Abstract
目的
探讨不同机械牵伸条件对肌腱干细胞（tendon stem cells，TSCs）分化的影响，寻求 TSCs 成肌腱分化、成骨分化以及成脂肪分化的最佳单轴循环牵伸载荷。
方法
取 8 周龄雄性 SD 大鼠跟腱，采用酶消化法分离培养 TSCs。取第 3 代 TSCs，随机分为不同牵拉条件组（实验组 A～D 组）及静态培养组（对照组 E 组），其中 A 组牵拉强度 4%、频率 1 Hz，B 组牵拉强度 4%、频率 2 Hz，C 组牵拉强度 8%、频率 1 Hz，D 组牵拉强度 8%、频率 2 Hz。利用课题组自行研发的体外细胞单轴循环牵拉设备，沿培养皿长轴对 A～D 组细胞进行单轴循环机械牵伸，E 组细胞行静态培养。分别处理 12、24、48 h 后收集各组细胞，采用实时荧光定量 PCR 检测成腱分化相关基因 Scleraxis（SCX）、抗细胞黏合素 C（Tenascin C，TNC），成脂肪分化相关基因 CCAAT/增强子结合蛋白-α（CCAAT-enhancer-binding protein-α，CEBPα）、脂蛋白脂肪酶（lipoprteinlipase，LPL）及成骨分化相关基因 RUNX2、远端缺失基因 5（distal-less homeobox 5，DLX5）的表达；Western blot 检测 TNC、CEBPα 及 RUNX2 蛋白表达。
结果
实时荧光定量 PCR 检测示：SCX、TNC mRNA 相对表达量在 B 组牵拉 24 h 时显著高于其余各组，差异有统计学意义（P<0.05）；CEBPα、LPL mRNA 相对表达量在 D 组牵拉 48 h 时显著高于其余各组，差异有统计学意义（P<0.05）；RUNX2、DLX5 mRNA 相对表达量在 C 组牵拉 24 h 时显著高于其余各组，差异有统计学意义（P<0.05）。Western blot 检测示：B 组牵拉各时间点 TNC 蛋白表达均高于 E 组（P<0.05），同时牵拉 24 h 与 E 组相比 CEBPα 表达有显著抑制作用（P<0.05）；C 组牵拉 24 h RUNX2 蛋白表达显著高于 E 组（P<0.05），同时牵拉 24、48 h TNC 蛋白表达显著低于 E 组（P<0.05）；D 组牵拉 48 h CEBPα 蛋白表达显著高于 E 组（P<0.05），TNC 蛋白表达显著低于 E 组（P<0.05），RUNX2 蛋白表达与 E 组比较差异无统计学意义（P>0.05）。
结论
机械力学刺激可以促进 TSCs 发生分化，而且不同条件的牵拉载荷会引起不同方向分化。4%、2 Hz 牵拉 24 h 为成腱分化最佳条件，8%、1 Hz 牵拉 24 h 为成骨分化最佳条件，8%、2 Hz 牵拉 48 h 为成脂肪分化最佳条件。
Keywords: 机械牵拉, 肌腱干细胞, 分化, 大鼠
Abstract
Objective
To investigate the effects of different mechanical stretch conditions on the differentiation of rat tendon stem cells (TSCs), to find the best uniaxial cyclic stretching for TSCs tenogenic differentiation, osteogenic differentiation, and adipogenic differentiation.
Methods
TSCs were isolated from the Achilles tendons of 8-week-old male Sprague Dawley rats by enzymatic digestion method and cultured. The TSCs at passage 3 were randomly divided into 5 groups: group A (stretch strength of 4% and frequency of 1 Hz), group B (stretch strength of 4% and frequency of 2 Hz), group C (stretch strength of 8% and frequency of 1 Hz), group D (stretch strength of 8% and frequency of 2 Hz), and group E (static culture). At 12, 24, and 48 hours after mechanical stretch, the mRNA expressions of the tenogenic differentiation related genes [Scleraxis (SCX) and Tenascin C (TNC)], the osteogenic differentiation related genes [runt related transcription factor 2 (RUNX2) and distal-less homeobox 5 (DLX5)], and the adipogenic differentiation related genes [CCAAT-enhancer-binding protein-α (CEBPα) and lipoprteinlipase (LPL)] were detected by real-time fluorescent quantitative PCR and the protein expressions of TNC, CEBPα, and RUNX2 were detected by Western blot.
Results
The mRNA expressions of SCX and TNC in group B were significantly higher than those in groups A, C, D, and E at 24 hours after mechanical stretch (P<0.05). The mRNA expressions of CEBPα and LPL in group D were significantly higher than those in groups A, B, C, and E at 48 hours after mechanical stretch (P<0.05). The mRNA expressions of RUNX2 and DLX5 in group C were significantly higher than those in groups A, B, D, and E at 24 hours after mechanical stretch (P<0.05). Western blot detection showed that higher protein expression of TNC in group B than group E at each time point after mechanical stretch (P<0.05), and the protein expression of CEBPα was significantly inhibited when compared with group E at 24 hours after mechanical stretch (P<0.05). At 24 hours after mechanical stretch, the protein expression of RUNX2 in group C was significantly higher than that in group E (P<0.05); and the protein expression of TNC was significantly lower than that in group E at 24 and 48 hours after mechanical stretch (P<0.05). At 48 hours after mechanical stretch, the protein expression of CEBPα was significantly increased and the protein expression of TNC was significantly decreased in group D when compared with group E (P<0.05), but no significant difference was found in the protein expression of RUNX2 between groups D and E (P>0.05).
Conclusion
The mechanical strain could promote differentiation of TSCs, and different parameter of stretch will lead to different differentiation. The best stretch condition for tenogenic differentiation is 4% strength and 2 Hz frequency for 24 hours; the best stretch condition for osteogenic differentiation is 8% strength and 1 Hz frequency for 24 hours; and the best stretch condition for adipogenic differentiation is 8% strength and 2 Hz frequency for 48 hours.
Keywords: Mechanical stretch, tendon stem cells, differentiation, rat
肌腱病是临床常见的慢性运动损伤性疾病之一，以疼痛、局部肿胀、病变区域肌张力减低、功能障碍为主要表现。肌腱病发病率高，危害大且不易治愈，严重影响患者的生活质量[1-5]。然而，其发病机制至今尚未完全阐明，主要有“炎症学说”、“退变性学说”、“过度使用学说”等多种理论，目前大多数学者认为肌腱病是由于过度使用引起肌腱微损伤而修复失败导致[4, 6-7]。进一步有研究显示，肌腱干细胞（tendon stem cells，TSCs）作为肌腱细胞的重要前体细胞，对于肌腱病的发生具有重要作用[8-10]。文献报道，机械应力刺激会引起骨细胞、成骨细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、MSCs 等多种力敏感性细胞增殖以及分化[11-14]，同样有研究报道力学刺激可促进 TSCs 分化[15-17]，但具体机械牵伸载荷参数（牵拉强度、牵拉频率及牵拉时间）与 TSCs 不同分化之间的相关性未见相关报道，对于不同分化的最佳牵拉载荷尚未阐明。本研究通过对大鼠 TSCs 体外加载不同机械牵伸，观察 TSCs 不同分化相关基因变化情况，以期寻求特定分化的牵拉最佳方案。
1. 材料与方法
1.1. 实验动物及主要试剂、仪器
8 周龄雄性 SD 大鼠 6 只，体质量 200～250 g，由第三军医大学实验动物中心提供。
L-DMEM 培养基、胰蛋白酶（HyClone 公司，美国）；FBS（GIBCO 公司，美国）；纤维连接蛋白、分散酶 DispaseⅡ、Ⅰ 型胶原酶（Sigma 公司，美国）；Trizol 试剂盒（Invitrogen 公司，美国）；SYBR®Premix Ex TaqTM RT-PCR 逆转录试剂盒（Takara 公司，日本）；Western blot 相关试剂盒、ECL 试剂盒、BCA 试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；抗 β-actin抗体、抗细胞黏合素 C（Tenascin C，TNC）抗体、抗 CCAAT/增强子结合蛋白-α（CCAAT-enhancer-binding protein-α，CEBPα）抗体、抗 RUNX2 抗体（Abcam 公司，英国）。倒置相差显微镜（Olympus 公司，日本）；激光共聚焦显微镜及照相系统 Nikon A1（Nikon 公司，日本）；Nano-Drop2000 超微量分光光度计（Thermo 公司，美国）；硅树脂细胞牵拉皿（B-Bridge International公司，美国）；iCycler 荧光定量 PCR 仪、Quantity One 软件（Bio-Rad 公司，美国）。
1.2. 大鼠 TSCs 分离及培养及鉴定
细胞培养：参考文献[8，18]方法，取 8 周龄雄性 SD 大鼠 6 只，以高浓度 CO2 处死，75% 乙醇浸泡 5 min 消毒，于超净工作台提取两侧跟腱；去除腱周脂肪及腱膜等组织，PBS 冲洗 3 次；肌腱组织剪成 1 mm×1 mm 大小的组织碎块，将组织碎块转入 15 mL 离心管中；加入 4 mg/mL DispaseⅡ 和 3 mg/mL Ⅰ 型胶原酶混合液 2 mL，室温消化 2 h 后，500×g 离心 5 min，获得细胞沉淀物；用含 20% FBS 的 DMEM 培养基重悬后，接种于细胞培养瓶中，37℃、5%CO2 细胞培养箱内静置原代培养；以后每 3～4 天换液 1 次，4～7 d 后形成细胞克隆；待细胞融合 70%～80% 时进行细胞传代，倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。
细胞鉴定：取 100 μL 第 3 代 TSCs 细胞悬液（密度为 5×105 个/mL）加入 1 μg PE 或 FITC 标记的 CD31、CD34、CD44、CD90 抗体，室温避光孵育 45 min，PBS 冲洗 2 次；以 12 000×g 离心 5 min，弃上清；每个 EP 管中加入 300 μL 预冷的 Buffer 液重悬，流式细胞器仪检测 TSCs 表面标记物表达情况。以 PE 或 FITC 标记的同型匹配的 IgG1 作为阴性对照，计算细胞各标记物阳性表达百分率。
1.3. 实验分组及方法
将大鼠第 3 代 TSCs 胰蛋白酶消化后制备成细胞悬液，按 1×105 个/cm2 密度接种于经 Fibronectin 预处理的硅胶牵拉培养皿，于 37℃、5%CO2 培养箱静置培养 12 h 使细胞完全贴壁。将细胞随机分为不同牵拉条件组（实验组 A～D 组）及静态培养组（对照组 E 组）。其中 A 组牵拉强度 4%、频率 1 Hz，B 组牵拉强度 4%、频率 2 Hz，C 组牵拉强度 8%、频率 1 Hz，D 组牵拉强度 8%、频率 2 Hz；利用本课题组自行研发的体外细胞单轴循环牵拉设备[19]，沿培养皿长轴对 A～D 组细胞进行单轴循环机械牵伸。对照组E组采用静态培养，未进行牵拉。分别处理 12、24、48 h 后收集各组细胞进行以下观测。
1.4. 观测指标
1.4.1 实时荧光定量 PCR 检测分化相关基因 mRNA 表达 按照 Trizol 试剂盒说明书，提取各组 TSCs 总 RNA，测定浓度后根据 SYBR®Premix Ex TaqTM RT-PCR 逆转录试剂盒说明书合成 cDNA。cDNA 合成条件为 37℃、15 min，85℃、5 s。然后按 20 μL 反应体系对 cDNA 进行 SYBR 荧光定量扩增检测各基因[成腱分化相关基因 Scleraxis（SCX）、TNC，成脂肪分化相关基因 CEBPα、脂蛋白脂肪酶（lipo-prteinlipase，LPL）及成骨分化相关基因 RUNX2、远端缺失基因 5（distal-less homeobox 5，DLX5）]表达情况。基因引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物序列见表 1。扩增条件：95℃ 变性 5 min；95℃ 变性 20 s，60℃ 退火 20 s，72℃ 延伸 30 s，40 个循环；最后溶解曲线分析以 0.5℃/s 加热速率从 55℃ 至 95℃。以 2–ΔΔCt 法计算目的基因相对表达量，实验重复 3 次，取均值。
表 1.
Primer sequences for real time fluorescent quantitative PCR
实时荧光定量 PCR 各基因引物序列
| 基因
Gene |
引物序列（5'→3'）
Primer sequence（5'→3'） |
| TNC | 上游 CAGGCCTCAAGGCTGATACC
Upstream |
| 下游 ATGTCGAAGATCCCGTCGGT
Downstream |
|
| SCX | 上游 GCAAGCTCTCCAAGATTGAG
Upstream |
| 下游 CGTCTTTCTGTCACGGTCTT
Downstream |
|
| LPL | 上游 CCCAGCAACATTATCCAGTG
Upstream |
| 下游 CCTAAGAGGTGGACATTGTC
Downstream |
|
| CEBPα | 上游 GGTGGATAAGAACAGCAACG
Upstream |
| 下游 GGTCATTGTCACTGGTCAAC
Downstream |
|
| RUNX2 | 上游 GAACTCAGCACCAAGTCCTTT
Upstream |
| 下游 CAGTGTCATCATCTGAAATACGC
Downstream |
|
| DLX5 | 上游 CTTATGCGGACTACGGCTACG
Upstream |
| 下游 CCTGGGTTTACGAACTTTCTTTG
Downstream |
|
| GAPDH | 上游 TGACTTCAACAGCAACTC
Upstream |
| 下游 TGTAGCCATATTCATTGTCA
Downstream |
1.4.2 Western blot 检测分化相关蛋白表达 参照蛋白裂解液说明书提取各组细胞蛋白，用 BCA 法测量蛋白浓度，取 10 μg 蛋白行 SDS-PAGE 凝胶电泳，聚偏二氟乙烯膜转膜，5 g/L 脱脂奶粉封闭 1 h；加入 β-actin一抗（1∶1 000）、RUNX2一抗（1∶1 000）、CEBPα一抗（1∶500）、TNC一抗（1∶1 000）4℃ 孵育过夜，二抗（1∶3 000）室温孵育 2 h，TBST 洗膜 3 次，用 ECL 试剂盒显影，应用 QuantityOne 软件分析蛋白表达水平。实验重复 3 次，取均值。
1.5. 统计学方法
采用 SPSS18.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用多因素方差分析，两两比较采用 LSD 法检验；检验水准 α=0.05。
2. 结果
2.1. 大鼠 TSCs 形态学观察及鉴定
倒置相差显微镜观察示，大鼠跟腱来源 TSCs 贴壁生长，呈铺路石样，第 1 代细胞贴壁后呈梭形生长。见图 1。
图 1.
The morphology observation of rat TSCs by inverted phase contrast microscope a. Primary TSCs cultured for 6 days (×40); b. Primary TSCs cultured for 6 days (×100); c. TSCs at passage 1 cultured for 4 days (×40)
倒置相差显微镜观察大鼠 TSCs 形态变化 a. 原代细胞培养 6 d（×40）；b. 原代细胞培养 6 d（×100）；c. 第 1 代细胞培养 4 d（×40）
流式细胞术检测示，大鼠 TSCs CD44、CD90 表达阳性，CD31、CD34 表达阴性。见图 2。
图 2.
The surface markers of TSCs at passage 3 by flow cytometric assay a. CD31; b. CD34; c. CD44; d. CD90
流式细胞仪检测大鼠第 3 代 TSCs 表面标志物 a. CD31；b. CD34；c. CD44；d. CD90
2.2. 实时荧光定量 PCR 检测分化相关基因 mRNA 表达
2.2.1 成腱分化相关基因 牵拉12 h，除B组SCX mRNA相对表达量及C、D组TNC mRNA相对表达量显著高于其余各组，以及D组SCX mRNA相对表达量显著低于其余各组，差异有统计学意义（P<0.05）外，其余各组间比较TNC和SCX mRNA相对表达量差异均无统计学意义（P>0.05）。
牵拉24 h，B、C、D组TNC mRNA相对表达量及B、C组SCX mRNA相对表达量显著高于A、E组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、C、D组组间比较TNC及SCX mRNA相对表达量差异均有统计学意义（P<0.05）；其余各组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。
牵拉48 h，除B组TNC和SCX mRNA相对表达量显著高于其余各组，C、D组TNC mRNA相对表达量显著高于A、E组，以及C、D组SCX mRNA相对表达量显著低于其余各组，差异有统计学意义（P<0.05）外，其余各组间比较TNC和SCX mRNA相对表达量差异均无统计学意义（P>0.05）。见图3a、b。
2.2.2 成脂分化相关基因 牵拉 12 h，除 B 组 LPL mRNA 相对表达量显著低于其余各组（P<0.05）外，其余各组间比较 CEBPα 及 LPL mRNA 相对表达量差异均无统计学意义（P>0.05）。
牵拉 24 h，除 B 组 LPL mRNA 相对表达量显著低于其余各组，D 组 LPL mRNA 相对表达量显著高于其余各组（P<0.05）外，其余各组间比较 CEBPα 及 LPL mRNA 相对表达量差异均无统计学意义（P>0.05）。
牵拉 48 h，D 组 CEBPα 及 LPL mRNA 相对表达量均显著高于其余各组，差异有统计学意义（P<0.05）；其余各组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 3c、d。
图 3.
The mRNA expressions of differentiation related genes in each group at different time points after mechanical stretch by real-time fluorescent quantitative PCR a. TNC; b. SCX; c. CEBPα; d. LPL; e. RUNX2; f. DLX5
实时荧光定量 PCR 检测各组各时间点分化相关基因 mRNA 表达 a. TNC；b. SCX；c. CEBPα；d. LPL；e. RUNX2；f. DLX5
2.2.3 成骨分化相关基因 牵拉 12 h，各组 RUNX2 mRNA 相对表达量比较差异均无统计学意义（P>0.05）；C、D 组 DLX5 mRNA 相对表达量显著高于其余各组（P<0.05），C、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
牵拉 24 h，除 C 组 RUNX2 及 DLX5 mRNA 相对表达量显著高于其余各组，A 组 DLX5 mRNA 相对表达量显著低于其余各组（P<0.05）外，其余各组间比较 RUNX2 及 DLX5 mRNA 相对表达量差异均无统计学意义（P>0.05）。
牵拉 48 h，B 组 RUNX2 mRNA 相对表达量显著高于其余各组（P<0.05），其余各组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。A 组 DLX5 mRNA 相对表达量显著低于其余各组（P<0.05）；B、C、D 组显著高于 E 组，C、D 组高于 B 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；C、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 3e、f。
2.3. Western blot 检测分化相关蛋白表达
A 组：牵拉 12 h 成脂肪分化相关蛋白 CEBPα 相对表达量与 E 组比较差异无统计学意义（P>0.05）；24、48 h 显著低于 E 组，差异有统计学意义（P<0.05）。牵拉 12、24 h 成骨分化相关蛋白 RUNX2 相对表达量与 E 组比较差异无统计学意义（P>0.05）；48 h 显著高于 E 组，差异有统计学意义（P<0.05）。牵拉 12 h 成腱分化相关蛋白 TNC 相对表达量与 E 组比较差异无统计学意义（P>0.05）；24、48 h 显著高于 E 组，差异有统计学意义（P<0.05）。
B 组：牵拉 12、48 h 成脂肪分化相关蛋白 CEBPα 相对表达量与E组比较差异无统计学意义（P>0.05）；24 h 显著低于E组，差异有统计学意义（P<0.05）。牵拉 24、48 h 成骨分化相关蛋白 RUNX2 相对表达量与 E 组比较差异无统计学意义（P>0.05）；12 h 显著高于 E 组，差异有统计学意义（P<0.05）。牵拉各时间点成腱分化相关蛋白 TNC 相对表达量均显著高于 E 组，差异有统计学意义（P<0.05）。
C 组：牵拉各时间点成脂肪分化相关蛋白 CEBPα 相对表达量与 E 组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。牵拉 12、48 h 成骨分化相关蛋白 RUNX2 相对表达量与 E 组比较差异无统计学意义（P>0.05）；24 h 显著高于 E 组，差异有统计学意义（P<0.05）。牵拉 12 h 成腱分化相关蛋白 TNC 相对表达量与 E 组比较差异无统计学意义（P>0.05）；24、48 h 显著低于E组，差异有统计学意义（P<0.05）。
D 组：牵拉 12、24 h 成脂肪分化相关蛋白 CEBPα 相对表达量与 E 组比较差异无统计学意义（P>0.05）；48 h 显著高于 E 组，差异有统计学意义（P<0.05）。牵拉各时间点成骨分化相关蛋白 RUNX2 相对表达量与 E 组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。牵拉 12 h 成腱分化相关蛋白 TNC 相对表达量显著高于 E 组，48 h 显著低于 E 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；24 h 与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 4、5。
图 4.
The protein expressions of differentiation related proteins in each group at different time points after mechanical stretch by Western blot 1: Group E at 12 hours 2: Experiment group at 12 hours 3: Group E at 24 hours 4: Experimental group at 24 hours 5: Group E at 48 hours 6: Experimental group at 48 hours a. Group A and group E; b. Group B and group E; c. Group C and group E; d. Group D and group E
Western blot 检测各组各时间点分化相关蛋白表达 1：E 组 12 h 2：实验组 12 h 3：E 组 24 h 4：实验组 24 h 5：E 组 48 h 6：实验组 48 h a. A 组和 E 组；b. B 组和 E 组；c. C 组和 E 组；d. D 组和 E 组
图 5.
The relative expressions of differentiation related proteins in each group at different time points after mechanical stretch by Western blot From left to right for CEBPα, RUNX2, TNC respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
Western blot 检测各组各时间点分化相关蛋白相对表达量 从左至右依次为 CEBPα、RUNX2、TNC a. A组；b. B组；c. C组；d. D组
3. 讨论
肌腱病是一种临床常见的慢性运动损伤性疾病，严重影响患者生活质量，其治疗方法虽多，但由于其病因及发病机制尚未完全阐明，疗效都不甚理想。肌腱是连接骨与骨骼肌的致密结缔组织，主要功能是将力从肌肉传递到骨，从而引起运动[7, 20-23]。临床研究发现肌腱病最好发的部位正是受力学刺激最大的肌腱，如跟腱、肩袖及髌腱等，由此推断机械力学刺激对于肌腱的代谢及病理生理功能具有至关重要的调节功能，因而目前大多数学者认为肌腱病的发生与过度使用引起肌腱微损伤有着直接联系。
近年来随着对肌腱病发病机制和治疗策略的研究日益深入，TSCs逐渐走进国内外学者的视线。TSCs是 2007 年由 Bi 等[8]首次从小鼠和人中分离出的一种来源于肌腱组织的MSCs，其具有自我更新和多向分化潜能。文献报道TSCs数量很少，仅占肌腱细胞的 3%~4%。虽然 TSCs 所占比例不高，但由于 TSCs 是肌腱细胞的唯一前体细胞，具有分化为肌腱细胞的潜能，因此 TSCs 对于肌腱生理功能的维持以及肌腱损伤修复具有重要作用。研究显示 TSCs 同其他力学敏感性细胞（如成骨细胞、角膜细胞、BMSCs等）一样，都能对外界机械刺激作出应答反应，同时机械应力刺激的强度、频率及作用时间均会对细胞产生不同影响[24-25]。James H-C Wang 和本课题组前期研究发现，4%“适度”应力刺激会促进 TSCs 向成肌腱分化，而 8%“过度”应力刺激会促使 TSCs 向成骨和成脂肪异常分化[16, 26]。该项发现同样在大鼠跑台训练中得以验证，“适度”跑台训练会促进体内 TSCs 向成肌腱分化，而“过度”跑台训练会使大鼠体内 TSCs 成骨、成脂肪异常分化[27]，同时长期“过度”跑台训练还会使受训大鼠出现肌腱病表现[28-29]。Sharma 等[30]发现当肌腱纤维应变量在 2%～4%时，弯曲的胶原纤维逐渐被拉直，排列更紧密，但仍处于弹性可复状态，未见微观的损伤；但应变量>4%时，便可见肌腱纤维微断裂；当应变量超过 8%～10%，肌腱纤维就会迅速发生完全断裂损伤。Shi 等[31]研究报道长时间单轴循环牵拉会引起 TSCs 成骨分化明显增强。本课题组前期研究证实高频率高强度机械牵伸会使 TSCs 增殖能力下降，同时成肌腱方向分化降低、向成骨方向分化增加[16]。然而，尽管机械刺激对 TSCs 分化的影响已有部分研究，但究竟何种牵拉条件才是适度牵拉，何种牵拉条件才是过度牵拉，以及诱导 TSCs 成骨、成脂肪及成肌腱特定分化的具体牵拉载荷参数并未见相关报道。针对上述问题，本课题组做了进一步研究。
本研究利用课题组自行研发设计的体外细胞单轴循环牵伸系统，对 TSCs 施加不同的单轴机械牵伸处理，观察其对 TSCs 不同分化的影响，寻求不同分化的最佳机械牵伸条件。结果显示 A 组牵拉 48 h 成腱分化相关基因 TNC 及成骨分化相关基因 RUNX2 较对照组均显著升高（P<0.05），因而不作为牵拉诱导分化的最佳条件。B 组各牵拉时间点成腱分化相关基因 TNC 相对表达量较对照组均明显升高（P<0.05），同时牵拉 24 h 时较对照组成脂分化相关基因 CEBPα 有显著抑制作用（P<0.05），牵拉 24 h 时成骨分化相关蛋白 RUNX2 相对表达量较对照组无明显差异（P>0.05），故选择 4%、2 Hz、24 h 为成腱分化最佳牵拉条件。C 组牵拉 24 h 成骨分化相关基因 RUNX2 蛋白表达水平均显著高于对照组（P<0.05），同时牵拉 24 h 时成腱及成脂肪分化相关蛋白表达与对照组无显著升高（P>0.05），故选择 8%、1 Hz、24 h 为成骨分化最佳牵拉条件；D 组牵拉 48 h 成脂肪分化相关基因 CEBPα 蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.05），同时牵拉 48 h 时成骨分化相关基因 RUNX2 较对照组相对表达量无明显差异（P>0.05），成腱分化相关基因蛋白 TNC 表达较对照组显著降低（P<0.05），故选择 8%、2 Hz、48 h 为成脂肪分化最佳牵拉条件。
综上述，该结果与文献报道基本一致，4% 为 TSCs 成肌腱分化适度牵伸强度，8% 为过度牵伸强度，但机械牵拉最终效果必须结合牵拉频率以及牵拉时间的作用综合考虑。本研究为后期进一步对机械牵拉引起 TSCs 特定分化的机制研究提供了理论依据，但体外细胞适度牵拉条件如何与动物实验的适度训练条件进行匹配仍需进一步研究明确。
Funding Statement
国家自然科学基金重点资助项目（81230040）；全军医学科研基金创新专项重点资助项目（13CXZ008）
State Key Program of National Natural Science Foundation of China (81230040); Medical Research Foundation of Chinese PLA (13CXZ008)
References
- 1.Wren T, Yerby SA, Beaupré GS, et al. Mechanical properties of the human achilles tendon. Clin Biomech (Bristol Avon) 2001;16(3):245–251. doi: 10.1016/s0268-0033(00)00089-9. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.魏传付, 王予彬, 王惠芳. 肌腱腱病发病机制的分子生物学研究进展. 中国康复医学杂志. 2011;26(1):90–93. [Google Scholar]
- 3.Kvist M. Achilles tendon injuries in athletes. Sports Med. 1994;18(3):173–201. doi: 10.2165/00007256-199418030-00004. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 4.Magnan B, Bondi M, Pierantoni S, et al. The pathogenesis of Achilles tendinopathy: a systematic review. Foot Ankle Surg. 2014;20(3):154–159. doi: 10.1016/j.fas.2014.02.010. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.Lopez RG, Jung HG. Achilles tendinosis: treatment options. Clin Orthop Surg. 2015;7(1):1–7. doi: 10.4055/cios.2015.7.1.1. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 6.唐康来, 陈磊. 跟腱病的外科治疗策略. 中国骨与关节外科. 2012;5(4):306–309. [Google Scholar]
- 7.Riley G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology (Oxford) 2004;43(2):131–142. doi: 10.1093/rheumatology/keg448. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 8.Bi Y, Ehirchiou D, Kilts TM, et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nat Med. 2007;13(10):1219–1227. doi: 10.1038/nm1630. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 9.Chen L, Dong SW, Liu JP, et al. Synergy of tendon stem cells and platelet-rich plasma in tendon healing. J Orthop Res. 2012;30(6):991–997. doi: 10.1002/jor.22033. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 10.Zhang J, Wang JH. BMP-2 mediates PGE(2)-induced reduction of proliferation and osteogenic differentiation of human tendon stem cells. J Orthop Res. 2012;30(1):47–52. doi: 10.1002/jor.21485. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.Wang J, Wang CD, Zhang N, et al. Mechanical stimulation orchestrates the osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells by regulating HDAC1. Cell Death Dis. 2016;7:e2221. doi: 10.1038/cddis.2016.112. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 12.Parvizi M, Bolhuis-Versteeg LA, Poot AA, et al. Efficient generation of smooth muscle cells from adipose-derived stromal cells by 3D mechanical stimulation can substitute the use of growth factors in vascular tissue engineering. Biotechnol J. 2016;11(7):932–944. doi: 10.1002/biot.201500519. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 13.Sun L, Qu L, Zhu R, et al. Effects of Mechanical Stretch on Cell Proliferation and Matrix Formation of Mesenchymal Stem Cell and Anterior Cruciate Ligament Fibroblast. Stem Cells Int. 2016;2016:9842075. doi: 10.1155/2016/9842075. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 14.Lin X, Shi Y, Cao Y, et al. Recent progress in stem cell differentiation directed by material and mechanical cues. Biomed Mater. 2016;11(1):014109. doi: 10.1088/1748-6041/11/1/014109. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 15.Zhang J, Wang JH. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskelet Disord. 2010;11:10. doi: 10.1186/1471-2474-11-10. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 16.Liu X, Chen W, Zhou Y, et al. Mechanical Tension Promotes the Osteogenic Differentiation of Rat Tendon-derived Stem Cells Through the Wnt5a/Wnt5b/JNK Signaling Pathway. Cell Physiol Biochem. 2015;36(2):517–530. doi: 10.1159/000430117. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 17.Li R, Liang L, Dou Y, et al. Mechanical strain regulates osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Biomed Res Int. 2015;2015:873251. doi: 10.1155/2015/873251. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 18.胡超, 唐康来, 陈万, 等. 大鼠跟腱来源肌腱干细胞的分离培养及鉴定. 第三军医大学学报. 2013;35(11):1097–1101. [Google Scholar]
- 19.曹洪辉, 唐康来, 陈磊, 等. 新型肌腱细胞循环牵伸载荷系统的研制及运行效果观察. 第三军医大学学报. 2010;(06):507–510. [Google Scholar]
- 20.Connizzo BK, Yannascoli SM, Soslowsky LJ. Structure-function relationships of postnatal tendon development: a parallel to healing. Matrix Biol. 2013;32(2):106–116. doi: 10.1016/j.matbio.2013.01.007. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 21.胡超, 李旭. 基于力学生物学的跟腱愈合研究现状. 中国康复医学杂志. 2015;30(10):1078–1081. [Google Scholar]
- 22.Thorpe CT, Screen HR. Tendon Structure and Composition. Adv Exp Med Biol. 2016;920:3–10. doi: 10.1007/978-3-319-33943-6_1. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 23.Esquisatto MA, Joazeiro PP, Pimentel ER, et al. The effect of age on the structure and composition of rat tendon fibrocartilage. Cell Biol Int. 2007;31(6):570–577. doi: 10.1016/j.cellbi.2006.11.030. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 24.Dado D, Sagi M, Levenberg S, et al. Mechanical control of stem cell differentiation. Regen Med. 2012;7(1):101–116. doi: 10.2217/rme.11.99. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 25.Wang JH, Komatsu I. Tendon Stem Cells: Mechanobiology and Development of Tendinopathy. Adv Exp Med Biol. 2016;920:53–62. doi: 10.1007/978-3-319-33943-6_5. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 26.Zhang J, Wang JH. Mechanobiological response of tendon stem cells: implications of tendon homeostasis and pathogenesis of tendinopathy. J Orthop Res. 2010;28(5):639–643. doi: 10.1002/jor.21046. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 27.Zhang J, Yuan T, Wang JH. Moderate treadmill running exercise prior to tendon injury enhances wound healing in aging rats. Oncotarget. 2016;7(8):8498–8512. doi: 10.18632/oncotarget.7381. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 28.李国华, 韩亚军, 伊力哈木·托合提, 等. 过度运动对大鼠冈上肌腱损伤和腱细胞凋亡的影响. 新疆医科大学学报. 2011;34(11):1222–1227. [Google Scholar]
- 29.Zhang J, Wang JH. Moderate Exercise Mitigates the Detrimental Effects of Aging on Tendon Stem Cells. PLoS One. 2015;10(6):e0130454. doi: 10.1371/journal.pone.0130454. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 30.Sharma P, Maffulli N. Biology of tendon injury: healing, modeling and remodeling. J Musculoskelet Neuronal Interact. 2006;6(2):181–190. [PubMed] [Google Scholar]
- 31.Shi Y, Fu Y, Tong W, et al. Uniaxial mechanical tension promoted osteogenic differentiation of rat tendon-derived stem cells (rTDSCs) via the Wnt5a-RhoA pathway. J Cell Biochem. 2012;113(10):3133–3142. doi: 10.1002/jcb.24190. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]