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Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery logoLink to Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery
. 2017 Dec;31(12):1500–1505. [Article in Chinese] doi: 10.7507/1002-1892.201710038

BMSCs 条件培养液诱导小胶质细胞分泌精氨酸酶 1 的初步研究

Effect of bone marrow mesenchymal stem cells conditioned medium on microglia and its secretion of arginase 1 in rats

云慧 陈 1, 曙光 余 2, 巧凤 吴 2, 勇 唐 2, 岑 姜 1, 志奇 庄 2, 娜 赵 2, 彪 黄 2, 璐霜 谢 1,2,*
PMCID: PMC8498264  PMID: 29806395

Abstract

目的

初步探讨 BMSCs 条件培养液对小胶质细胞(microglia,MGs)激活及其分泌精氨酸酶 1(arginase 1,Arg1)的影响。

方法

取 4 周龄 SD 大鼠股骨和胫骨骨髓,采用差速贴壁法分离培养原代 BMSCs,行 Vimentin 免疫荧光染色鉴定。取新生 3 日内 SD 大鼠全脑,采用胰蛋白酶消化法分离培养原代 MGs,行 Iba1 免疫荧光染色鉴定。收集对数生长期 BMSCs 培养液制备 BMSCs 条件培养液,取原代 MGs,分别使用含 BMSCs 条件培养液的 DMEM/F12 培养基(实验组)和普通 DMEM/F12 培养基(对照组)培养。培养 48 h 后采用倒置相差显微镜观察 MGs 的形态改变;Iba1 免疫荧光染色观察 MGs 激活状态;Iba1 和 Arg1 免疫荧光双标染色及 Western blot 检测 MGs 中 Arg1 的表达。

结果

倒置相差显微镜观察示 BMSCs 约 14 d 进入对数生长期,Vimentin 免疫荧光染色结果示 98% 以上细胞呈阳性反应;MGs 约 21 d 进入对数生长期,Iba1免疫荧光染色结果示约 80% 细胞呈阳性反应。倒置相差显微镜观察示实验组 MGs 被激活,激活后的 MGs 胞体增大、突起变短、呈阿米巴样变化。免疫荧光染色示实验组 Iba1 阳性细胞显著多于对照组,比较差异有统计学意义(t=0.007,P=0.000);免疫荧光双标染色示实验组 Iba1 和 Arg1 双阳性细胞显著多于对照组,比较差异有统计学意义(t=0.007,P=0.000);Western blot 示实验组 Arg1 蛋白相对表达量显著高于对照组,比较差异有统计学意义(t=0.001,P=0.000)。

结论

BMSCs 条件培养液可激活 MGs,并促进 MGs 表达 Arg1。

Keywords: BMSCs, 小胶质细胞, 精氨酸酶 1, 大鼠


BMSCs 是一种能够自我复制和多向分化的非造血多能干细胞[1]。研究证实 BMSCs 移植治疗神经系统疾病可有效恢复神经功能,其不仅可替代损伤的神经元、分泌多种神经营养和保护因子促进神经功能的康复[2],还可作用于神经胶质细胞,调节胶质细胞的功能[3]。小胶质细胞(microglia,MGs)是中枢重要的免疫调控细胞,参与多种急慢性中枢疾病的损伤和修复过程。BMSCs 移植可能通过调节 MGs 介导的免疫炎性反应发挥神经保护作用[4]。精氨酸酶 1(arginase 1,Arg1)是机体氮代谢的关键酶,参与调控中枢神经系统功能。Arg1 的表达与胶质细胞的激活密切相关,神经损伤应激时胶质细胞活化后,可分泌 Arg1 参与神经保护功能[5-7]。BMSCs 是否可通过调控 MGs 表达 Arg1,从而影响中枢精氨酸代谢和神经功能,目前鲜见报道。因此,本研究拟采用 BMSCs 条件培养液诱导 MGs 分泌 Arg1,观察 BMSCs 对 MGs 的激活及对 Arg1 分泌的影响,为探索 BMSCs 移植治疗神经系统疾病的机制提供参考。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及主要试剂、仪器

新生 3 日内清洁级 SD 大鼠 10 只,体质量 6~12 g,雌雄不限;4 周龄清洁级 SD 大鼠 10 只,体质量 90~100 g,雌雄各半;由成都达硕实验动物有限公司提供。

DMEM/F12 培养基、DMEM 培养基、FBS、0.25%Trypsin-EDTA(GIBCO 公司,美国);青链霉素双抗(HyClone 公司,美国);山羊抗大鼠 Iba1(ARG 公司,美国);兔抗大鼠 Arg1、兔抗大鼠 Vimentin、小鼠抗羊二抗、羊抗兔二抗、Alexa Fluor 488 小鼠抗兔二抗、Cy3 兔抗山羊二抗(北京博奥森生物技术有限公司);兔抗 β-actin 多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司);裂解液、蛋白酶抑制剂、Acr、Tris、EDTA、TEMED、SDS(碧云天生物技术研究所)。

0.2 mm 聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜、电泳仪、半干转膜器、凝胶成像系统(Bio-Rad 公司,美国);T-75 细胞培养瓶、6 孔或 96 孔培养板、移液枪(Eppendorf 公司,德国);倒置荧光显微镜、倒置相差显微镜(Leica 公司,德国);解剖显微镜(Olympus 公司,日本);LAS-3000 化学发光成像系统(FUJIFILM 公司,日本);Image Pro Plus 6.0 图像分析软件(Media Cybernetics 公司,美国)。

1.2. BMSCs 分离培养及鉴定

取 4 周龄 SD 大鼠 10 只,10% 水合氯醛麻醉,断颈处死,75% 乙醇浸泡 15~20 min,迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉,取出股骨及胫骨,PBS 冲洗 3 遍;移入含 DMEM 培养液的培养皿中,移除两端骨骺,暴露骨髓腔,1 000 μL 移液枪冲洗,将骨髓冲入培养皿;将培养液移入离心管,以离心半径 5 cm、1 000 r/min 离心 10 min。弃去上清液,加入含 10%FBS 的 DMEM 培养基重悬细胞,以 100 个/mL 密度接种于 96 孔培养板(每孔 100 μL)和 75 cm2 培养瓶(每瓶 10 mL),37℃、5%CO2 及饱和湿度培养箱培养,每 5~7 天更换 1 次培养基。倒置相差显微镜下观察细胞形态和密度,当细胞密度达 1×106个/mL 时,取 96 孔培养板培养细胞,参照文献[8]方法,采用 Vimentin 免疫荧光染色法鉴定。收集培养瓶内 BMSCs 培养液待用。

1.3. MGs 分离培养及鉴定

取新生 3 日内 SD 大鼠 10 只,75% 乙醇浸泡 15~20 min,断颈取头,取出全脑,解剖显微镜下将脑膜及血管剥离干净,在培养皿内用细胞剪将大脑皮质剪碎至 1 mm×1 mm×1 mm 大小,加入 10 mL 0.25% 胰蛋白酶,放入 37℃ 孵箱,消化 15 min;300 目筛网过滤,收集细胞滤液,以离心半径 5 cm、1 000 r/min 离心 10 min。弃去上清液,加入含 10%FBS 的 DMEM 培养基重悬细胞,以 100 个/mL 密度接种于预先涂布多聚赖氨酸的 75 cm2 培养瓶中,37℃、5%CO2 及饱和湿度培养箱培养。每 2~3 天换液 1 次,培养 10~14 d倒置相差显微镜观察细胞出现明显分层后,将培养瓶置于 200 r/min 摇床上振摇 4 h。收集含 MGs 的培养液,同上法离心 10 min;弃上清,沉淀加入 DMEM/F12 培养液,以 100 个/mL 密度接种于预先涂布多聚赖氨酸的 96 孔或 6 孔培养板,37℃、5% CO2 及饱和湿度培养箱培养。倒置相差显微镜观察细胞形态和密度,当细胞密度达 1×106 个/mL 时,采用 BMSCs 培养液干预 MGs 48 h。取 96 孔培养板培养 MGs,参照文献[9]方法,采用 Iba1 免疫荧光染色法鉴定。

1.4. BMSCs 条件培养液的制备及实验分组

选取对数生长期的 BMSCs,待融合度达 80%~90% 时,血清饥饿 24 h。采用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,以 1×106 个/mL 密度接种于 75 cm2 培养瓶中,加入 10 mL 无血清 DMEM/F12 培养液培养 24 h 后收集上清,用 0.22 μm 滤膜过滤,即得 BMSCs 条件培养液,–20℃ 保存。

取细胞融合率为 85% 的原代 MGs 分为两组,实验组使用含 1×105 U/L 青霉素、100 mg/L 链霉素和 10 μg/L BMSCs 条件培养液的 DMEM/F12 培养基培养,对照组使用不含血清的普通培养基(含 1×105 U/L 青霉素、100 mg/L 链霉素的 DMEM/F12 培养基)培养。取密度为100 个/mL的原代MGs悬液,以2 mL/孔接种于 6 孔培养板,按分组添加相应培养基后,置于 37℃、5%CO2 及饱和湿度细胞培养箱中培养 48 h 后,收集培养 MGs 行以下观测。

1.5. 观测指标

1.5.1. 倒置相差显微镜下观察 MGs 生长情况及形态

倒置相差显微镜下观察并比较两组 MGs 的生长情况及形态。

1.5.2. 免疫荧光染色检测 MGs 中 Iba1 蛋白表达

弃培养液,室温 PBS 清洗 3 次,10 min/次;37℃、4% 多聚甲醛固定 30 min,PBS 清洗 3 次,10 min/次;3% H2O2 37℃ 下透膜 15 min,PBS 清洗 3 次,10 min/次;5% 牛血清白蛋白 37℃ 下封闭 30 min,甩干不清洗;加入山羊抗大鼠 Iba1,4℃ 冰箱内孵育过夜;PBS 清洗 3 次,10 min/次;滴加 Cy3 兔抗山羊二抗 100 μL,37℃ 下避光孵育 1 h;PBS 清洗 3 次,10 min/次;DAPI 染液复染细胞核 10 min,PBS 清洗 3 次,10 min/次;抗荧光淬灭剂封片处理后,倒置荧光显微镜观察 MGs 中 Iba1 的表达,并在 10×10 倍显微镜下随机选取 5 个视野,计数 Iba1 阳性细胞,取均值。实验重复 3 次。

1.5.3. 免疫荧光染色观测 MGs 中 Iab1 和 Arg1 双阳性细胞的表达

弃培养液,方法同前进行封闭后,加入一抗山羊抗大鼠 Iba1、兔抗大鼠 Arg1 100 μL,4℃ 冰箱内孵育过夜;PBS 清洗 3 次,10 min/次;滴加 FITC 标记的 Alexa Fluor 488 小鼠抗兔二抗、Cy3 兔抗山羊二抗 100 μL,37℃ 下避光孵育 1 h;PBS 清洗 3 次,10 min/次;DAPI 染液复染细胞核 10 min,PBS 清洗 3 次,10 min/次;抗荧光淬灭剂封片处理后,倒置荧光显微镜观察 Iba1 与 Arg1 两种蛋白在细胞中的表达情况。其中红色荧光为 Iba1 阳性细胞(MGs),绿色荧光为 Arg1 阳性细胞,若细胞同时表达红色和绿色荧光则提示为 Arg1 阳性的 MGs。并在 10 ×10 倍显微镜下随机选取 5 个视野,计数 Iba1 和 Arg1 双阳性细胞,取均值。实验重复 3 次。

1.5.4. Western blot 检测 MGs 中 Arg1 蛋白表达

弃培养液,预冷 PBS 清洗 2 次;加入含蛋白酶抑制剂裂解液(50 μL/孔)冰上裂解 30 min,细胞刷挂取细胞;收集细胞裂解液于 1 mL 离心管,冰浴 30 min,4℃ 以离心半径 5 cm、15 000 r/min 离心 10 min,回收上清蛋白溶液。行 BCA 法蛋白质定量检测。以 15 μL/孔对蛋白质行 SDS-PAGE 电泳分离,25 V、20 min 半干转至 PVDF 膜,37℃、5% 脱脂牛奶封闭 1 h,加入一抗兔抗 β-actin、兔抗大鼠 Arg1 300 μL,4℃ 冰箱内孵育过夜;TBST 清洗 3 次,10 min/次;加入羊抗兔二抗 300 μL,室温孵育 2 h,TBST 清洗 3 次,10 min/次;ECL 反应液孵育 4 min,透明薄膜密封,以 LAS-3000 化学发光成像系统进行曝光检测。Image Lab 软件分析吸光度(A)值。实验重复 3 次。

1.6. 统计学方法

采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示,组间比较采用独立样本 t 检验;检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. BMSCs 形态学观察及鉴定

倒置相差显微镜观察示,原代 BMSCs 培养 1~3 d 呈圆形,细胞排列疏松;3 d 后细胞呈长梭形,胞体狭窄,胞核区略透光;7 d 后细胞伸出单个或多个细长突起;约 14 d 进入对数生长期。见图 1a。Vimentin 免疫荧光染色示,98% 以上细胞呈阳性反应,绿色荧光表达于细胞内。见图 1b

图 1.

Morphology observation and identification of primary BMSCs

原代 BMSCs 形态学观察及鉴定

a. 培养 14 d 形态学观察(倒置相差显微镜×400);b. Vimentin 免疫荧光染色鉴定(倒置荧光显微镜×400)

a. Morphology observation after 14 days of culture (Inverted phase contrast microscope×400); b. Identification of Vimentin immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×400)

图 1

2.2. MGs 形态学观察及鉴定

倒置相差显微镜观察示,原代 MGs 培养 14 d 时呈明显分层生长状态。经摇床机械分离后,收集含 MGs 的培养液再接种,培养 1~2 d 后,细胞体积较小,呈圆形;3 d 后细胞体积明显增大,呈圆形,胞核区略透光;7 d 后细胞伸出单个或多个细长突起;约 21 d 进入对数生长期。见图 2a。Iba1 免疫荧光染色示,约 80% 细胞呈阳性反应,红色荧光表达于细胞内。见图 2b

图 2.

Morphology observation and identification of primary MGs

原代 MGs 形态学观察及鉴定

a. 培养 21 d 形态学观察(倒置相差显微镜×400);b. Iba1 免疫荧光染色鉴定(倒置荧光显微镜×400)

a. Morphology observation after 21 days of culture (Inverted phase contrast microscope×400); b. Identification of Iba1 immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×400)

图 2

2.3. BMSCs 条件培养液刺激后 MGs 激活的观察

倒置相差显微镜观察示,实验组 MGs 较对照组胞体增大、突起变短、呈阿米巴样变化,提示 BMSCs 可激活 MGs。见图 3

图 3.

Morphology observation of MGs activated by BMSCs conditioned medium (Inverted phase contrast microscope×100)

BMSCs 条件培养液激活 MGs 形态学观察(倒置相差显微镜×100)

a. 对照组;b. 实验组

a. Control group; b. Experimental group

图 3

2.4. 免疫荧光染色检测 MGs 中 Iba1 和 Arg1 蛋白表达

Iba1 免疫荧光染色示,对照组约 60% 细胞呈 Iba1 染色阳性,实验组约 99% 以上细胞呈 Iba1 反应阳性。见图 4。实验组 Iba1 阳性细胞数为(125.778±7.633)个/视野,显著高于对照组的(42.444±5.337)个/视野,比较差异有统计学意义(t=0.007,P=0.000)。

图 4.

Ibal immunofluorescence staining observation of MGs activated by BMSCs conditioned medium (Inverted fluorescence microscope×100)

BMSCs 条件培养液激活 MGs 后 Iba1 免疫荧光染色观察(倒置荧光显微镜×100)

a. 对照组;b. 实验组

a. Control group; b. Experimental group

图 4

免疫荧光双标染色示,Iba1 和 Arg1 均表达于细胞质中。见图 5。实验组 Iba1 和 Arg1 双阳性细胞数为(72.000±1.764)个/视野,显著高于对照组的(24.111±1.900)个/视野,比较差异有统计学意义(t=0.007,P=0.000)。

图 5.

Ibal and Arg1 double-labelling immunofluorescence staining observation of MGs activated by BMSCs conditioned medium (Inverted fluorescence microscope×100)

BMSCs 条件培养液激活 MGs 后 Iba1 与 Arg1 免疫荧光双标染色观察(倒置荧光显微镜×100)

a. 对照组;b. 实验组

a. Control group; b. Experimental group

图 5

2.5. Western blot 检测 MGs 中 Arg1 蛋白表达

Western blot 检测示,实验组 Arg1 蛋白相对表达量为 1.015±0.048,显著高于对照组的 0.569±0.061,比较差异有统计学意义(t=0.001,P=0.000)。见图 6

图 6.

Arg1 protein expression of MGs activated by BMSCs conditioned medium detected by Western blot

Western blot 检测 BMSCs 条件培养液激活 MGs 表达 Arg1 蛋白

1:对照组;2:实验组

1: Control group; 2: Experimental group

图 6

3. 讨论

干细胞具有自我更新和分化的特性,可用于修复多种损伤性疾病,临床运用前景广泛。BMSCs 是较早研究并应用于临床的干细胞,其具有来源广泛、取材容易、体外易于培养并能长期保持多向分化的能力[10]。目前,研究已证实 BMSCs 除可直接影响神经元的存活和功能外,对胶质细胞也有一定调控作用。Gao 等[11]发现 BMSCs 可降低缺血缺氧性损伤后星形胶质细胞的损伤和凋亡,可释放 BDNF、VEGF、FGF 等激活 MAPK 信号通路,促进星形胶质细胞的存活和增殖。Shen 等[12]研究表明 BMSCs 在脑损伤局部可激活星形胶质细胞,活化的星形胶质细胞可促进大脑的可塑性和神经元的修复。提示 BMSCs 多方面调控胶质细胞,既可降低星形胶质细胞的损伤,又可增强星形胶质细胞对脑损伤的保护。

MGs 是神经胶质细胞的一种,是中枢神经系统中的第一道也是最主要的一道免疫防线,数量约占中枢细胞的 10%,参与调控多种神经功能。当脑组织发生损伤时,MGs 可向损伤部位募集,突起伸向损伤部位,对损伤部位发挥吞噬作用。激活的 MGs 发生形态改变,呈阿米巴样变形,胞体增大、突起变短,突起涉及范围更小,能更好地吞噬清除炎性损伤物质及释放抗炎因子[13],并通过清道夫作用及分泌功能消除与重塑神经突触[14]。Shinozaki 等[15]发现采用 MGs 激活抑制剂,可明显降低 MGs 促进星形胶质细胞激活的功能,提示 MGs 的激活是其发挥免疫调控和中枢保护作用的重要前提。我们的研究发现,与对照组相比,BMSCs 条件培养液可明显促进 MGs 的激活,其胞体增大、突起变短、呈阿米巴样变化,Iba1 阳性细胞数显著增加,表明激活 MGs 可能是 BMSCs 移植治疗脑损伤等中枢神经系统疾病的机制之一。其作用机制与 BMSCs 条件培养液内含细胞因子、趋化因子、神经营养因子、神经迁移因子等相关,这些物质不仅可直接保护神经元,还可通过激活胶质细胞间接支持神经元的活性和功能[16]

Arg1 存在于细胞质中,是尿素循环的重要参与者,主要在肝组织中表达,也在脑组织中表达。在细胞因子和抗原的刺激下,Arg1 可在多种组织或细胞类型中表达。研究发现 Arg1 参与中枢神经系统多种神经保护作用,分解精氨酸,促进氨等氧化应激产物的分解和排泄;参与环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)调控 BDNF、神经营养因子 3 等神经营养因子表达,影响神经损伤后髓鞘的再生;增强 cAMP/环磷腺苷效应元件结合蛋白复合体诱导的神经轴突延长[17]。Arg1 也参与中枢多种疾病的发生、发展和转归。脑缺血性损伤时,L-精氨酸的减少可代偿性地导致损伤局部 Arg1 和一氧化碳合成酶的分泌,大量星形胶质细胞和巨噬细胞在损伤局部聚集并分泌 Arg1,而损伤局部 Arg1 的增加是 cAMP 信号环路促进神经再生的重要途径[7]。MGs 是中枢 Arg1 的重要来源,活化的 MGs 可表达 Arg1,表达 Arg1 的 MGs 在老年痴呆病理性 Aβ 斑块附近聚集并表达 BDNF、IGF-1 等神经营养因子,促进受损神经元的修复[18]。我们的研究发现,BMSCs 条件培养液可促进活化后的 MGs 表达 Arg1。其作用机制可能与激活的 MGs 在不同刺激因子作用下表现为不同极化状态有关,激活的 MGs 在 IL-4、IL-10 等细胞因子作用下,通过 TLr4 信号通路向 M2 方向极化而表达 Arg1,发挥神经免疫调控和神经保护作用[19]

综上述,本研究对 BMSCs 条件培养液影响 MGs 的活化及活化后 MGs 表达 Arg1 的功能进行了初步探索。提示 BMSCs 移植除了直接分化补偿损伤的神经元和神经胶质细胞外,还可与 MGs 等神经胶质细胞进行互通,影响 MGs 的功能。但不同浓度梯度的 BMSCs 条件培养液对 MGs 的活化及活化后 MGs 表达 Arg1 的作用效果,有待进一步实验研究明确。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目(81603537、81704160);中国博士后科学基金(2017M612928);四川省科技厅国际科技合作与交流项目(2017HH0004);四川省教育厅项目(17ZA0163)

National Natural Science Foundation of China (81603537, 81704160); Postdoctoral Science Foundation of China (2017M612928); International Cooperation and Exchange Project of Sichuan Provincial Science and Technology Department (2017HH0004); Key Project of Sichuan Provincial Education Department (17ZA0163)

References

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