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Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery logoLink to Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery
. 2017 Dec;31(12):1490–1494. [Article in Chinese] doi: 10.7507/1002-1892.201705055

应用 micro-CT 实现兔坐骨神经显微三维结构可视化研究

Visualization research of three-dimensional microstructure of rabbit sciatic nerve bundles by micro-CT

阿力克 亚穆罕默德· 1, 伊力哈木 伊力扎提· 1, 阿不来提 阿里木江· 1, 玉山 买买艾力· 1, 玉素甫 艾合买提江· 1,*
PMCID: PMC8498269  PMID: 29806393

Abstract

目的

探讨通过 micro-CT 扫描新西兰大白兔坐骨神经标本，利用三维可视化软件 Mimics17.0 重建兔坐骨神经内部显微三维结构。

方法

取 6 只成年新西兰大白兔坐骨神经组织标本分成 A、B 组（n=3），分别用 1%、5%Lugol 液对两组标本染色，于染色 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h 时，行光镜及 micro-CT 观察两组标本的显像变化，将显像良好的 micro-CT 图像序列导入 Mimics 软件，采用三维重建工具重建兔坐骨神经神经显微三维结构。

结果

A 组标本在染色 2.5 h、B 组标本在染色 1.5 h 时，经光镜及 micro-CT 观察可获得较为清晰的显微三维结构图像。图像显示新西兰大白兔的坐骨神经主要分 3 组神经束，且各神经束立体行径相对固定，Mimics 软件测量各神经束横截面积分别为（0.425±0.013）、（0.038±0.007）、（0.242±0.026）mm2，生成的数字化三维模型可在任意横断面观察坐骨神经内部显微结构。

结论

应用 micro-CT 可清晰真实显示兔坐骨神经显微三维结构，为建立大样本量周围神经显微解剖学数据库提供了可靠方法。

Keywords: micro-CT, 坐骨神经, 显微结构, 三维可视化, 兔

周围神经缺损的修复一直是临床棘手问题，自体神经移植是目前治疗金标准，但文献报道[1]只有 40%～50% 患者在自体神经移植后有神经功能恢复。朱家恺等[2]提出，充分了解神经内在显微结构是提高神经修复疗效的首要前提。神经虚拟三维重建技术是深入了解神经内部显微排列结构，全面解读神经功能束功能的重要途径之一，是周围神经研究领域的重要方向。在该领域，目前多采用连续横断面切片染色后，将切片手工拍照整合后导入计算机软件进行三维重建处理。该方法需要大量人工手动完成，存在耗时长、工作繁琐、误差大、生成的数字化模型精度低等问题，无法真实还原神经内部的显微三维解剖结构，不能满足对大样本量周围神经组织标本的内部结构研究要求[3-4]。本研究拟通过对兔坐骨神经采用 1% 及 5%Lugol 液染色，显微镜下观察各时间点染色效果，并通过 micro-CT 扫描获得兔坐骨神经横断面数据，选择成像条件较好的数据导入 Mimics 软件完成三维重建数字模型。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及主要试剂、仪器

成年新西兰大白兔 6 只，雌雄不限，体质量 3.5～4.5 kg，由新疆医科大学动物实验中心提供。4% 多聚甲醛（上海天贺生物科技有限公司）；乌拉坦（上海弘顺生物科技有限公司）；1%、5%Lugol 液（上海榕柏生物技术有限公司）；磷酸缓冲盐溶液（10×PBS，无钙镁；南京森贝伽生物科技有限公司）。Leica M205A 光学显微镜（Leica 公司，德国）；Power shot S70 数码相机（Canon 公司，日本）； 100 型 micro-CT 扫描设备 （Scanco Medical 公司，瑞士）；Mimics17.0 软件（Materalise 公司，比利时）；Image Pro Plus 6.0 图像分析软件（Media Cybernetics 公司，美国）。

1.2. 实验分组及方法

1.2.1. 坐骨神经标本取材及染色

将实验动物按随机数字表法分为 A、B 两组，每组 3 只，耳缘静脉缓慢推入 20% 乌拉坦（5 mL/kg），常规消毒后于双侧股后部作一斜切口，逐层切开皮肤、皮下组织及股二头肌，找到位于深面的坐骨神经。手术显微镜下游离坐骨神经，从双侧梨状肌以远切取坐骨神经各 5 cm，PBS 清洗 3 遍；切取坐骨神经中段标本，每个标本长 0.5 cm，系列乙醇常规脱水后，A、B 组分别用 1% 和 5%Lugol 液室温下染色。

1.2.2. 光镜观察

分别于染色 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h 时，A、B 组各取 3 个标本制备石蜡切片（片厚 4 μm），在 10×光镜下观察照相，图像保存为 TIFF 格式。记录染色后的神经束轮廓是否显示清晰，是否存在染色不均匀、染色过深、过淡等现象。采用 Image Pro Plus 6.0 软件评价两组图像中神经束和结缔组织分辨能力。

1.2.3. micro-CT 扫描及三维重建

分别于染色 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h 时，A、B 组各取 3 个标本装入 micro-CT 标本盒，调节设备参数，设定有效像素：3 μm，电压：67 kVp，扫描层厚：5 μm，电流：197 A，曝光时间：1 232 ms，处理时间：25 ms。将获得的横断面数据以 DICOM 格式保存输出。观察输出图片，定义成像条件良好标准：组织标本完整且无明显萎缩，各神经束与结缔组织存在清晰显影界限。不符合上述标准则为成像条件差。

1.2.4. 建立三维重建数字模型

选取成像条件良好的 DICOM 格式图像序列导入 Mimics 17.0 软件，使用“Mask”工具分别对神经外膜及神经束掩膜操作。调整阈值在 10 000～30 000 区间，寻找最佳显示神经结缔组织及神经束的参数，在冠状位、横截位、矢状位 3 个窗口逐层检查数据图像是否掩膜完整。用“Calculate 3D”工具对上述掩膜图层分别生成三维立体图像后，计算每组神经束横截面积。

2. 结果

2.1. 光镜观察

A 组：染色 0.5～1.5 h，镜下表现为组织染色过浅，标本外周染色深并向中心逐渐变淡；2.0～2.5 h，标本组织染色清晰，组织标本无萎缩，神经束与外膜无明显分离，可见各神经束与其周围结缔组织界限明显；3.0～3.5 h，镜下表现为标本组织萎缩明显，切片可见染色过深且神经束与外膜存在分离，结缔组织聚集成团。

B 组：染色 0.5 h，切片表现为染色过浅，神经束与外膜无分离，标本外周染色深并向中心逐渐变淡；1.0～2.0 h，切片表现为深染，神经束与外膜存在分离，神经束外周结缔组织聚集成团；2.5～3.5 h，切片表现为均一深染，无法分辨神经束与结缔组织。见图 1。

图 1.

Light microscope observation (×10)

光镜观察（×10）

箭头示环形深染的神经外膜组织　a. A 组染色 2.5 h；b. B 组染色 1.5 h

Arrow indicated the deep dyeing ringlike epineurium tissue　a. Group A staining for 2.5 hours; b. Group B staining for 1.5 hours

图 1

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2.2. micro-CT 扫描及三维重建

A 组：染色 0.5～1.5 h，micro-CT 成像组织标本外周呈高密度影，靠近中央部呈低密度影，中央部显示不清；2.0～2.5 h，micro-CT 成像神经束呈高密度且均匀，结缔组织呈低密度，神经束与结缔组织界限清楚且无明显分离；3.0～3.5 h，micro-CT 显示组织标本萎缩，其外周呈不规则形，神经束呈不均匀高密度，其外周可见一个或多个不连续的高密度带状影。

B 组：染色 0.5 h，micro-CT 显示神经组织外周高密度影，神经组织中央部染色不均匀，局部呈低密度影；1.0～2.0 h，micro-CT 显示神经束呈高密度，外膜萎缩成团；2.5～3.5 h，micro-CT 呈现标本均一高密度影，无法分辨神经束与结缔组织。见图 2。

图 2.

Micro-CT observation

micro-CT 观察

箭头示高密度神经束组织，其外周被结缔组织包绕　a. A 组染色 2.5 h；b. B 组染色 1.5 h

Arrow indicated the high density of nerve tissue, around which was wrapped connective tissue　a. Group A staining for 2.5 hours; b. Group B staining for 1.5 hours

图 2

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2.3. 三维重建数字模型建立

结合上述结果，A 组标本染色 2.5 h、B 组标本染色 1.5 h 时，在显微镜及 micro-CT 下均可获得较为清晰的成像效果，可辨认神经束及其结缔组织组成成分，获取组织标本 DICOM 图像序列 6 组，每组标本获得数据 1 000 层，单层图像文件储存空间约 8.2 MB，总计8.2 GB。Mimics 软件下分别调整阈值分割条件为 23 797～27 657、15 991～21 776 时，神经束及结缔组织在冠状位、横截位、矢状位 3 个窗口均可获得较完整的掩膜数据。三维重建长1 cm的神经标本数字模型耗时 2.4～3.3 h，平均 2.8 h；三维模型显示坐骨神经标本主要分为 3 组神经束，横截面积分别为（0.425±0.013）、（0.038±0.007）、（0.242±0.026）mm2，见图 3。生成的数字化三维模型可在任意横断面观察坐骨神经内部显微结构，且观察结果显示各神经束数量及位置相对固定，未发现明显交叉重组现象。

图 3.

The digital models were generated by Mimics software, nerve bundles labelled blue, purple, and red were surrounded by epineurium and connective tissue (yellow)a. Group A staining for 2.5 hours; b. Group B staining for 1.5 hours

采用 Mimics 软件扫描数据生成三维模型，可见蓝色、紫色、红色标记的 3 个神经束，其外周被神经外膜及结缔组织（黄色）包绕

a. A 组染色 2.5 h；b. B 组染色 1.5 h

图 3

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3. 讨论

3.1. 本研究的基本原理及注意事项

本研究基本原理是使用碘剂染色过程中，碘剂在神经束与神经外膜存在不同浓度的分布，造成 X 线不同程度吸收，在 micro-CT 图像中会表现为不同的灰度阈值。Buytaert 等[5]采用碘溶液染色，通过 micro-CT 扫描成功辨认大鼠脑组织、肌肉组织、脂肪组织、神经组织。本研究结果提示，兔坐骨神经组织采用 1%Lugol 液染色 2.5 h、5%Lugol 液染色 1.5 h，可在 micro-CT 扫描下获得较好的软组织分辨能力。

注意事项：① micro-CT 图像无法分辨神经内部感觉束、运动束及混合束，需配合神经组织特殊染色切片结果对神经内部各功能束进一步判定。② micro-CT 获取的神经标本断层数据生成图像文件较大，本研究中扫描单个长度为 5 mm 的神经生成约 1 000 张断层数据，总计 8.2 GB，无法直接批量导入软件进行三维重建工作。Carrera 等[6]研究团队采用 MATLAB 图像工具包，对 20 例志愿者第 3 磨牙 micro-CT 断层数据（有效像素 5 μm）进行裁剪修整后，建立了数字化三维模型。本研究采用 Mimics 软件中“Crop project”工具预先对每张图像数据所需重建图像区域进行裁剪修整，在不改变数据图像分辨率前提下，数据储存空间可由原 8.2 MB 减小至 140 KB，与 Carrera 等研究相比无需掌握复杂的 MATLAB 专业语句，降低了工作站三维重建负荷。

3.2. 组织染色切片法与 micro-CT 扫描法获取神经断层图像比较

组织染色切片法作为标本组织观察常规方法，其技术条件成熟且应用广泛，所需操作仪器设备成本低，操作便捷、速度快，根据标本组织特性可选择多种特殊染色方法，已作为定性临床诊断常规方法。但其仍存在以下不足：① 神经标本包埋组织时需手工添加定位标志物。② 对每张切片按顺序观察并手工拍照记录，难免出现局部组织标本重复拍摄或遗漏等现象。③ 对于不能在一个视野内观察的切片，需要对多张切片图片进行手工拼接合成，工作繁琐且精度低。

micro-CT 扫描法速度快、精度高，扫描全过程神经组织均处于自然状态，且无需添加额外定位标记物即可进行三维重建，扫描图像分辨率高，Zhu 等[7]采用 micro-CT 获取新鲜尸体正中神经断层数据，其分辨率高达 1～2 μm。micro-CT 扫描获取二维断层数据为虚拟的“切片”，标本利用率高，减小了样本间差异，标本经后续处理后可行其他相关检测，即同一份标本可完成两项甚至多项检查。不足之处在于扫描所需设备价格高昂，micro-CT 图像不能直接对神经功能做定性分析，需配合其他实验室检查。Hopkins 等[8]在一项 micro-CT 扫描鼠坐骨神经的研究中，使用硫代硫酸钠溶液对碘染的神经组织行脱碘处理后对其行 HE 染色，结果显示上述方法无细胞毒害作用，且不改变神经轴突直径，同时对后续 HE 染色无显著影响。

3.3. 建立可视化周围神经三维解剖结构重要意义

① 三维重建周围神经解剖结构是建立数字周围神经数据库的基础，是反映各神经束在不同节段的走行及排列分布规律的重要工具，是开展神经转移等修复手术的重要参考依据。陈增淦等[9]对 2 例成年尸体的臂丛标本采用连续冰冻切片法及高分辨率数码照相系统获取二维数码信息后，对臂丛显微结构进行三维重建，形象地展示了臂丛内部神经束的复杂重组过程及各神经束的直径，同时提出建立人臂丛数据库的可行性及重要性。Brill 等[10]提出建立周围神经解剖数据库，以清晰准确地认识神经内部各束支直径及供、受区神经移植吻合端直径等相关解剖学参数，是修复重建手术获得良好效果的前提。② 三维重建周围神经解剖结构是设计具备三维立体结构的神经导管及替代物的重要依据。神经导管内部结构是影响神经修复过程靶向再生连接的重要因素。目前临床上应用的神经导管多为单腔导管，而具有多腔管道或多组纤维结构的神经导管，其结构也多为简单线形或杂乱无序，不能良好地模拟神经内部微观结构，其修复过程存在较大盲目性[11-13]。本研究采用 micro-CT 扫描获得了兔坐骨神经断层数据（分辨率 3 μm，层厚 5 μm），结果表明其内部各神经束走行比较固定，未见明显的神经束交叉融合现象，测量 3 组神经束横截面积分别为（0.425±0.013）、（0.038±0.007）、（0.242±0.026）mm2，该结果与国外研究报道[14-15]基本一致。本研究团队下一步拟以此作为基础，设计具备三维仿生数字化的人工神经导管模型，以期为神经损伤后功能恢复提供良好条件。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（81560357）

National Natural Science Foundation of China (81560357)

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