蛋白酶激活受体 2 在骨关节炎发病机制中的研究进展

Abstract

目的

综述蛋白酶激活受体 2（protease-activated receptor 2，PAR-2）在骨关节炎（osteoarthritis，OA）发病机制中的研究进展。

方法

广泛查阅近年国内外有关 PAR-2 在 OA 发生发展过程中作用机制的文献，并进行综合分析。

结果

PAR-2 的异常激活在 OA 发生发展过程中发挥重要作用。激活的 PAR-2 可以通过调节炎性因子、代谢因子、致痛因子等的生成及释放，参与 OA 关节软骨、软骨下骨及滑膜的生理和病理变化以及疼痛的产生与传导。

结论

PAR-2 参与 OA 的发生发展已被证实，但由于 PAR-2 的复杂性以及分布的广泛性，需对其在 OA 进程中的具体作用及各通路间的相互影响进行深入研究，阐明 PAR-2 参与 OA 病变过程的潜在病理生理机制，以期探索新的有效控制 OA 发生的作用靶点。

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是临床常见的慢性退行性疾病，主要特征是关节软骨退行性改变和丢失，其退变的速度超过修复及再生的速度，同时伴有软骨下骨损伤及滑膜炎症^[1]。传统观点认为 OA 与衰老、性别、应力损伤等因素有关^[2]。随着研究的深入，越来越多的证据表明该病还与代谢性和炎症性因素等密切相关^[3]。炎性因子最先产生于 OA 关节滑膜，随后这些炎性因子经滑液扩散到软骨，其中 IL-1β、IL-6、IL-17 和肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）与 OA 关系最密切^[4]。

近年研究发现，蛋白酶激活受体（protease-activated receptor，PAR）通过影响软骨和滑膜的炎性反应，以及软骨基质分解与合成代谢的平衡，参与 OA 的发生和发展，其中 PAR-2 起着关键性作用^[5-8]。现对 PAR-2 与 OA 之间关系的研究进展进行总结。

1. PAR-2 概述

PAR 属于 7 次跨膜 G 蛋白偶联受体家族，包含 PAR-1、PAR-2、PAR-3、PAR-4 4 个亚型，分别具有不同的 N-末端裂解位点，并具有特殊的激活机制。当 PAR 的 N 端经丝氨酸蛋白酶裂解后又产生新的 N 端，称为系锁配体，系锁配体与细胞外袢相互作用激活 PAR^[9]。PAR-1、PAR-3 和 PAR-4 的主要激活剂是凝血酶^[10]，PAR-2 的激活剂包括胰蛋白酶、类胰蛋白酶、因子Ⅶa 和Ⅹa，以及人 PAR-2 激活肽（丝-亮-异亮-甘-赖-缬氨酸，SLIGKV）、鼠 PAR-2 激活肽（丝-亮-异亮-甘-精-亮氨酸，SLIGRL）等，其中胰蛋白酶是最有效的 PAR-2 激活剂^[11]。

PAR-2 是第 2 个被发现的 PAR，Nystedt 等^[12]从小鼠基因组文库中分离出 1 个编码 G 蛋白偶联受体的 DNA 序列，该 DNA 序列在爪蟾卵母细胞中表达的产物在结构上虽与 PAR-1 类似，但不能被凝血酶激活，可以被低浓度的胰蛋白酶和鼠 PAR-2 激活肽（SLIGRL）激活，因此首次将其命名为 PAR-2。胰蛋白酶裂解 PAR-2 的位置为 R³⁴↓S³⁵LIGKV，N 端被裂解后，PAR-2 暴露出新的 N 端，即系锁配体（SLIGKV），并与受体进行分子内结合产生跨膜转导的信号，从而发挥系锁配体的功能。系锁配体激活受体是独立进行的，不再需要蛋白酶参与^[13]。暴露的系锁配体能持续作用于受体，而 PAR-2 信号转导是非持续性的，因此 PAR-2 具有灭活机制，以防止其过度激活。此外，当受到激活剂持续或反复刺激时，PAR-2 对激活剂的反应性下降，即受体脱敏。然而为了维持 PAR-2 对激活剂的反应性，灭活或脱敏的受体还具有恢复敏感性的机制，即复敏^[14]。

目前，国内关于 PAR-2 的研究主要集中于心血管系统、呼吸道、胃肠组织等方面^[15-17]。而据国外研究报道，PAR-2 在软骨细胞、成骨细胞等骨组织^[18-20]及滑膜^[21]中也有表达，并且是 PAR 家族中唯一被证明参与了炎性反应过程以及包含 OA 在内骨关节疾病的成员^{[6, 21-23]}。

2. PAR-2 在 OA 发生和发展中的作用

PAR-2 激活剂可以引起野生型小鼠发生关节肿胀和血管扩张等炎症改变，而在 PAR-2 基因敲除小鼠关节炎模型中几乎没有发现类似的表现^[22]，表明 PAR-2 的异常激活可以引起关节病变，有助于 OA 的发生与发展。PAR-2 的激活可以增加细胞内磷酸肌醇和钙的含量，激活 ERK1/2 和 NF-κB 信号通路^[24-25]，继而刺激细胞增殖以及 IL-1、TNF-α、IL-6、IL-8、粒细胞集落刺激因子、血管细胞黏附分子 1、前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）等促炎因子的释放^[26-28]，同时也有基质金属蛋白酶 1（matrix metalloproteinases 1，MMP-1）和 MMP-13 的激活^[8]。

2.1. PAR-2 对软骨的影响

Huesa 等^[29]通过对 PAR-2 基因缺失型和野生型小鼠 OA 模型的研究发现，人 PAR-2 转染可以加重小鼠软骨的损伤以及导致骨赘形成，但未发现骨硬化，其原因可能是 PAR-2 通过直接促进软骨增生与肥大导致骨赘的形成，表明了骨和软骨的 OA 相关性改变有赖于 PAR-2 的作用，并受 PAR-2 的调节。此外，Milner 等^[30]研究表明，PAR-2 在 OA 软骨中是蛋白裂解酶作用的靶点，抑制 PAR-2 的表达可以有效阻断蛋白裂解酶诱导的胶原溶解，减轻软骨的损伤。因此，PAR-2 在 OA 进展过程中对软骨有重要影响。

2.1.1. PAR-2 与促炎因子

目前，关于 PAR-2 在 OA 中作用的研究相对较少。然而可以肯定的是，PAR-2 在人类 OA 关节软骨中有表达，并且其表达受促炎因子的影响^[8]。

促炎因子在 OA 进展过程中发挥着关键作用，其中 IL-1β、TNF-α 在 OA 发病进程中的促炎作用已得到证实^[31-33]。人软骨细胞分泌的促炎因子包括 NO、PGE2、IL-1β、TNF-α、IL-6 和 IL-8^[34]等，其中可以显著增加 OA 软骨细胞中 PAR-2 及其蛋白合成的促炎因子为 IL-1、TNF-α 以及 PGE2^[8]。分泌促炎因子的软骨细胞位于无血管无神经的软骨陷窝内，通过自分泌和旁分泌的方式参与软骨细胞的分解代谢，进而导致 OA 软骨的进行性损伤^[34]。因此，由 OA 软骨细胞产生和分泌的 IL-1 和 TNF-α^[35]可能会通过自分泌及旁分泌的方式，刺激软骨细胞中 PAR-2 的表达^[6]。还有研究发现，在 OA 患者滑膜液中炎性因子 IL-1 和 TNF-α 的影响下，OA 软骨细胞表达的 PAR-2 同样高于正常细胞^[6]。在体外培养 OA 软骨的实验中，PAR-2 的表达也受 IL-1β、TNF-α 及 PAR-2 激活剂的影响^[36]。

Xiang 等^[6]研究发现，PAR-2 mRNA 是唯一在人软骨细胞中表达的 PAR mRNA。在人软骨细胞和体外培养的软骨细胞中 IL-1 和 TNF-α 都可以上调 PAR-2 mRNA 的表达。然而正常软骨细胞和 OA 软骨细胞对 IL-1β、TNF-α 表现出不同的反应性，为了探讨 IL-1β 对不同软骨细胞中 PAR-2 mRNA 表达的影响，他们用浓度为 10 ng/mL 的 IL-1β 分别刺激体外培养的正常和 OA 软骨细胞 12、24、48 h。比较两组细胞中 PAR-2 mRNA 的表达水平以及增长倍数，发现 OA 软骨细胞对 IL-1β 的敏感性明显高于正常软骨细胞，其原因可能是损伤的 OA 软骨受到包括炎性因子在内的诸多因子的影响。在 12 h 时，OA 软骨细胞中 PAR-2 mRNA 的表达增加 10.5 倍，正常软骨细胞中 PAR-2 mRNA 的表达增加 5 倍。各时间点结果显示，IL-1β 均上调了 OA 软骨细胞中 PAR-2 mRNA 的表达，尽管在 24 h 以后上调作用减弱。而在 IL-1β 刺激的正常软骨细胞中，PAR-2 mRNA 的表达在 24 h 均减少。而 TNF-α 则主要上调 OA 软骨细胞中 PAR-2 mRNA 的表达，对正常软骨细胞中 PAR-2mRNA 的表达无显著影响。因此可以认为 PAR-2 可能介导了 IL-1β 和 TNF-α 在 OA 发生发展过程中的促炎作用。

2.1.2. PAR-2 与代谢性细胞因子

TGF-β 既可以促进炎性细胞活化、浸润，也可以促进血管增生、组织修复，TGF-β 表达异常会导致软骨发生 OA 样改变^[37]。研究表明，TGF-β 可以上调正常软骨细胞中低表达的 PAR-2，下调 OA 软骨中过度表达的 PAR-2。更重要的是，正常软骨细胞和 OA 软骨细胞受 TGF-β 干预后 PAR-2 的表达量接近相同水平。这些研究结果表明 TGF-β 调节合成代谢作用的部分机制为调节正常软骨细胞和 OA 软骨细胞中 PAR-2 的表达。据此可知 TGF-β 具有平衡软骨细胞中 PAR-2 的作用，增加正常软骨细胞中 PAR-2 的表达以增加骨转换，抑制 OA 软骨中 PAR-2 表达来延缓软骨退变^[6]。然而 Boileau 等^[8]却得出不同的研究结果，TGF-β₁ 在 OA 软骨细胞中具有促进 PAR-2 及其蛋白表达的作用，而在 OA 软骨培养体中无此作用，原因可能是 TGF-β₁ 被包裹在 OA 软骨培养体的细胞外基质中，使其无法作用于软骨细胞。尽管各研究的结果不尽相同，但却证明了 PAR-2 介导了 TGF-β 对 OA 软骨退变的影响。

已有研究证明，参与 OA 早期软骨结构改变的酶主要是 MMP^[38]。在正常软骨中，MMP 与其抑制物处于稳态，而在 OA 中这种平衡被打破^[39]。Boileau 等^[8]首次阐明了人 OA 软骨细胞中激活的 PAR-2 可以促进分解代谢性因子 MMP-1 和 MMP-13 的合成，这些因子参与 OA 的发展，并且受 Erk1/2 和 p38 信号通路的调节。MMP-1 是分解骨质主要成分Ⅰ型胶原的关键酶^[40]。MMP-13 则主要降解Ⅱ、Ⅳ、Ⅸ型胶原蛋白及蛋白多糖、骨粘连蛋白、软骨基底膜聚糖等，这些物质都是软骨基质的组成成分^[41]。此外，呼吸道上皮细胞和前列腺癌细胞中的 PAR-2 也可能刺激 MMP 和类似于胰蛋白酶的物质产生，导致软骨的退变^[6]。

2.2. PAR-2 对软骨下骨的影响

研究表明，PAR-2 在 OA 软骨下骨成骨细胞中的含量明显高于正常软骨下骨成骨细胞中的含量，过多的 PAR-2 激活使得骨吸收程度高于骨形成，进而导致骨重建的不平衡^[42]。由于 MAP 激酶 ERK1/2 和 JNK 在成骨细胞中对多种刺激的反应过程受激活的 G 蛋白偶联受体调节^[43]，因此 PAR-2 对人 OA 成骨细胞的调节作用是由 ERK1/2 和 JNK 介导的^[42]。

软骨下骨成骨细胞中激活的 PAR-2 可以增加软骨下骨中 MMP-1 和 MMP-9 的合成，还可以诱导炎性因子 RANKL 和 IL-6 的产生^[42]。MMP-9 既能以促进破骨细胞迁移的方式参与骨的吸收^[44]，也能以类似于胶原酶的方式作用于胶原^[45]。RANKL 和 IL-6 可以促进破骨细胞的生成与激活进而参与骨吸收^[46-47]。RANKL 被认为是破骨细胞增殖分化和活化所必须的关键调控因子^[48]。OA 软骨下骨中 RANKL 的合成受 OPG/RANKL 的影响，OPG/RANKL 异常会增加 RANKL 的合成^[49-50]，而激活的 PAR-2 对正常成骨细胞和 OA 成骨细胞 OPG 的合成没有影响^[42]，从而可以认为激活的 PAR-2 诱导 RANKL 合成增加是导致 OPG/RANKL 异常的原因。IL-6 可以作用于前破骨细胞直接促进骨吸收^{[48, 51]}，也可以协同 PGE2 通过增加 RANKL 的水平来调节破骨细胞的分化，间接促进骨吸收^[52]。因此，表明 PAR-2 参与破骨细胞调节骨吸收过程中也有 RANKL 和 IL-6 的介导^[42]。

2.3. PAR-2 对滑膜的影响

滑膜炎参与 OA 发生，并且与 OA 的严重程度相关^[53]。膝关节 OA 患者中活动性滑膜炎发生率高达 90% 以上^[54]，并且增加 OA 和非 OA 软骨的丢失，加速 OA 进展^{[53, 55-56]}。在 OA 患者中，滑膜炎严重程度和 PAR-2 的表达水平密切相关^[57]。

PAR-2 不仅表达于软骨细胞^[6]，也存在于滑液和滑膜细胞中^{[21, 23, 58]}，在慢性炎症中有广泛作用。Tindell 等^[57]研究显示，PAR-2 的表达与滑膜厚度、单核细胞渗出有密切相关性。PAR-2 可以调节滑膜释放促炎因子 IL-1β，进而致软骨细胞分解代谢^[59]。在 OA 患者的滑液中促炎因子 IL-1β 含量明显升高，OA 的严重程度与 IL-1β 含量成正相关^[58]。在炎性反应过程中，IL-1β 和 TNF-α 产生增加，不仅对软骨细胞有作用，而且也可以诱导滑膜细胞产生其他炎性因子，比如 IL-8、IL-6、白细胞抑制因子，还可以刺激蛋白酶和 PGE2 的合成^[60-61]。PAR-2 抑制剂则能减少 OA 滑膜细胞中促炎因子 TNF-α 的产生，并有剂量依赖性^[57]。这也证明了 PAR-2 通过调节促炎因子的产生参与了滑膜炎发生发展。

2.4. PAR-2 与疼痛

PAR-2 基因缺失型小鼠 OA 模型与野生型小鼠 OA 模型相比，前者对伤害性刺激的敏感性降低^{[29, 62]}，表明 PAR-2 与 OA 相关性疼痛有关，并且具有减轻 OA 相关性疼痛的作用。

Vergnolle 等^[62]研究表明，PAR-2 激活剂可以刺激疼痛性神经元产生作用于初级脊髓传入神经元的信号，引起显著和持续的痛觉过敏。产生痛觉过敏的原因可能是疼痛性神经元中 PAR-2 激活后，导致 P 物质和降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）局部释放。研究发现，在 OA 动物模型脊髓中，P 物质和 CGRP 的含量均增加^[63]。P 物质和 CGRP 来源于疼痛性神经元，在大鼠的背根神经节中有超过 60% 的疼痛性神经元表达 PAR-2^[7]。P 物质和 CGRP 是痛觉及痛觉过敏产生所必需的物质，P 物质是一种强致痛物质，当释放入关节滑膜组织中时可以直接激活滑膜组织中的痛觉感受器（C 类纤维），并且 P 物质的这些活性会因 CGRP 的存在而增强，两者呈现协同作用^[64]。此外，前列腺素及其 NK-1 受体还能增加脊髓背角神经元对 PAR-2 激活剂的敏感性^[62]。OA 关节内释放出的 P 物质、前列腺素可以增加神经敏感性以及使中枢疼痛通路过敏^[65]，同时也增加关节外周感受器对机械痛阈的敏感性^[66]，从而使正常刺激出现疼痛的感觉。

另一个关于 PAR-2 激活剂参与激活疼痛通路的证据来源于 Fos 蛋白表达的研究。Fos 蛋白作为神经性疼痛标志物，与疼痛敏化或持续状态相关^[67]，并且在脊髓水平反映伤害性刺激的有效性^[68]。大鼠足底注射低于致炎剂量的 PAR-2 激活剂可以显著增加 Fos 的表达，表明 PAR-2 激活了可以释放 Fos 的疼痛性神经元^{[62, 69]}。Ray 等^[70]研究了狗髋关节发育不良所致 OA 模型的软骨组织，发现狗 OA 软骨中 c-Fos 高表达。李良军等^[71]的研究也观察到轻中度退变的软骨中 Fos 表达明显增强。此外，PAR-2 还能与瞬时受体电位香草酸亚型 1（transient receptor potential vanillic acid subtype 1，TRPV1），也称辣椒素受体，共表达于背根神经节，参与疼痛和痛觉过敏^[72]。在 OA 患者滑膜成纤维细胞和软骨细胞已经发现有 TRPV1 表达^[73-74]，并且在膝关节 OA 大鼠模型初级传入神经元中 TRPV1 的表达增高^[75]。在实验研究及临床研究中均发现 TRPV1 参与 OA 相关疼痛的产生与传导，并且 TRPV1 拮抗剂具有减弱 OA 相关性疼痛的作用^[76-77]。由此可以认为 PAR-2 和 TRPV1 共同参与了 OA 相关性疼痛的产生与传导。

这些研究均表明 PAR-2 通过调节致痛性物质的合成与释放，参与包括 OA 相关性疼痛在内的疼痛产生与传导。在 OA 治疗过程中以 PAR-2 为治疗靶点，不仅可以减缓其病理进展，也能缓解其疼痛反应^[78]。

3. 小结与展望

PAR-2 参与 OA 的发生发展已被广泛证实。大量研究显示，OA 软骨、软骨下骨及滑膜的各种生理病理变化中都有 PAR-2 参与，并且通过直接或间接途径发挥重要作用。OA 软骨损伤病理过程中，炎性因子的产生、细胞基质的过度降解、细胞凋亡及疼痛的产生等过程都与 PAR-2 的异常激活与信号转导密切相关。PAR-2 的致病机制可能与这种受体驱动软骨细胞病理性分化、增殖的作用有关。以 PAR-2 为治疗靶点，其作用可能不仅在于保护 OA 关节的结构，还能缓解关节的炎性疼痛。

Funding Statement

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