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. 2017 Dec;31(12):1485–1489. [Article in Chinese] doi: 10.7507/1002-1892.201705006

数字化技术制备大鼠跨区穿支皮瓣微小血管模型的实验研究

Establishment of micro-vessels model of cross-boundary perforator flap in rat via digital technology

曦 杨 1, 永清 徐 1,*, 晓清 何 1, 腾 王 1, 云娇 王 2
PMCID: PMC8498271  PMID: 29806392

Abstract

目的

探讨利用数字化技术建立大鼠跨区穿支皮瓣微小血管模型的可行性及应用价值。

方法

取 8 周龄 SPF 级雌性 SD 大鼠 20 只，体质量 280～300 g，于背部制备面积约 10 cm×3 cm 的跨区穿支皮瓣，然后原位缝合。术后 3、7 d 各取 10 只大鼠，大体观察皮瓣坏死情况并测算皮瓣坏死面积百分比；然后采用明胶-氧化铅溶液行血管灌注，取材行 micro-CT 扫描并血管三维重建，采用 Matlable7.0 软件测算血管总长度及容积。

结果

术后 3 d 皮瓣坏死面积百分比为 19.08%±3.64%，显著低于术后 7 d 的 39.76%±3.76%（t=10.361，P=0.029）。micro-CT 血管三维重建能清晰显示皮瓣微小血管形态变化；术后 3 d 皮瓣血管容积为（1 240.23±89.71）mm3、血管总长度为（245.94±29.38）mm，与术后 7 d 的（1 036.96±88.97）mm3、（143.20±30.28）mm 比较，差异均有统计学意义（t=5.088，P=0.000；t=7.701，P=0.000）。

结论

数字化技术能够可视化观察、客观评估大鼠跨区穿支皮瓣微小血管形态变化，为皮瓣血管模型研究提供技术支持。

Keywords: 跨区穿支皮瓣, micro-CT, 三维重建, 数字化技术, 大鼠

穿支血管进入皮肤组织内构成的血管体及其之间起连接作用的 choke 血管是穿支皮瓣的解剖学基础[1]。穿支血管网络的形态、营养范围及血液动力的变化均会影响皮瓣移植的成活[2-4]，一直以来都是研究的重点。借助动物模型建立，通过大体解剖、血管灌注结合影像学技术的应用[5-6]，临床对穿支血管及 choke 血管的认识不断深入。目前数字化技术能够高保真重现血管网络立体结构，其中具有高空间分辨率及时间分辨率的 micro-CT 已广泛用于各种动物模型微小结构的重建[7-8]，然而用于皮瓣微小血管网络重建研究较少。此外，对于血管形态变化的数字化评估研究也相对较少。为了能够可视化观察、客观评估皮瓣微小血管形态变化，本研究拟利用 micro-CT 重建血管结合 Matlable 软件测量血管相关参数，建立一个数字化穿支皮瓣微小血管模型，并探讨其应用价值，以期为皮瓣血管模型研究提供技术支持。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及主要试剂、仪器

8 周龄 SPF 级雌性 SD 大鼠 20 只，体质量 280～300 g，由陆军军医大学动物中心提供。4% 多聚甲醛（北京中杉金桥生物技术有限公司）；10% 水合氯醛（成都金山化学试剂有限公司）；分析纯级红色氧化铅（上海生工生物工程技术有限公司）；明胶（Sigma 公司，美国）。micro-CT 及扫描成像系统（QuantumFx 公司，美国）；Image-Pro6.0 图像分析软件（美国国立卫生研究院）；Matlable7.0 软件（MathWorks 公司，美国）。

1.2. 明胶-氧化铅溶液制备

取双蒸水 100 mL，恒温水温箱 40℃ 预热 10 min。称取明胶粉末 5 g 加入预热双蒸水中搅拌至溶解。取 80 g 红色氧化铅粉末加入明胶溶液中，迅速搅拌至氧化铅-明胶溶液均匀混合，底部无沉淀。封口常温保存，使用时预热至 40℃。

1.3. 实验方法

由同一术者完成动物模型制备。取 20 只 SD 大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后，取俯卧位，背部剃毛、消毒。于背部中线右侧旁开 2 cm 为皮瓣左界，颈背肩胛连线为上界，腰骶两侧髂脊连线为下界，近腋后线 1～2 cm 为右界，由近心端至远心端，沿深筋膜浅层分离皮下组织，游离显露胸背动脉、肋间下动脉及其分支，逐个结扎其分支后离断，保留髂腰动脉为单穿支供血，获取以右侧髂腰动脉穿支为血管蒂、面积约 10 cm×3 cm 的跨区皮瓣，包括右侧胸背、肋间（后）下、髂腰等动脉血管体区。彻底止血后原位缝合皮瓣。术后单笼喂养。见图 1。

图 1.

Schematic design of cross-boundary perforator flap

跨区穿支皮瓣设计示意图

a. 黑色箭头示右髂腰动脉穿支；b. 制备跨区穿支皮瓣；c. 原位缝合皮瓣

a. Black arrow indicated the perforator of right iliolumbar artery; b. Cross-boundary perforator flap was harvested; c. Flap was sutured in situ

图 1

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1.4. 观测指标

1.4.1. 皮瓣坏死面积测量

术后 3、7 d 各取 10 只大鼠，大体观察皮瓣坏死情况，照相后将图像导入 Image-Pro6.0 图像分析软件，测量并计算皮瓣坏死面积百分比。

1.4.2. micro-CT 扫描并血管三维重建

术后 3、7 d 大体观察后，大鼠行心脏-主动脉穿刺术，以明胶-氧化铅溶液全身血管灌注；灌注压力为 10.78 kPa。冷水冲洗标本后，置于 4℃ 冷藏 24 h。按原手术范围切取皮瓣组织，行 micro-CT 血管三维重建。扫描参数：电压 90 kV、电流 160 μA、扫描窗 73 mm、扫描时间 2 min、阈值 3 000～3 200；以 Dicom 格式保存原始数据，内置成像系统行三维图形重建。

将 Dicom 格式原始数据导入 Matlable7.0 软件，利用阈值分割方法将血管分割出来，在此基础上计算血管容积；提取血管三维体素，将血管骨架化后进行拓扑结构转化，在此基础上计算血管总长度。

1.5. 统计学方法

采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. 皮瓣坏死面积比较

术后 3 d 皮瓣坏死面积百分比为 19.08%±3.64%，显著低于术后 7 d 的 39.76%±3.76%，比较差异有统计学意义（t=10.361，P=0.029）。见图 2。

图 2.

General observation of flap

皮瓣大体观察

a. 术后 3 d；b. 术后 7 d

a. At 3 days after operation; b. At 7 days after operation

图 2

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2.2. micro-CT 扫描并血管三维重建

明胶-氧化铅造影后行 micro-CT 血管三维重建，可以清晰显示皮瓣微小血管网络形态，以及跨区供血的穿支血管、血管体区所属的穿支及其之间相互连接的 choke 血管。与术后3 d 相比，术后 7 d 远离蒂部穿支的“潜在供区”血管体区的血管密集程度低，血管连续程度差。见图 3。测量显示，术后 3 d 皮瓣血管容积为（1 240.23±89.71）mm3、血管总长度为（245.94±29.38）mm，与术后 7 d 时的（1 036.96±88.97） mm3、（143.20±30.28） mm 比较，差异均有统计学意义（t=5.088，P=0.000；t=7.701，P=0.000）。

图 3.

Images of three-dimensional reconstruction of vessels

血管三维重建图像

a. 术后 3 d　Ⅰ：潜在供区、Ⅱ：血流动力学供区、Ⅲ：解剖学供区　黄色箭头示胸背动脉、蓝色箭头示肋下动脉、红色箭头示髂腰动脉；b. 术后 7 d 潜在供区血管变化（箭头）；c. Matlable7.0 软件利用阈值分割方法分割血管，计算血管容积；d. Matlable7.0 软件将血管骨架化，计算血管总长度

a. At 3 days after operation　Ⅰ: Potential territory, Ⅱ: Dynamic territory, Ⅲ: Anatomic territory; Yellow arrow indicated thoracodorsal artery, blue arrow indicated subcostal artery, red arrow indicated iliolumbar artery; b. The changes of vessels in potential territory at 7 days after operation (arrow); c. Threshold segmentation via Matlable7.0 software; d. Vessels structuring via Matlable7.0 software

图 3

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3. 讨论

3.1. 跨区供血皮瓣动物模型血供特点

穿支血管跨区供血可划分为“解剖学供区、血流动力学供区和潜在供区”[9]。各供区之间由 choke 血管相连，当皮瓣切取后由于通过该血管阻力逐渐增大，血供无法向更远端的“潜在供区”延伸发生坏死[10-11]，使得穿支皮瓣的切取范围受到限制。因此建立由单穿支供血、跨 3 个血管体区皮瓣是研究 choke 血管及皮瓣成活的理想模型。既往研究表明[12]，以单一穿支血管蒂为中心可放射性地完整带动其周围多个第 2 血管供区，在一个方向上血供能到达的最远距离是第 3 血管供区的穿支入皮点。依据皮瓣解剖学的特点，本实验选择的跨区穿支皮瓣模型包含以髂腰动脉为解剖学供区、肋下动脉为血流动力学供区、胸背动脉为潜在供区的 3 个血管体区，以及其间 2 个 choke 血管区。手术切断胸背动脉、肋下动脉及其分支，仅保留髂腰动脉为单穿支血管蒂作为跨区穿支皮瓣的唯一血供来源；在不同干预条件下，胸背动脉区与肋下动脉区之间的 choke 血管开放与否均可影响潜在供区皮瓣组织的成活。测量结果显示，术后 3 d 皮瓣坏死面积百分比显著小于 7 d 时，提示该模型在无任何干预下，随时间延长皮瓣逐渐出现恒定坏死，与跨区穿支皮瓣“潜在供区”常发生坏死现象相符。因此，该跨区穿支皮瓣是理想的研究模型。

3.2. 数字化模型的可行性及应用价值

micro-CT 采用锥形 X 线束，可提高射线采集速度及利用率，分辨率可达到微米级别[13-14]，目前已成功运用于各类器官组织微小血管的成像中，并获得良好的可视化结果[15-17]。明胶-氧化铅血管灌注是用于血管成像经典有效方法[18]，本研究利用 micro-CT 的成像优势，利用 Matlable7.0 软件计算提取血管参数，建立了数字化大鼠跨区穿支皮瓣血管三维重建模型。通过获得的图像，能够更清晰观察皮瓣血管网络的变化，同时进行客观评估。在图像重建中，阈值决定了造影剂显影的清晰度。阈值较低时可显示较细的血管，其周围非血管部分的体素也会显影，但是大血管显影可能失真；反之，微小血管可能无法显影。在 QuantumFX PE 型 micro-CT 中，我们通过筛选，发现在阈值 3 000～3 200 范围内，可获得模型 3 个血管体区、2 个 choke 血管区血管形态的图像，同既往的二维血管造影观察不同，micro-CT 的重建还能够更清晰显示两时间点间模型血管形态差异。

既往学者们通过排水计量法、灰度谷峰比计算、激光多普勒等对血管营养范围、choke 血管变化及皮瓣术后血流动力的变化进行了研究[10, 19-20]，但是利用数字化技术测算血管计量参数的方法较少。本研究采用 Matlable7.0 软件计算血管总长度及容积，量化微小血管的形态学变化，从而起到更加精确、客观评估作用。利用 Matlable 软件阈值分割方法，能够将血管从 CT 阈值中提取；在此基础上，根据体积=体素×图像分辨率×层间距值，计算血管网的体积；对提取出的血管从三维中去除冗余的点，用单像素连接保持原有的三维形态进行骨架化，转化为分支和邻接点的表示方式，同时去噪音；在此基础上，根据血管网长度=所有连接点及分支节点的总数，计算血管网的总长度。血管容积分数是血管容量的直接反应，表示整体微血管网络中所能容纳的血容量，可间接反应皮瓣微血管的扩张程度及血管的通畅度。血管总长度是在整体扫描窗内提取连续性穿支主干及其分支网络血管中心轴线，将其长度累计相加所得，能间接反映皮瓣微血管网络的连续性以及密集程度，即血管连接密度。本研究观测结果显示，术后 7 d 时“潜在供区”的皮瓣坏死，三维图像上显示血管连接度及密度均下降，同时血管容积和血管总长度降低，Matlable 软件提取的血管参数与大体标本上皮瓣坏死、micro-CT 血管形态变化相符合。

综上述，以髂腰动脉为单穿支血管蒂的跨 3 个血管体区的大鼠背部皮瓣模型是理想的跨区穿支皮瓣模型。明胶-氧化铅灌注结合 micro-CT 三维血管重建技术，可以清晰观察到离体皮瓣微小血管形态，Matlable7.0 软件提取血管计量参数与大体标本上皮瓣坏死、micro-CT 血管形态变化相符合。数字化技术能够可视化观察、客观化评估皮瓣微小血管形态变化，为皮瓣血管模型研究提供技术支持。然而，由于实验技术的限制，本研究未能实现在体模型的血管重建。不同个体的离体标本在一定程度上会影响实验对象的同质性，不能够连续、动态观察血管形态变化。因此，在下一步实验中我们将探寻活体血管造影，并以 micro-CT 及 Matlable 软件为技术支持开发出更多客观、全面的血管评估参数，以期建立一个更加理想的数字化皮瓣血管模型，应用于穿支皮瓣切取及成活的基础与临床研究。

Funding Statement

全军后勤科研计划面上项目（CCD14J003）；全军后勤科研计划重大专项（AWS14C003）

General Program of Logistics Science Foundation of Chinese PLA (CCD14J003); Major Program of Logistics Science Foundation of Chinese PLA (AWS14C003)

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