability of cell proliferation by cell counting kit 8 (CCK-8), and colony formation ability by clone forming test. The mRNA levels of differentiation related genes [alkaline phosphatas (ALP), bone gamma-carboxyglutamate protein, runt related transcription factor 2, bone morphogenetic protein 2 (BMP-2), secreted phosphoprotein 1 (Spp1), collagen type II α1 (Col2α1), Aggrecan (Acan), Sox9, peroxisome proliferator activated receptor γ2 (PPARγ2), and CCAAT-enhancer-binding protein-α] were also determined by real-time fluorescent quantitative PCR.
Results
BMSCs and ACL-MSCs had similar morphology, adherent cells displaying long fusiform. The immunoprofile of ACL-MSCs and BMSCs at passage 3 was positive for CD29 and CD90 and was negative for CD45 and CD34. The absorbance (A) value of ACL-MSCs (1.11±0.08) was significantly higher than that of BMSCs (0.78±0.05) (t=3.599, P=0.023); the number of colonies of ACL-MSCs [(53.00±5.51)/hole] was significantly more than that of BMSCs [(30.67±4.84)/hole] (t=3.045, P=0.038). The results of toluidine blue staining, alizarin red staining, and oil red O staining were positive in BMSCs and ACL-MSCs at 21 days after osteogenic, chondrogenic, and adipogenic induction. The mRNA expressions of BMP-2, Spp1, Col2α1, Acan, Sox9, and PPARγ2 in ACL-MSCs were significantly higher than those in BMSCs (P<0.01).
Conclusion
The proliferation potential of ACL-MSCs is greater than that of BMSCs, and the former is apt to differentiate into chondrocytes. ACL-MSCs are promising cells to promote tendon-bone healing.
Keywords: Bone marrow mesenchymal stem cells, anterior cruciate ligament derived mesenchymal stem cells, proliferation and differentiation, rat
前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）重建术后的腱骨愈合是一个缓慢而复杂的过程，对于患者膝关节功能恢复起至关重要的作用。自然的腱骨愈合过程一般持续数月，并以骨与移植肌腱之间纤维瘢痕组织的形成而结束。不同于正常ACL止点的骨-钙化的纤维软骨-纤维软骨-肌腱特殊结构，术后纤维瘢痕组织较脆弱易于断裂，并且不能起到良好的缓冲压力的作用[1-2]。因此，韧带重建术后患者在功能锻炼上会受到一定限制，最终影响膝关节功能恢复。为了促进腱骨之间生理学结构的重建，恢复其良好的生物力学特性，研究者们尝试了大量方法，如富血小板血浆、生长因子、干细胞、转基因及组织工程等[3-10]，其中 BMSCs 的应用取得了良好疗效[5-7]。BMSCs 具有增殖能力强、可多向分化、取材方便、自体来源无排斥反应、生物相容性好等优点，目前已被广泛应用于促进各种组织修复及再生领域[4-11]。在促进腱骨愈合方面也进行了大量动物实验，并且取得了积极效果。动物研究表明[5-6]，对于自体肌腱重建的 ACL，采用关节腔注射 BMSCs 或将纤维凝胶作为载体运输 BMSCs，可明显加快腱骨愈合进程，并形成类似正常止点的结构而非纤维瘢痕组织，从而促进膝关节功能恢复。
随着干细胞研究的广泛深入开展，研究者们成功地从脂肪、肌腱、滑膜等不同组织中分离提取出干细胞，并且发现不同来源的干细胞体外增殖及多向分化的潜能不同，其促进不同组织修复与再生的能力也有一定差别[15-18]。有研究者提出，损伤的 ACL 作为重建手术后的废弃物可能成为提取 MSCs 的来源，并且该韧带来源的 MSCs 可能对 ACL 重建术后的腱骨愈合具有意想不到的促进作用；因此他们进行了相关实验，并成功从 ACL 中成功分离得到 MSCs，发现该细胞同样具有体外增殖及多向分化能力[19-20]。但目前尚缺乏有关骨髓来源与 ACL 来源 MSCs 的体外生物学特性比较的明确报道。比较这两种细胞的体外增殖及分化潜能，对于未来临床促进腱骨愈合的种子细胞选择具有指导意义。因此，本研究拟体外分离、培养并鉴定大鼠骨髓与 ACL 来源的 MSCs，比较两种细胞体外增殖能力及多向分化潜能，为进一步体内实验及临床细胞治疗提供一定基础。
1. 材料与方法
1.1. 实验动物及主要试剂、仪器
SPF 级 6 周龄雄性 BN 大鼠 10 只，体质量 200～220 g，购自上海市西普尔-必凯实验动物有限公司。实验过程中对动物处置符合 2006 年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。
Ⅰ 型胶原酶、地塞米松（Sigma 公司，美国）；DMEM 培养基、FBS、胰蛋白酶（HyClone 公司，美国）；SD 大鼠 BMSCs 完全培养基（广州赛业生物科技有限公司）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）（上海七海复泰生物科技有限公司）；Trizol（Invitrogen 公司，美国）；Synergy Brands green（上海东洋纺生物科技有限公司）；细胞表面标记抗体（上海美天旎生物技术有限公司）；草酸铵结晶紫染色液（上海远慕生物科技有限公司）；RR047 反转录试剂盒（Takara 公司，日本）。
ckx41 显微镜（Olympus 公司，日本）；FACS-Calibur 流式细胞仪（Becton Dickinson 公司，美国）；ABI 7900PCR 仪、ABI Stepone Sequence Detection 软件、Stepone real-time PCR 系统（Applied Biosystems 公司，美国）；51119000Multiskan FC 酶标仪、Nanodrop2000 微量分光光度计（Thermo 公司，美国）。
1.2. 细胞分离、培养
1.2.1 ACL 来源 MSCs 分离、培养 取 10 只大鼠颈椎脱臼处死，75% 乙醇浸泡 10 min 消毒。无菌条件下仔细分离 ACL 组织，避免半月板、脂肪、血管及肌肉组织污染，PBS 洗 3 遍，充分剪碎，用无菌镊子将组织贴在培养皿中，加入 2 mL 含 10%FBS 及 50 U/mL 青霉素+50 mg/mL 链霉素的 DMEM 培养基，置入 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，每 3 天更换 1 次培养基，洗去未贴壁细胞。2 周后，细胞汇合率达 80%～90%，将细胞以 2.5 g/L 胰蛋白酶消化后，按 1∶3 比例传代培养。每天倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。取生长状态良好的第 3 代细胞用于以下观测。
1.2.2 BMSCs 分离、培养 取上述大鼠，无菌条件下获取大鼠股骨、胫骨，剔除附着肌肉，用咬骨钳咬断骨干，注射器吹吸骨髓腔，使骨髓混于 DMEM 培养基；吸取混合液，通过 200 目筛网过滤后置入 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，48 h 首次半量换液，以后每 3 天换液 1 次，每次换液时用 PBS 洗净非贴壁细胞。每天在倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长情况，待细胞汇合达 80%～90% 时用 PBS 洗涤 2 次，2.5 g/L 胰蛋白酶消化后，按 1∶3 比例传代培养。取生长状态良好的第 3 代细胞用于以下观测。
1.3. 观测指标
1.3.1 流式细胞仪检测细胞膜免疫表型 取 BMSCs 和 ACL 来源 MSCs，0.25% 胰蛋白酶消化后以细胞培养基终止消化，402×g 离心 5 min 后弃上清，沉淀物用 PBS 洗涤 2 遍，调节细胞浓度为 1×106 个/L，加入抗大鼠 CD34、CD45、CD90 和 CD29 抗体，4℃ 避光孵育 30 min，用 PBS 洗涤多余抗体后采用流式细胞仪分析。
1.3.2 CCK-8 法检测细胞体外增殖能力 取 BMSCs 和 ACL 来源 MSCs，以 5×103 个/孔接种于 96 孔板中，培养 2 d 后随机选 3 个复孔，每孔加入 10 μL CCK-8 试剂，混匀后置入 37℃ 培养箱中避光培养约 2 h 后，用酶标仪 450 nm 波长处检测吸光度（A）值，取均值。
1.3.3 细胞体外克隆形成能力 取 BMSCs 和 ACL 来源 MSCs，0.25% 胰蛋白酶消化后以 300 个/孔接种于 10 孔板中，用含 10%FBS 的 DMEM 培养基培养，每 3 天更换 1 次培养基，培养 14 d 后 PBS 冲洗 3 次，用草酸铵结晶紫染色液常温染色，随机取 3 孔，倒置相差显微镜下计数每孔内集落数（集落直径<2 mm 者忽略不计），取均值。
1.3.4 细胞多向分化能力检测 ① 成骨诱导分化：取 BMSCs 和 ACL 来源 MSCs，以 4×103 个/cm2 密度接种于 6 孔板中，完全培养基培养至细胞汇合达 90%～100%，吸弃培养液，加入成骨诱导培养基（含 10%FBS、1×10–7 mol/L 地塞米松、5×10–5 mol/L 抗坏血酸及 1×10–2 mol/L β-甘油磷酸钠的 L-DMEM 培养基），37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养，每 3 天换液 1 次，21 d 后吸弃培养液，PBS 洗涤 2 次，10% 乙醇冲洗后清水冲洗 2 次，0.5% 茜素红染色 10 min，清水洗涤 2 次后风干，倒置相差显微镜下观察钙结节。
② 成软骨诱导分化：取 5×105 个 BMSCs 和 ACL 来源 MSCs 置于 15 mL 离心管中，450 r/min 离心 10 min，置于成软骨诱导液（含 1×10–7 mol/L 地塞米松、1×10–5 mol/L 胰岛素、500 μg/L TGF-β、5×10–5 mol/L 抗坏血酸的 H-DMEM 培养基）中，37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，每 3 天换液 1 次，21 d 后石蜡包埋、切片，甲苯胺蓝染色，倒置相差显微镜观察。
③ 成脂诱导分化：取 BMSCs 和 ACL 来源 MSCs，以 5×103 个/cm2 密度接种于 6 孔板中，完全培养基培养，待细胞汇合达 90%～100% 时，吸弃培养液，加入成脂诱导培养基（含 10%FBS、1×10–6 mol/L 地塞米松、2×10–4 mol/L 吲哚美辛、5×10–4 mol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1×10–5 mol/L 胰岛素的 L-DMEM 培养基），每 3 天换液 1 次，21 d 后吸弃培养液，PBS 洗涤 2 次，室温下 0.3% 油红 O 染色 2 h，倒置相差显微镜观察红色脂滴形成情况。
1.3.5 实时荧光定量 PCR 检测分化相关基因 mRNA 表达 取 BMSCs 和 ACL 来源 MSCs，采用实时荧光定量 PCR 检测成骨[ALP、骨钙蛋白（bone gamma-carboxyglutamate protein，Bglap）、RUNX2、BMP-2、分泌性磷蛋白 1（secreted phosphoprotein 1，Spp1）]、成软骨[Ⅱ 型胶原 α1（collagen type Ⅱ α1，Col2α1）、软骨聚糖蛋白（Aggrecan，Acan）、Sox9]及成脂[过氧化物酶体增殖物激活受体 γ2（peroxi-some proli-ferator activated receptor γ2，PPARγ2）及 CCAAT/增强子结合蛋白 α（CCAAT-enhancer-bingding protein-α，CEBPα）]诱导分化特定标记物的 mRNA 表达。
具体方法：利用 Trizol 试剂提取总 RNA，每 1×106 个细胞加入 1 mL Trizol 试剂，并加入氯仿 200 μL，用力振摇 15 s，室温静置 15 min，4℃ 以 12 000×g 离心 15 min。取上层无色液体转移至新的 EP 管中，等体积异丙醇沉淀后以 75% 无水乙醇洗涤，取沉淀物加入 20 μL DEPC 水溶解，Nanodrop 微量分光光度计检测浓度。利用 RR047 反转录试剂盒为原料将总 RNA 反转录成 cDNA。用实时荧光定量 PCR仪，利用 Stepone real-time PCR 系统检测各基因表达，以 GAPDH 作为内参基因。各基因引物序列及产物长度见表 1。PCR 循环程序：95℃、10 min；95℃、5 s，60℃、1 min，45 个循环。用 ABI Stepone Sequence Detection 系统软件分析，采用 2–ΔΔCt 法分析各基因 mRNA 相对表达量。
表 1.
Primer sequences and product length for real-time fluo-rescent quantitative PCR
实时荧光定量 PCR 基因引物序列及产物长度
| 基因
Gene |
引物序列
Primer sequence |
产物长度
（bp） Product length (bp) |
| Sox9 | 上游 GAGCCGGATCTGAAGAAGGA
Upstream 下游 GCTTGACGTGTGGCTTGTTC Downstream |
151 |
| RUNX2 | 上游 TGTTCTCTGAGCGCCTCAGTG
Upstream 下游 CCTGGGATCTGTAATCTGACTCT Downstream |
146 |
| ALP | 上游 CATGTTCCTGGGAGATGGTATG
Upstream 下游 GTGTTGTACGTCTTGGAGAGAG Downstream |
144 |
| BMP-2 | 上游 CTCCAAGAGACATGTGAGGATTAG
Upstream 下游 CTCGTTTGTGGAGTGGATGT Downstream |
122 |
| Spp1 | 上游 AGGAGTTTCCCTGTTTCTGATG
Upstream 下游 GCAACTGGGATGACCTTGATA Downstream |
110 |
| Bglap | 上游 CCCTCTCTCTGCTCACTCT
Upstream 下游 GCTTGGACATGAAGGCTTTG Downstream |
105 |
| Col2α1 | 上游 CATCGAGTACCGATCACAGAAG
Upstream 下游 GCCCTATGTCCACACCAAAT Downstream |
101 |
| Acan | 上游 GGTGTCACTTCCCAACTATCC
Upstream 下游 CATCACTTCACACCGATAGA Downstream |
101 |
| CEBP/α | 上游 GTGGATAAGAACAGCAACGAGTA
Upstream 下游 TGGTCAACTCCAACACCTTC Downstream |
124 |
| PPARγ2 | 上游 CGGTTGATTTCTCCAGCATTTC
Upstream 下游 TCTTGGAGCTTCAGGTCATATTT Downstream |
103 |
| GAPDH | 上游 GGGAAACCCATCACCATCTT
Upstream 下游 ATACTCAGCACCAGCATCAC Downstream |
72 |
1.4. 统计学方法
采用 GraphPad Prism5.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2. 结果
2.1. 细胞形态学观察
倒置相差显微镜观察示，原代 BMSCs 及原代 ACL 来源 MSCs 均呈较均一的长梭形，混杂少许其他细胞，经换液、传代后细胞逐渐纯化；传至第 3 代细胞形态均一，为长梭形，螺旋状生长。见图 1。
图 1.
Morphology observation of rat BMSCs and ACL-MSCs (Inverted phase contrast microscope×100) a. Primary BMSCs; b. The 3rd passage BMSCs; c. Primary ACL-MSCs; d. The 3rd passage ACL-MSCs
大鼠 BMSCs 和 ACL 来源 MSCs 形态学观察（倒置相差显微镜×100） a. 原代 BMSCs；b. 第 3 代 BMSCs；c. 原代 ACL 来源 MSCs；d. 第 3 代 ACL 来源 MSCs
2.2. 流式细胞仪检测细胞膜免疫表型
两种细胞均表现为 CD29 及 CD90 阳性，CD34 及 CD45 阴性。见图 2。初步说明这两种细胞具有 MSCs 特性。
图 2.
Immunophenotypic characterization of rat BMSCs and ACL-MSCs by flow cytometry From left to right for CD29, CD34, CD45, and CD90 respectively a. BMSCs; b. ACL-MSCs
大鼠 BMSCs 与 ACL 来源 MSCs 细胞膜免疫表型流式细胞术检测 从左至右依次为 CD29、CD34、CD45、CD90 a. BMSCs；b. ACL 来源 MSCs
2.3. 细胞增殖能力及体外克隆形成能力检测
CCK-8 法检测示，ACL 来源 MSCs 的 A 值为 1.11±0.08，显著高于 BMSCs 的 0.78±0.05，差异有统计学意义（t=3.599，P=0.023）。ACL 来源 MSCs 的细胞集落数为（53.00±5.51）个/孔，明显多于 BMSCs 的（30.67±4.84）个/孔，差异有统计学意义（t=3.045，P=0.038）。见图 3。
图 3.
Comparison of colony formation ability of rat BMSCs and ACL-MSCs at 14 days after culture a. BMSCs; b. ACL-MSCs
培养 14 d 大鼠 BMSCs 和 ACL 来源 MSCs 克隆形成能力比较 a. BMSCs；b. ACL 来源 MSCs
2.4. 细胞多向分化能力检测
经成骨、成软骨、成脂体外诱导培养 21 d 后，BMSCs 及 ACL 来源 MSCs 均表现为茜素红、甲苯胺蓝及油红 O 染色阳性。见图 4。
图 4.
Differentiation potential of rat BMSCs and ACL-MSCs (Inverted phase contrast microscope×100) From left to right for alizarin red staining, toluidine blue staining, and oil red O staining respectively a. BMSCs; b. ACL-MSCs
大鼠 BMSCs 及 ACL 来源 MSCs 体外诱导分化鉴定（倒置相差显微镜×100） 从左至右依次为茜素红染色、甲苯胺蓝染色、油红 O 染色 a. BMSCs；b. ACL 来源 MSCs
2.5. 实时荧光定量 PCR 检测分化相关基因 mRNA 表达
成骨标记物中，ACL 来源 MSCs 的 BMP-2、Spp1 mRNA 相对表达量显著高于 BMSCs，而 BMSCs 的 ALP、Bglap、RUNX2 mRNA 相对表达量显著高于 ACL 来源 MSCs，差异均有统计学意义（P<0.01）。成软骨标记物中，ACL 来源 MSCs 的 Col2α1、Acan 及 Sox9 mRNA 相对表达量均显著高于 BMSCs，差异均有统计学意义（P<0.01）。成脂标记物中，ACL 来源 MSCs 的 PPARγ2 mRNA 相对表达量显著高于 BMSCs，而 BMSCs 的 CEBPα mRNA 相对表达量显著高于 ACL 来源 MSCs，差异均有统计学意义（P<0.01）。见表 2。
表 2.
The mRNA expressions of differentiation related genes by real-time fluorescent quantitative PCR (n=10,
)
实时荧光定量 PCR 检测两种细胞分化相关基因 mRNA 表达（n=10，
）
| 细胞
Cells |
BMP-2 | Spp1 | ALP | Bglap | RUNX2 | Col2α1 | Acan | Sox9 | PPARγ2 | CEBPα |
| BMSCs | 0.007 32±
0.000 70 |
0.058 24±
0.002 14 |
0.159 90±
0.006 17 |
0.001 18±
0.000 20 |
0.026 76±
0.001 89 |
0.000 11±
0.000 04 |
0.003 67±
0.000 43 |
0.004 26±
0.000 08 |
0.013 24±
0.000 16 |
0.022 45±
0.000 44 |
| ACL 来源
MSCs ACL-MSCs |
0.013 84±
0.000 19 |
0.422 30±
0.004 23 |
0.002 07±
0.000 31 |
0.000 27±
0.000 03 |
0.001 71±
0.000 04 |
0.208 00±
0.017 01 |
0.013 00±
0.001 24 |
0.005 07±
0.000 13 |
0.028 11±
0.000 28 |
0.006 34±
0.000 66 |
| 统计值
Statistic |
t=9.035
P=0.001 |
t=76.850
P= 0.000 |
t=25.550
P= 0.000 |
t=4.463
P=0.011 |
t=13.290
P= 0.000 |
t=12.220
P= 0.000 |
t=7.129
P=0.002 |
t=5.225
P=0.006 |
t=46.200
P= 0.000 |
t=20.490
P= 0.000 |
3. 讨论
MSCs 因其良好的再生、增殖及多向分化潜能，目前已被广泛研究并应用于组织工程和细胞疗法中[11-14]。从早期的 BMSCs、胚胎干细胞到后来的肌腱、脂肪甚至韧带等来源的干细胞，越来越多不同组织来源干细胞进入研究者们的视野。大量动物实验证明这些来源于不同组织的 MSCs 在体外增殖及多向分化潜能上有所差异[15-19]，这种差异导致其应用于不同组织修复与再生的效果不同。ACL 来源 MSCs 由于发现相对较晚[19-20]，关于其生物学特性的相关研究尚不完善，其体外增殖、细胞表型及多向分化潜能尚存在争议[21-25]。因此，本研究拟分离、培养并鉴定 ACL 来源 MSCs 及 BMSCs，比较两种细胞的体外细胞膜表型、增殖及多向分化潜能，为进一步临床应用提供依据。
3.1. 细胞形态及体外增殖潜能
从形态学上看，原代的两种细胞主要以长梭形为主，混杂有少许其他形状细胞，考虑为培养过程中受到其他细胞污染所致。通过传代、纯化后，第 3 代两种细胞开始表现出均一的长梭形，细胞形态基本一致，均符合 MSCs 的形态学特征[26]。该实验结果与目前已知的国内外相关研究结果基本相符[19-25]。
对于 ACL 来源 MSCs 与 BMSCs 的体外增殖潜能比较，研究者们目前尚无统一意见。根据 Cheng 等[22, 24]的研究结果显示，ACL 来源 MSCs 具有比 BMSCs 更强的体外增殖潜力；而Steinert 等[21]的研究则相反，认为 BMSCs 在体外增殖方面表现更好。根据本实验结果，ACL 来源 MSCs 表现出比 BMSCs 更优良的体外增殖特性，在临床及实验应用方面更具有优势。该研究结果的差异可能与细胞分离、培养及传代方法不同有关。
3.2. 细胞膜免疫表型
根据目前已知国内外的文献报道，BMSCs 与 ACL 来源 MSCs 作为一种非造血的 MSCs，其细胞表型应具有 MSCs 的特性，即表达 CD29、CD90、CD105 等非造血干细胞标记物，不表达 CD45、CD34 造血干细胞标记物[19, 21-22, 25, 27-28]。本实验应用流式细胞学技术检测第 3 代 ACL 来源 MSCs 及 BMSCs 表面抗原 CD29、CD34、CD45 和 CD90 的表达，结果表明两种细胞高表达 CD29、CD90，极低表达 CD45 与 CD34，与文献报道基本一致，可初步鉴定分离细胞为 MSCs。目前，有研究报道在受损的人 ACL 中存在丰富的 CD34+、CD45–血管干细胞，该发现与本实验及其他相关研究报道有差别[29-31]，考虑可能与取材对象、受伤时间及取材部位有关。本研究所用 ACL 由切断大鼠韧带止点获得，并且切断后立即使用，而其他研究可能使用来源于人体的断裂韧带残端，且受伤有一定时间导致受伤组织出现血管化，因而存在 CD34+干细胞，该结论需进一步研究证明。
3.3. 体外多向分化潜能
由于目前国际上对于体外分离培养 MSCs 的鉴定主要根据其细胞形态、贴壁生长特性、细胞表型及体外诱导多向分化的能力[26]，因此本实验在观察细胞形态及鉴定细胞表型的基础上，进一步进行体外诱导多向分化来鉴定 MSCs。结果表明，经 21 d 体外诱导分化后，BMSCs 和 ACL 来源 MSCs 均可成骨、成脂、成软骨分化，提示从 ACL 组织和骨髓组织中分离出来的细胞符合 MSCs 国际定义标准。
多向分化潜能是 MSCs 可用于组织修复与再生的基础，根据不同分化潜能选择性地应用种子细胞有利于促进组织的修复与再生。ACL 来源 MSCs 作为一种最近发现的 MSCs，其体外多向分化特性还存在一定争议。Ghebes 等[23]的研究表明，ACL 来源 MSCs 向软骨细胞及脂肪细胞分化的潜能比肌腱 MSCs 高。而 Cheng 等[24]的研究则比较了 BMSCs 与 ACL 来源 MSCs 的体外多向分化潜能，表明 BMSCs 在成骨分化潜能上强于 ACL 来源 MSCs，而成软骨或成脂分化则无明显差别。Steinert 等[21]的研究又得出了不同结果，他认为 BMSCs 比 ACL 来源 MSCs 具有更强的成软骨分化能力，而在成骨分化能力上与 ACL 来源 MSCs 无明显差别。由此可见，目前研究者们对于 ACL 来源 MSCs 的体外多向分化潜能尚未达成共识。本实验从基因水平上比较了 ACL 来源 MSCs 和 BMSCs 体外多向分化潜能的差异。结果表明，ACL 来源 MSCs 的体外成软骨分化相关基因（Colα1、Sox9 和 Acan）表达水平明显高于 BMSCs（P<0.01），说明 ACL 来源 MSCs 在体外条件下具有更强的成软骨分化潜能，在相同条件下更容易成软骨分化。
不同细胞来源甚至不同培养环境来源的 MSCs 在表型、细胞内的成分如 RNA 和蛋白以及功能方面有差异[15-19]。细胞的增殖及分化过程是一个多种因素共同作用的过程，与细胞内的蛋白及 miRNA 等分子的调控有密切关系[32-34]。因此，我们推测该研究中涉及到的两种来源 MSCs 在体外增殖及分化潜能上的差异主要由于不同的细胞表型及成分导致。该结果也提示我们分析不同来源的 MSCs 表型及成分有利于深入了解细胞增殖及分化机制，对于再生医学领域种子细胞的选择有指导意义。
综上述，ACL 来源 MSCs 和 BMSCs 都具有 MSCs 的某些生物学共性，但也表现出一定差异，即 ACL 来源 MSCs 具有更强的体外增殖能力，表达更高水平的成软骨分化标记基因，更易于分化为软骨细胞。因此，ACL 来源 MSCs 是一种促进交叉韧带术后腱骨愈合以及进行软骨修复非常有前景的细胞。但本研究也存在一些局限性：① 虽然将取材于相同大鼠的 ACL 来源 MSCs 和 BMSCs 进行比较，避免了因细胞来源及内在原因导致的误差，但在对两种细胞进行表型分析时，仅挑选公认的 MSCs 特异性表型进行分析，未充分全面分析两种细胞的表型。② 在进行细胞体外多向分化能力比较时，仅进行了基因水平的比较，缺乏免疫组织化学相关的比较。③ 关于 ACL 来源 MSCs 及 BMSCs 的增殖及诱导分化能力的比较均在体外条件下进行，结果具有一定局限性。因此，未来我们将进一步全面分析两种细胞的表型，同时尽可能进行细胞成分分析，以明确影响增殖及分化的原因；对两种细胞体外分化潜能进行组织染色、定量分析，比较两种细胞体外分化潜能；另外，进行相关的动物体内实验，探索两种细胞对于促进腱骨愈合的疗效差异。
Funding Statement
南京市卫生局科技基金项目（790000031）；国家自然科学基金资助项目（81672159）
Science and Technology Foundation Project of Nanjing Public Health Bureau (7990000031); National Natural Science Foundation of China (81672159)
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