BMSCs 条件培养液诱导小胶质细胞分泌精氨酸酶 1 的初步研究

Abstract

目的

初步探讨 BMSCs 条件培养液对小胶质细胞（microglia，MGs）激活及其分泌精氨酸酶 1（arginase 1，Arg1）的影响。

方法

取 4 周龄 SD 大鼠股骨和胫骨骨髓，采用差速贴壁法分离培养原代 BMSCs，行 Vimentin 免疫荧光染色鉴定。取新生 3 日内 SD 大鼠全脑，采用胰蛋白酶消化法分离培养原代 MGs，行 Iba1 免疫荧光染色鉴定。收集对数生长期 BMSCs 培养液制备 BMSCs 条件培养液，取原代 MGs，分别使用含 BMSCs 条件培养液的 DMEM/F12 培养基（实验组）和普通 DMEM/F12 培养基（对照组）培养。培养 48 h 后采用倒置相差显微镜观察 MGs 的形态改变；Iba1 免疫荧光染色观察 MGs 激活状态；Iba1 和 Arg1 免疫荧光双标染色及 Western blot 检测 MGs 中 Arg1 的表达。

结果

倒置相差显微镜观察示 BMSCs 约 14 d 进入对数生长期，Vimentin 免疫荧光染色结果示 98% 以上细胞呈阳性反应；MGs 约 21 d 进入对数生长期，Iba1免疫荧光染色结果示约 80% 细胞呈阳性反应。倒置相差显微镜观察示实验组 MGs 被激活，激活后的 MGs 胞体增大、突起变短、呈阿米巴样变化。免疫荧光染色示实验组 Iba1 阳性细胞显著多于对照组，比较差异有统计学意义（t=0.007，P=0.000）；免疫荧光双标染色示实验组 Iba1 和 Arg1 双阳性细胞显著多于对照组，比较差异有统计学意义（t=0.007，P=0.000）；Western blot 示实验组 Arg1 蛋白相对表达量显著高于对照组，比较差异有统计学意义（t=0.001，P=0.000）。

结论

BMSCs 条件培养液可激活 MGs，并促进 MGs 表达 Arg1。

BMSCs 是一种能够自我复制和多向分化的非造血多能干细胞^[1]。研究证实 BMSCs 移植治疗神经系统疾病可有效恢复神经功能，其不仅可替代损伤的神经元、分泌多种神经营养和保护因子促进神经功能的康复^[2]，还可作用于神经胶质细胞，调节胶质细胞的功能^[3]。小胶质细胞（microglia，MGs）是中枢重要的免疫调控细胞，参与多种急慢性中枢疾病的损伤和修复过程。BMSCs 移植可能通过调节 MGs 介导的免疫炎性反应发挥神经保护作用^[4]。精氨酸酶 1（arginase 1，Arg1）是机体氮代谢的关键酶，参与调控中枢神经系统功能。Arg1 的表达与胶质细胞的激活密切相关，神经损伤应激时胶质细胞活化后，可分泌 Arg1 参与神经保护功能^[5-7]。BMSCs 是否可通过调控 MGs 表达 Arg1，从而影响中枢精氨酸代谢和神经功能，目前鲜见报道。因此，本研究拟采用 BMSCs 条件培养液诱导 MGs 分泌 Arg1，观察 BMSCs 对 MGs 的激活及对 Arg1 分泌的影响，为探索 BMSCs 移植治疗神经系统疾病的机制提供参考。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及主要试剂、仪器

新生 3 日内清洁级 SD 大鼠 10 只，体质量 6～12 g，雌雄不限；4 周龄清洁级 SD 大鼠 10 只，体质量 90～100 g，雌雄各半；由成都达硕实验动物有限公司提供。

DMEM/F12 培养基、DMEM 培养基、FBS、0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO 公司，美国）；青链霉素双抗（HyClone 公司，美国）；山羊抗大鼠 Iba1（ARG 公司，美国）；兔抗大鼠 Arg1、兔抗大鼠 Vimentin、小鼠抗羊二抗、羊抗兔二抗、Alexa Fluor 488 小鼠抗兔二抗、Cy3 兔抗山羊二抗（北京博奥森生物技术有限公司）；兔抗 β-actin 多克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；裂解液、蛋白酶抑制剂、Acr、Tris、EDTA、TEMED、SDS（碧云天生物技术研究所）。

0.2 mm 聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、电泳仪、半干转膜器、凝胶成像系统（Bio-Rad 公司，美国）；T-75 细胞培养瓶、6 孔或 96 孔培养板、移液枪（Eppendorf 公司，德国）；倒置荧光显微镜、倒置相差显微镜（Leica 公司，德国）；解剖显微镜（Olympus 公司，日本）；LAS-3000 化学发光成像系统（FUJIFILM 公司，日本）；Image Pro Plus 6.0 图像分析软件（Media Cybernetics 公司，美国）。

1.2. BMSCs 分离培养及鉴定

取 4 周龄 SD 大鼠 10 只，10% 水合氯醛麻醉，断颈处死，75% 乙醇浸泡 15～20 min，迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取出股骨及胫骨，PBS 冲洗 3 遍；移入含 DMEM 培养液的培养皿中，移除两端骨骺，暴露骨髓腔，1 000 μL 移液枪冲洗，将骨髓冲入培养皿；将培养液移入离心管，以离心半径 5 cm、1 000 r/min 离心 10 min。弃去上清液，加入含 10%FBS 的 DMEM 培养基重悬细胞，以 100 个/mL 密度接种于 96 孔培养板（每孔 100 μL）和 75 cm² 培养瓶（每瓶 10 mL），37℃、5%CO₂ 及饱和湿度培养箱培养，每 5～7 天更换 1 次培养基。倒置相差显微镜下观察细胞形态和密度，当细胞密度达 1×10⁶个/mL 时，取 96 孔培养板培养细胞，参照文献[8]方法，采用 Vimentin 免疫荧光染色法鉴定。收集培养瓶内 BMSCs 培养液待用。

1.3. MGs 分离培养及鉴定

取新生 3 日内 SD 大鼠 10 只，75% 乙醇浸泡 15～20 min，断颈取头，取出全脑，解剖显微镜下将脑膜及血管剥离干净，在培养皿内用细胞剪将大脑皮质剪碎至 1 mm×1 mm×1 mm 大小，加入 10 mL 0.25% 胰蛋白酶，放入 37℃ 孵箱，消化 15 min；300 目筛网过滤，收集细胞滤液，以离心半径 5 cm、1 000 r/min 离心 10 min。弃去上清液，加入含 10%FBS 的 DMEM 培养基重悬细胞，以 100 个/mL 密度接种于预先涂布多聚赖氨酸的 75 cm² 培养瓶中，37℃、5%CO₂ 及饱和湿度培养箱培养。每 2～3 天换液 1 次，培养 10～14 d倒置相差显微镜观察细胞出现明显分层后，将培养瓶置于 200 r/min 摇床上振摇 4 h。收集含 MGs 的培养液，同上法离心 10 min；弃上清，沉淀加入 DMEM/F12 培养液，以 100 个/mL 密度接种于预先涂布多聚赖氨酸的 96 孔或 6 孔培养板，37℃、5% CO₂ 及饱和湿度培养箱培养。倒置相差显微镜观察细胞形态和密度，当细胞密度达 1×10⁶ 个/mL 时，采用 BMSCs 培养液干预 MGs 48 h。取 96 孔培养板培养 MGs，参照文献[9]方法，采用 Iba1 免疫荧光染色法鉴定。

1.4. BMSCs 条件培养液的制备及实验分组

选取对数生长期的 BMSCs，待融合度达 80%～90% 时，血清饥饿 24 h。采用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，以 1×10⁶ 个/mL 密度接种于 75 cm² 培养瓶中，加入 10 mL 无血清 DMEM/F12 培养液培养 24 h 后收集上清，用 0.22 μm 滤膜过滤，即得 BMSCs 条件培养液，–20℃ 保存。

取细胞融合率为 85% 的原代 MGs 分为两组，实验组使用含 1×10⁵ U/L 青霉素、100 mg/L 链霉素和 10 μg/L BMSCs 条件培养液的 DMEM/F12 培养基培养，对照组使用不含血清的普通培养基（含 1×10⁵ U/L 青霉素、100 mg/L 链霉素的 DMEM/F12 培养基）培养。取密度为100 个/mL的原代MGs悬液，以2 mL/孔接种于 6 孔培养板，按分组添加相应培养基后，置于 37℃、5%CO₂ 及饱和湿度细胞培养箱中培养 48 h 后，收集培养 MGs 行以下观测。

1.5. 观测指标

1.5.1. 倒置相差显微镜下观察 MGs 生长情况及形态

倒置相差显微镜下观察并比较两组 MGs 的生长情况及形态。

1.5.2. 免疫荧光染色检测 MGs 中 Iba1 蛋白表达

弃培养液，室温 PBS 清洗 3 次，10 min/次；37℃、4% 多聚甲醛固定 30 min，PBS 清洗 3 次，10 min/次；3% H₂O₂ 37℃ 下透膜 15 min，PBS 清洗 3 次，10 min/次；5% 牛血清白蛋白 37℃ 下封闭 30 min，甩干不清洗；加入山羊抗大鼠 Iba1，4℃ 冰箱内孵育过夜；PBS 清洗 3 次，10 min/次；滴加 Cy3 兔抗山羊二抗 100 μL，37℃ 下避光孵育 1 h；PBS 清洗 3 次，10 min/次；DAPI 染液复染细胞核 10 min，PBS 清洗 3 次，10 min/次；抗荧光淬灭剂封片处理后，倒置荧光显微镜观察 MGs 中 Iba1 的表达，并在 10×10 倍显微镜下随机选取 5 个视野，计数 Iba1 阳性细胞，取均值。实验重复 3 次。

1.5.3. 免疫荧光染色观测 MGs 中 Iab1 和 Arg1 双阳性细胞的表达

弃培养液，方法同前进行封闭后，加入一抗山羊抗大鼠 Iba1、兔抗大鼠 Arg1 100 μL，4℃ 冰箱内孵育过夜；PBS 清洗 3 次，10 min/次；滴加 FITC 标记的 Alexa Fluor 488 小鼠抗兔二抗、Cy3 兔抗山羊二抗 100 μL，37℃ 下避光孵育 1 h；PBS 清洗 3 次，10 min/次；DAPI 染液复染细胞核 10 min，PBS 清洗 3 次，10 min/次；抗荧光淬灭剂封片处理后，倒置荧光显微镜观察 Iba1 与 Arg1 两种蛋白在细胞中的表达情况。其中红色荧光为 Iba1 阳性细胞（MGs），绿色荧光为 Arg1 阳性细胞，若细胞同时表达红色和绿色荧光则提示为 Arg1 阳性的 MGs。并在 10 ×10 倍显微镜下随机选取 5 个视野，计数 Iba1 和 Arg1 双阳性细胞，取均值。实验重复 3 次。

1.5.4. Western blot 检测 MGs 中 Arg1 蛋白表达

弃培养液，预冷 PBS 清洗 2 次；加入含蛋白酶抑制剂裂解液（50 μL/孔）冰上裂解 30 min，细胞刷挂取细胞；收集细胞裂解液于 1 mL 离心管，冰浴 30 min，4℃ 以离心半径 5 cm、15 000 r/min 离心 10 min，回收上清蛋白溶液。行 BCA 法蛋白质定量检测。以 15 μL/孔对蛋白质行 SDS-PAGE 电泳分离，25 V、20 min 半干转至 PVDF 膜，37℃、5% 脱脂牛奶封闭 1 h，加入一抗兔抗 β-actin、兔抗大鼠 Arg1 300 μL，4℃ 冰箱内孵育过夜；TBST 清洗 3 次，10 min/次；加入羊抗兔二抗 300 μL，室温孵育 2 h，TBST 清洗 3 次，10 min/次；ECL 反应液孵育 4 min，透明薄膜密封，以 LAS-3000 化学发光成像系统进行曝光检测。Image Lab 软件分析吸光度（A）值。实验重复 3 次。

1.6. 统计学方法

采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. BMSCs 形态学观察及鉴定

倒置相差显微镜观察示，原代 BMSCs 培养 1～3 d 呈圆形，细胞排列疏松；3 d 后细胞呈长梭形，胞体狭窄，胞核区略透光；7 d 后细胞伸出单个或多个细长突起；约 14 d 进入对数生长期。见图 1a。Vimentin 免疫荧光染色示，98% 以上细胞呈阳性反应，绿色荧光表达于细胞内。见图 1b。

图 1.

Morphology observation and identification of primary BMSCs

原代 BMSCs 形态学观察及鉴定

a. 培养 14 d 形态学观察（倒置相差显微镜×400）；b. Vimentin 免疫荧光染色鉴定（倒置荧光显微镜×400）

a. Morphology observation after 14 days of culture (Inverted phase contrast microscope×400); b. Identification of Vimentin immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×400)

2.2. MGs 形态学观察及鉴定

倒置相差显微镜观察示，原代 MGs 培养 14 d 时呈明显分层生长状态。经摇床机械分离后，收集含 MGs 的培养液再接种，培养 1～2 d 后，细胞体积较小，呈圆形；3 d 后细胞体积明显增大，呈圆形，胞核区略透光；7 d 后细胞伸出单个或多个细长突起；约 21 d 进入对数生长期。见图 2a。Iba1 免疫荧光染色示，约 80% 细胞呈阳性反应，红色荧光表达于细胞内。见图 2b。

图 2.

Morphology observation and identification of primary MGs

原代 MGs 形态学观察及鉴定

a. 培养 21 d 形态学观察（倒置相差显微镜×400）；b. Iba1 免疫荧光染色鉴定（倒置荧光显微镜×400）

a. Morphology observation after 21 days of culture (Inverted phase contrast microscope×400); b. Identification of Iba1 immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×400)

2.3. BMSCs 条件培养液刺激后 MGs 激活的观察

倒置相差显微镜观察示，实验组 MGs 较对照组胞体增大、突起变短、呈阿米巴样变化，提示 BMSCs 可激活 MGs。见图 3。

图 3.

Morphology observation of MGs activated by BMSCs conditioned medium (Inverted phase contrast microscope×100)

BMSCs 条件培养液激活 MGs 形态学观察（倒置相差显微镜×100）

a. 对照组；b. 实验组

a. Control group; b. Experimental group

2.4. 免疫荧光染色检测 MGs 中 Iba1 和 Arg1 蛋白表达

Iba1 免疫荧光染色示，对照组约 60% 细胞呈 Iba1 染色阳性，实验组约 99% 以上细胞呈 Iba1 反应阳性。见图 4。实验组 Iba1 阳性细胞数为（125.778±7.633）个/视野，显著高于对照组的（42.444±5.337）个/视野，比较差异有统计学意义（t=0.007，P=0.000）。

图 4.

Ibal immunofluorescence staining observation of MGs activated by BMSCs conditioned medium (Inverted fluorescence microscope×100)

BMSCs 条件培养液激活 MGs 后 Iba1 免疫荧光染色观察（倒置荧光显微镜×100）

a. 对照组；b. 实验组

a. Control group; b. Experimental group

免疫荧光双标染色示，Iba1 和 Arg1 均表达于细胞质中。见图 5。实验组 Iba1 和 Arg1 双阳性细胞数为（72.000±1.764）个/视野，显著高于对照组的（24.111±1.900）个/视野，比较差异有统计学意义（t=0.007，P=0.000）。

图 5.

Ibal and Arg1 double-labelling immunofluorescence staining observation of MGs activated by BMSCs conditioned medium (Inverted fluorescence microscope×100)

BMSCs 条件培养液激活 MGs 后 Iba1 与 Arg1 免疫荧光双标染色观察（倒置荧光显微镜×100）

a. 对照组；b. 实验组

a. Control group; b. Experimental group

2.5. Western blot 检测 MGs 中 Arg1 蛋白表达

Western blot 检测示，实验组 Arg1 蛋白相对表达量为 1.015±0.048，显著高于对照组的 0.569±0.061，比较差异有统计学意义（t=0.001，P=0.000）。见图 6。

图 6.

Arg1 protein expression of MGs activated by BMSCs conditioned medium detected by Western blot

Western blot 检测 BMSCs 条件培养液激活 MGs 表达 Arg1 蛋白

1：对照组；2：实验组

1: Control group; 2: Experimental group

3. 讨论

干细胞具有自我更新和分化的特性，可用于修复多种损伤性疾病，临床运用前景广泛。BMSCs 是较早研究并应用于临床的干细胞，其具有来源广泛、取材容易、体外易于培养并能长期保持多向分化的能力^[10]。目前，研究已证实 BMSCs 除可直接影响神经元的存活和功能外，对胶质细胞也有一定调控作用。Gao 等^[11]发现 BMSCs 可降低缺血缺氧性损伤后星形胶质细胞的损伤和凋亡，可释放 BDNF、VEGF、FGF 等激活 MAPK 信号通路，促进星形胶质细胞的存活和增殖。Shen 等^[12]研究表明 BMSCs 在脑损伤局部可激活星形胶质细胞，活化的星形胶质细胞可促进大脑的可塑性和神经元的修复。提示 BMSCs 多方面调控胶质细胞，既可降低星形胶质细胞的损伤，又可增强星形胶质细胞对脑损伤的保护。

MGs 是神经胶质细胞的一种，是中枢神经系统中的第一道也是最主要的一道免疫防线，数量约占中枢细胞的 10%，参与调控多种神经功能。当脑组织发生损伤时，MGs 可向损伤部位募集，突起伸向损伤部位，对损伤部位发挥吞噬作用。激活的 MGs 发生形态改变，呈阿米巴样变形，胞体增大、突起变短，突起涉及范围更小，能更好地吞噬清除炎性损伤物质及释放抗炎因子^[13]，并通过清道夫作用及分泌功能消除与重塑神经突触^[14]。Shinozaki 等^[15]发现采用 MGs 激活抑制剂，可明显降低 MGs 促进星形胶质细胞激活的功能，提示 MGs 的激活是其发挥免疫调控和中枢保护作用的重要前提。我们的研究发现，与对照组相比，BMSCs 条件培养液可明显促进 MGs 的激活，其胞体增大、突起变短、呈阿米巴样变化，Iba1 阳性细胞数显著增加，表明激活 MGs 可能是 BMSCs 移植治疗脑损伤等中枢神经系统疾病的机制之一。其作用机制与 BMSCs 条件培养液内含细胞因子、趋化因子、神经营养因子、神经迁移因子等相关，这些物质不仅可直接保护神经元，还可通过激活胶质细胞间接支持神经元的活性和功能^[16]。

Arg1 存在于细胞质中，是尿素循环的重要参与者，主要在肝组织中表达，也在脑组织中表达。在细胞因子和抗原的刺激下，Arg1 可在多种组织或细胞类型中表达。研究发现 Arg1 参与中枢神经系统多种神经保护作用，分解精氨酸，促进氨等氧化应激产物的分解和排泄；参与环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）调控 BDNF、神经营养因子 3 等神经营养因子表达，影响神经损伤后髓鞘的再生；增强 cAMP/环磷腺苷效应元件结合蛋白复合体诱导的神经轴突延长^[17]。Arg1 也参与中枢多种疾病的发生、发展和转归。脑缺血性损伤时，L-精氨酸的减少可代偿性地导致损伤局部 Arg1 和一氧化碳合成酶的分泌，大量星形胶质细胞和巨噬细胞在损伤局部聚集并分泌 Arg1，而损伤局部 Arg1 的增加是 cAMP 信号环路促进神经再生的重要途径^[7]。MGs 是中枢 Arg1 的重要来源，活化的 MGs 可表达 Arg1，表达 Arg1 的 MGs 在老年痴呆病理性 Aβ 斑块附近聚集并表达 BDNF、IGF-1 等神经营养因子，促进受损神经元的修复^[18]。我们的研究发现，BMSCs 条件培养液可促进活化后的 MGs 表达 Arg1。其作用机制可能与激活的 MGs 在不同刺激因子作用下表现为不同极化状态有关，激活的 MGs 在 IL-4、IL-10 等细胞因子作用下，通过 TLr4 信号通路向 M2 方向极化而表达 Arg1，发挥神经免疫调控和神经保护作用^[19]。

综上述，本研究对 BMSCs 条件培养液影响 MGs 的活化及活化后 MGs 表达 Arg1 的功能进行了初步探索。提示 BMSCs 移植除了直接分化补偿损伤的神经元和神经胶质细胞外，还可与 MGs 等神经胶质细胞进行互通，影响 MGs 的功能。但不同浓度梯度的 BMSCs 条件培养液对 MGs 的活化及活化后 MGs 表达 Arg1 的作用效果，有待进一步实验研究明确。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（81603537、81704160）；中国博士后科学基金（2017M612928）；四川省科技厅国际科技合作与交流项目（2017HH0004）；四川省教育厅项目（17ZA0163）

National Natural Science Foundation of China (81603537, 81704160); Postdoctoral Science Foundation of China (2017M612928); International Cooperation and Exchange Project of Sichuan Provincial Science and Technology Department (2017HH0004); Key Project of Sichuan Provincial Education Department (17ZA0163)