大鼠脂肪来源干细胞对紫外线造成的软骨细胞 DNA 损伤的修复作用研究

Abstract

Objective

To explore the DNA repair effect of rat adipose-derived stem cells (ADSCs) on chond-rocytes exposed to ultraviolet (UV) radiation.

Methods

ADSCs were isolated and cultured from the inguinal adipose tissue of Sprague Dawley rat by digestion with collagenase type I. ADSCs cell phenotype was assayed with flow cytometry. Multiple differentiation capability of ADSCs at passage 3 was identified with osteogenic and adipogenic induction. The chondrocytes were obtained from rat articular cartilage by digestion with collagenase type II and were identified with toluidine blue staining. The chondrocytes at passage 3 were irradiated with 40 J/m² UV and cultured with normal medium (irradiated group), and medium containing the ADSCs supernatant (ADSCs supernatant group) or ADSCs was used for co-culture (ADSCs group) for 24 hours; no irradiation chondrocytes served as control group. The cell proliferation was estimated by MTS method. The expression of phosphorylated histone family 2A variant (γH2AX) was detected by immunofluorescence and Western blot.

Results

ADSCs presented CD29(+), CD44(+), CD106(-), and CD34(-); and results of the alizarin red staining and oil red O staining were positive after osteogenic and adipogenic induction. Cell proliferation assay demonstrated the absorbance (A) values were 2.20±0.10 (control group), 1.34±0.04 (irradiated group), and 1.57±0.06 (ADSCs supernatant group), showing significant difference between groups (P<0.05). Immunofluorescence and Western blot showed that the γH2AX protein expression was significantly increased in irradiated group, ADSCs supernatant group, and ADSCs group when compared with control group (P<0.05), and the expression was significantly decreased in ADSCs supernatant group and ADSCs group when compared with irradiated group (P<0.05), but no significant difference was found between ADSCs supernatant group and ADSCs group (P>0.05).

Conclusion

ADSCs can increase the cell proliferation and down-regulate the γH2AX protein expression of irradiated cells, indicating ADSCs contribute to the repair of irradiated chondrocyte.

各种原因造成的射线辐射是促使机体老化衰退的重要原因，照射生物体时可直接破坏机体内某些大分子结构，如使 DNA 分子链断裂、与细胞生长相关的一些蛋白质和酶发生变性及破坏，从而引起细胞凋亡和机体老化。DNA 双链断裂（DNA double-strand breaks，DSBs）是 DNA 损伤中最严重的形式，若未能修复可致细胞死亡。DNA 发生损伤时，细胞会立即做出系列的 DNA 损伤应答反应（DNA damage response，DDR），其中组蛋白 2A 变异体（histone family 2A variant，H2AX）的磷酸化是激活 DDR 反应通路中的关键蛋白，是感应 DNA 损伤的标志蛋白。采用特异性抗体检测磷酸化 H2AX（phosphorylated H2AX，γH2AX）是检测 DSBs 的常用方法。研究表明，脂肪来源干细胞（adipose- derived stem cells，ADSCs）可通过旁分泌生长因子和直接参与方式促进血管生成及组织再生^[1]，但关于 ADSCs 对射线辐射造成细胞损伤的修复作用研究较少。因此，本研究以紫外线照射软骨细胞作为细胞损伤模型，观察大鼠 ADSCs 对紫外线辐射造成的软骨细胞损伤的修复作用。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及主要试剂、仪器

3～4 周龄健康 SD 大鼠 5 只，雌雄不限，体质量 100～120 g，购于广东省实验动物中心。

DMEM/F12 培养基、L-DMEM 培养基、FBS、胰蛋白酶、Ⅰ 型胶原酶、Ⅱ 型胶原酶、青链霉素（Life Technology 公司，美国）；CellTiter 96^® A Queous 单溶液细胞增殖检测试剂盒（Promega 公司，美国）；兔单克隆抗体 γH2AX 和 β-actin（Cell Signaling 公司，美国）；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛、维生素 C、β-甘油磷酸钠、地塞米松、茜素红、油红 O（Sigma 公司，美国）。Transwell 小室（Millipore 公司，美国）；紫外线交联仪（Spec-tronics 公司，美国）；化学发光凝胶成像系统（Bio-Rad 公司，美国）；荧光显微镜（ZEISS 公司，德国）；CO₂ 培养箱（Thermo 公司，美国）；流式细胞仪（Beckman-Coulter 公司，美国）；酶标仪（Bio-Tec 公司，美国）。

1.2. 细胞分离、培养及鉴定

1.2.1 ADSCs　取 SD 大鼠 3 只，无菌条件下取腹股沟脂肪，PBS 缓冲液反复冲洗，眼科剪剪碎至糊状，加入 0.1%Ⅰ 型胶原酶后置于摇床中，37℃ 消化 60 min；经 100 目筛网过滤后，加入 DMEM/F12 培养液终止消化；180×g 离心 5 min，弃上清；取沉淀细胞，用含 10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素的 DMEM/F12 培养基重悬并接种至培养瓶中，置于 37℃、5% CO₂ 培养箱中培养并传代，倒置相差显微镜观察细胞形态变化。

取第 3 代细胞进行鉴定：① 流式细胞仪检测：流式细胞仪检测细胞表面标志 CD29、CD34、CD44、CD106 表达。② 成骨诱导鉴定：采用成骨诱导液（含 100 nmol/L 地塞米松、50 μmol/L 维生素 C、20 mmol/L β-甘油磷酸钠的 L-DMEM 培养基）诱导培养 3 周，行茜素红染色观察。③ 成脂诱导鉴定：采用成脂诱导液（含 1 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L 吲哚美辛、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10 μg/mL 胰岛素的 H-DMEM 培养基）诱导培养 3 周，行油红 O 染色观察。

1.2.2 软骨细胞　取 SD 大鼠 2 只，无菌条件下取膝关节，用无菌剪刀剔除关节周围附着的脂肪及韧带组织，用眼科剪剪取关节软骨组织，置入装有无菌 PBS 缓冲液的培养皿中冲洗并剪碎；将剪碎的软骨组织放入 0.2%Ⅱ 型胶原酶中消化，置振荡器上 37℃ 震荡消化 2 h，经 100 目筛网过滤后加入 DMEM/F12 培养液终止消化；180×g 离心 5 min，弃上清液，加入含 10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素的 DMEM/F12 培养基，置于 37℃、5% CO₂ 培养箱中培养并传代，倒置相差显微镜观察细胞形态。取第 3 代细胞行甲苯胺蓝染色鉴定。

1.3. 观测指标

1.3.1 MTS 法检测 ADSCs 培养上清对紫外线照射的软骨细胞增殖的影响　取第 3 代软骨细胞以 5 000 个/孔接种于 96 孔板，用含 10% FBS 的 DMEM/F12 培养基培养。实验分为 3 组：对照组细胞正常培养，不作任何处理；照射组细胞仅进行紫外线照射处理；ADSCs 上清组细胞行紫外线照射后，以加入 ADSCs 上清的培养基进行培养。将照射组和 ADSCs 上清组细胞放入紫外线交联仪，选择 40 J/m² 剂量进行照射，照射时间由机器自动调整。照射完毕，照射组继续用含 10% FBS 的 DMEM/F12 培养基培养，ADSCs 上清组在上述培养基基础上加入 20% ADSCs 培养上清（第 3 代 ADSCs 培养 48 h 的上清液）。继续培养 24 h 后采用 CellTiter 96^® A Queous 单溶液细胞增殖检测试剂盒孵育 3 h，用酶标仪检测 490 nm 波长下各孔吸光度（A）值。每组复 6 孔，取均值。

1.3.2 免疫荧光染色观察 ADSCs 和 ADSCs 培养上清对紫外线照射软骨细胞 γH2AX 蛋白的影响　取第 3 代 ADSCs，以 3×10⁴ 个/孔密度接种于 6 孔板 Transwell 小室上层，备用。同时取第 3 代软骨细胞，以 5×10⁴ 个/孔接种于预先放有盖玻片的 6 孔板中，用含 10% FBS 的 DMEM/F12 培养基培养。次日去上清，同上法行紫外线照射。照射完毕将软骨细胞分成 3 组，分别为照射组、ADSCs 上清组、ADSCs 组，照射组继续用含 10% FBS 的 DMEM/F12 培养基培养，ADSCs 上清组在上述培养基基础上加入 20% ADSCs 培养上清，ADSCs 组将软骨细胞放入接种有 ADSCs 的 Transwell 小室下层。以正常培养的软骨细胞作为对照组。培养 24 h 后，取出盖玻片，PBS 洗 3 次，采用 4% 多聚甲醛固定，经过透膜、封闭，加入抗大鼠 γH2AX 单克隆一抗（1∶100），4℃ 孵育过夜；次日，PBS 洗 3 次，加入罗丹明标记荧光二抗（1∶200），细胞核采用 DAPI 复染，荧光显微镜观察。

1.3.3 Western blot 检测 ADSCs 和 ADSCs 培养上清对紫外线照射软骨细胞 γH2AX 蛋白的影响　实验分为照射组、ADSCs 上清组、ADSCs 组和对照组，除软骨细胞接种密度为 7×10⁴ 个/孔外，分组处理方法同 1.3.2。培养 24 h 后，收集细胞，用 RIPA 裂解液裂解细胞，收集细胞总蛋白。以 BCA 法测定蛋白浓度，每组取 20 μg 蛋白进行电泳转膜，以 3% 牛血清白蛋白封闭 2 h，加入抗 γH2AX 兔单克隆一抗（1∶1 000）及抗 β-actin 兔单克隆一抗（1∶2 000），4℃ 孵育过夜；次日，PBS 洗 3 次，加入二抗抗兔辣根过氧化物酶标记多克隆抗体（1∶3 000）室温孵育 1 h；以 β-actin 为内参蛋白。加入化学发光剂，凝胶成像系统拍照，并采用 Image Lab 4.0 软件进行半定量分析。

1.4. 统计学方法

采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. 细胞形态观察及鉴定

2.1.1 ADSCs　细胞接种 3 d 后首次换液，倒置相差显微镜观察示细胞呈长梭形纤维细胞样，散在生长，未形成集落；传代后细胞呈纤维细胞样，密集时呈漩涡样排列。见图 1。流式细胞仪检测表面标志示 CD29（+）、CD44（+）、CD34（–）、CD106（–）。见图 2。经成骨、成脂诱导分化 3 周后，茜素红染色可见红色结节样钙沉积，油红 O 染色可见红色圆形脂肪滴。见图 3。

图 1.

ADSCs morphological observation (Inverted phase contrast microscope×100)　a. Primary cell; b. ADSCs at passage 3

ADSCs 形态学观察（倒置相差显微镜×100）　a. 原代细胞；b. 第 3 代细胞

图 2.

Surface markers identification of ADSCs by flow cytometry　a. CD29; b. CD44; c. CD34; d. CD106

流式细胞仪检测 ADSCs 表面标志　a. CD29；b. CD44；c. CD34；d. CD106

图 3.

Multiple differentiation identification of ADSCs (Inverted phase contrast microscope×100)　a. Alizarin red staining after osteogenic induction for 3 weeks; b. Oil red O staining after adipogenic induction for 3 weeks

第 3 代 ADSCs 成骨、成脂诱导分化鉴定（倒置相差显微镜×100）　a. 成骨诱导 3 周茜素红染色；b. 成脂诱导 3 周油红 O 染色

2.1.2 软骨细胞　细胞接种 3 d 后首次换液，倒置相差显微镜示原代软骨细胞贴壁生长，呈多角形、星形，7 d 左右铺满；细胞形态随传代次数增加变得较规则，呈铺路石样。甲苯胺蓝染色观察示，细胞外基质可见蓝色异染颗粒，细胞核染成深蓝色，提示培养的细胞符合软骨细胞生长特性。见图 4。

图 4.

Morphological observation of chondrocytes (Inverted phase contrast microscope×100)　a. Morphological observation of cells at passage 3; b. Toluidine blue staining observation

软骨细胞形态学观察及鉴定（倒置相差显微镜×100）　a. 第 3 代细胞形态观察；b. 甲苯胺蓝染色观察

2.2. MTS 法检测 ADSCs 培养上清对紫外线照射软骨细胞增殖的影响

对照组、照射组及 ADSCs 上清组 A 值分别为 2.20±0.10、1.34±0.04、1.57±0.06，照射组及 ADSCs 上清组显著低于对照组，照射组显著低于 ADSCs 上清组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.3. 免疫荧光染色检测 ADSCs 和 ADSCs 培养上清对紫外线照射软骨细胞 γH2AX 蛋白的影响

与对照组相比，照射组、ADSCs 上清组及 ADSCs 组 γH2AX 蛋白荧光强度明显升高，但 ADSCs 上清组及 ADSCs 组 γH2AX 蛋白荧光强度明显弱于照射组，ADSCs 组和 ADSCs 上清组无区别。见图 5。

图 5.

Immunofluorescence staining of the γH2AX protein expression in each group (Fluorescence microscopy×600)　From left to right for γH2AX, DAPI, and merge of γH2AX and DAPI a. Control group; b. Irradiated group; c. ADSCs supernatant goup; d. ADSCs group

免疫荧光染色观察各组 γH2AX 蛋白荧光表达（荧光显微镜×600）　从左至右依次为 γH2AX 染色、DAPI 染色及合图 a. 对照组；b. 照射组；c. ADSCs 上清组；d. ADSCs 组

2.4. Western blot 检测 ADSCs 和 ADSCs 培养上清对紫外线照射软骨细胞 γH2AX 蛋白的影响

对照组、照射组、ADSCs 上清组及 ADSCs 组 γH2AX 蛋白相对表达量分别为 0.10±0.02、2.57±0.15、1.91±0.16、1.70±0.17。与对照组相比，照射组、ADSCs 上清组及 ADSCs 组 γH2AX 蛋白相对表达量均明显升高，但 ADSCs 上清组及 ADSCs 组显著低于照射组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；ADSCs 组和 ADSCs 上清组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 6。

图 6.

γH2AX protein expression in each group by Western blot　 1: Control group; 2: Irradiated group; 3: ADSCs supernatant group; 4: ADSCs group

Western blot 检测各组软骨细胞 γH2AX 蛋白表达　1：对照组；2：照射组；3：ADSCs 上清组；4：ADSCs 组

3. 讨论

电离辐射、遗传毒性化学物质、化疗药物等均可导致 DSBs，它是 DNA 损伤中最严重的形式，若未能修复可致细胞死亡^[2]。DSBs 无效修复或错误修复可导致基因组不稳定，表现为染色体重排或染色体缺失，最终导致肿瘤及其他年龄相关性疾病的发生^[3]。电离辐射对骨和软骨的影响主要表现在骨生长障碍、变性作用和恶变。特别是发育中的骨和软骨组织对辐射极为敏感，小剂量即可引起形态学、酶学甚至生物力学特征的改变，这与电离辐射干扰了有丝分裂、引起细胞增殖障碍、细胞变性及代谢改变有关^[4]。而电离辐射引起骨生长障碍的主要病理基础就是对骨骺增殖软骨细胞的损伤。本研究中，我们采用 CellTiter 96^® A Queous 单溶液细胞增殖检测试剂盒来检测电离辐射对软骨细胞增殖的影响。此试剂盒是 MTS 的改良版，是由 MTS 和化学稳定性已得到增强的 PES 混合组成的单溶液，原理与 MTS 类似，但使用更简单，该单溶液试剂直接加入至培养孔中，A 值与培养物中活细胞的数量成正比。结果显示，电离辐射抑制了软骨细胞的增殖；而照射后采用含 ADSCs 上清的培养基培养的细胞与照射后采用未添加 ADSCs 上清培养基培养的细胞相比，增殖恢复明显加快。提示 ADSCs 促进软骨细胞损伤后恢复的作用可能与其分泌的促生长因子有关。

ADSCs 于 2001 年被成功分离，其具有多向分化潜能，可分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、心肌细胞和神经细胞等^[5-12]。多项实验表明，ADSCs 可表达和分泌多种生长因子，如 IGF、肝细胞生长因子、TGF 和 VEGF 等^[13-17]，能够促进多种组织与细胞的生长。而且相同体积的脂肪组织所含干细胞数量是骨髓组织中的 1 000 倍^[18]。因此，ADSCs 在组织修复或再生中的应用非常广泛，包括心血管组织再生、骨/软骨修复、尿道重建、椎间盘修复和外周神经修复等。

关于 ADSCs 对软骨组织的修复，一般认为是通过直接分化为软骨细胞或分泌抗炎因子来实现的，过度的紫外线照射也是一种损伤刺激，会引起软骨细胞一系列炎性反应。因此，ADSCs 分泌抗炎因子可能是促进软骨细胞修复的途径之一。但 ADSCs 对电离辐射引起的 DNA 损伤是否具有修复作用，目前研究较少。DNA 损伤有多种形式，如 DNA 单链断裂、DNA 与 DNA 的交联、DNA 与蛋白质的交联、DSBs 等。其中，DSBs 会影响 DNA 双螺旋结构，被认为是 DNA 损伤最严重形式。在 DSBs 发生后几分钟内，H2AX 分子在丝氨酸 139 被快速磷酸化形成 γH2AX；γH2AX 在 DSBs 的损伤修复过程中发挥重要作用，它将一系列 DNA 损伤反应蛋白募集到 DNA 损伤位点，形成 DNA 损伤反应功能复合物，启动激活 DNA 修复、细胞周期检查点等细胞 DNA 损伤反应。这种 DNA 损伤应激反应在几分钟内就能出现，因此它被认为是一种早期检测 DSBs 的最有效生物学标志物^[19]。在 DNA 损伤修复结束后，γH2AX 的及时去磷酸化，对于修复蛋白复合物从所结合的 DNA 上解离以及细胞周期检查点的释放，都是至关重要的。然而，关于 γH2AX 和其他修复蛋白是如何从染色体上解离从而使细胞进入正常分裂周期，以及 γH2AX 是如何恢复成 H2AX 的动力学机制，目前尚未明确。有关研究人员提出了两种可能机制：γH2AX 通过组蛋白交换的方式从染色体上解离^[20]，或者 γH2AX 通过被磷酸酶去磷酸化而恢复成 H2AX。目前已证实的 γH2AX 的去磷酸化酶包括蛋白磷酸酶 2、蛋白磷酸酶 4、蛋白磷酸酶 6、野生型 p53 诱导性磷酸酶 1（wild-type p53-induced phosphatase1，Wip1）^[21]。Wip1 是 DNA 损伤应答网络中的关键分子之一，在 DNA 损伤应答中由 p53 诱导，对 DNA 损伤应答发挥抑制作用。通过去磷酸化 p38 丝裂原活化蛋白激酶、p53、ATM、Chk1、Chk2、MDM2 和 MDM4，使停滞的细胞周期继续进行。本研究中，我们分别通过免疫荧光染色和 Western blot 检测了 γH2AX 的表达，结果发现 ADSCs 上清能降低 γH2AX 的表达，促进损伤软骨的修复；而且无论是提前制备的上清还是 Transwell 培养上清，均具有修复作用，并且无明显差别。因此，我们认为 ADSCs 对辐射损伤软骨细胞的修复作用可能是通过分泌的各种生长因子促进磷酸酶去磷酸化 γH2AX 实现的。然而，对于这些去磷酸化反应的分子机制的研究尚处于初级阶段，而 ADSC 分泌的上清成分又比较复杂，因此还有许多问题需要深入研究和探讨。比如，ADSC 上清中哪些成分能够激活哪些磷酸酶的表达，DNA 损伤修复完成后这些磷酸酶是被哪些蛋白激活而发挥作用，均是未来研究的方向。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（81272222）；广州市卫生局一般引导项目（20131A011038）；广州市科技计划项目（201508020262）

National Natural Science Foundation of China (81272222); Medical and Health Science and Technology Project of Guangzhou (20131A011038); Key Scientific and Technological Program of Guangzhou (201508020262)