多孔磷酸钙/骨基质明胶复合骨水泥修复兔腰椎骨缺损的实验研究

Abstract

目的

探讨多孔磷酸钙/骨基质明胶复合骨水泥（以下简称多孔复合骨水泥）修复兔腰椎骨缺损的效果。

方法

采用 Urist 等的方法制备成年新西兰兔骨基质明胶（bone matrix gelatin，BMG），参考 W/O/W 复乳法制作聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic）acid，PLGA]空白微球，将 PLGA 空白微球和 BMG 与磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）复合，构建多孔复合骨水泥。通过体外抗溃散观察、孔隙率测定及生物力学试验，观察其理化特性；并以 CPC 作对照。取 30 只 2 月龄新西兰兔，制备 L₃ 椎体大小为 4 mm×3 mm×3 mm 的骨缺损后，分别填入多孔复合骨水泥（实验组，n=15）和 CPC（对照组，n=15）。术后第 4、8、12 周， X 线片观察骨融合情况，micro-CT 分析骨密度（bone mineral density，BMD）、骨体积分数（bone volume fraction，BVF）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb. Th.）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N.）和骨小梁分离度（trabecular spacing，Tb. Sp.），组织学观察新生骨形成情况。

结果

两种骨水泥均有较好抗溃散性，多孔复合骨水泥孔隙率为 55.06%±1.18%，抗压强度为（51.63±6.73）MPa，与 CPC的孔隙率（49.38%±1.75%）以及抗压强度（63.34±3.27）MPa 相比，差异有统计学意义（t=4.254，P=0.006；t=2.476，P=0.034）。X 线片观察示，随时间延长，两组材料与宿主之间的边界逐步模糊，且实验组第 12 周时边界已消失、对照组仍可见。micro-CT 检测各时间点实验组 BMD、BVF、Tb. Th.、Tb. N.以及 Tb. Sp.与对照组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。组织学观察示，随时间延长，两组植入材料中均见新骨生长，其中实验组新生骨与宿主骨形成骨性连接，优于对照组。

结论

多孔复合骨水泥具有骨诱导活性和骨传导双重作用，可以有效促进兔腰椎骨缺损修复重建。

磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）是由磷酸四钙和无水磷酸氢钙配制而成，也称为羟基磷灰石骨水泥^[1]。CPC 具有良好的生物相容性和骨传导性、可降解性并可以任意塑形，能满足临床上骨缺损修复的要求^[2-3]。但是，单一的 CPC 脆性大，不具有骨诱导活性，而且骨水泥凝固后孔隙率较小，组织难以长入，生物活性差^[4-5]。本研究选取 CPC 作为基体材料，与具有强诱导成骨活性的骨基质明胶（bone matrix gelatin，BMG）复合，并加入聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic）acid，PLGA]空白微球，制备多孔磷酸钙/骨基质明胶复合骨水泥（以下简称多孔复合骨水泥）。然后将此复合材料用于修复兔椎体骨缺损模型，探讨其对椎体骨缺损修复重建作用，为下一步临床试验奠定基础。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及主要试剂、仪器

成年新西兰兔 4 只，雌雄不限，体质量 2.5～3.5 kg； 2 月龄新西兰兔 30 只，雌雄各半，体质量 1.8～2.2 kg；均由西南医科大学动物实验中心提供。

PLGA （聚乳酸∶羟基乙酸=75∶25，特性黏度 0.65～0.75 dL/g，分子量 87 000～106 000；济南岱罡生物工程有限公司）；异丙醇（天津市科密欧科技有限公司）；CPC（上海瑞邦生物材料有限公司）。高速乳化机（巩义市予华仪器有限责任公司）；硬组织切片机（Leica 公司，德国）；micro-CT（Siemens 公司，德国）；INSTRON 8874 生物力学试验机（INSTRON 公司，美国）。

1.2. 多孔复合骨水泥制备及检测

1.2.1. BMG 的制备

参考 Urist 等^[6]方法，取 4 只成年新西兰兔长管状骨骨干，剔除软组织、骨膜、干骺端，制成直径 2～3 mm 骨颗粒，流水冲洗 2 h；液氮冷冻，粉碎机粉碎，经 60～80 目标准分样筛筛取，得到直径约 200 μm 的骨粉。24℃，分别加入 1∶1 氯仿甲醇溶液脱脂，0.6 mol/L HCl 溶液脱钙，再加入氯仿甲醇溶液脱脂后，依次经 2 mol/L CaCl₂ 溶液、0.5 mol/L EDTA 溶液、8 mol/L LiCl 溶液处理；置于 55℃ 水浴 24 h 后，冻干，环氧已烷灭菌备用。

1.2.2. PLGA 空白微球制备

参考 W/O/W 复乳法^[7]，将 1.0 g PLGA 溶于 4 mL 二氯甲烷中；注入 500 μL ddH₂O，以 9 000 r/min 高速剪切 1 min 形成初乳；将初乳液快速加入至 20 mL 4% 聚乙烯醇中，在冰浴下以 9 000 r/min 高速剪切 2 min；转移至装有 400 mL 2% 异丙醇及 400 mL 0.3% 聚乙烯醇的 1 000 mL 烧杯中，24℃ 低速搅拌 5 h，使有机溶剂挥发；静置 20 min，弃上清，以离心半径 13.5 cm，2 000 r/min 离心 5 min；加 5 mL ddH₂O 漂洗，弃上清，同上法再次离心 5 min，反复漂洗，收集微球，冷冻干燥。

1.2.3. 多孔复合骨水泥制备

根据前期研究结果^[8]，将 CPC 与 BMG 以质量比 5∶1 混合制成 CPC/BMG 固相粉末。CPC/BMG 粉末与 PLGA 空白微球混合，微球所占质量百分比为 5%；然后以 1 mol/L PBS 作为液相，按照固液比 1 g∶0.6 mL 添加至固相混合粉末，获得多孔复合骨水泥。

1.2.4. 理化特性测试

将多孔复合骨水泥固相和液相在室温下混合，搅拌均匀成浆体，注入装有 37℃PBS 溶液的培养皿中，静置 30 min 后震荡液体观察样本溃散情况。将骨水泥浆体注入直径 6 mm、长 12 mm 标准模具（模具由聚四氟乙烯塑料管制成），室温下干燥后，37℃ 水浴 24 h，再置于 37℃ 烤箱中干燥至恒重，脱模、取样。取样本采用阿基米德排水法测量其孔隙率（n=10）；另于生物力学试验机上行抗压测试，加载速度为 1 mm/min，测算抗压强度（n=10）。以上各项检测均以 CPC 作为对照。

1.3. 实验分组及方法

将 30 只 2 月龄新西兰兔随机分为实验组及对照组（n=15）。两组动物经耳缘静脉注射 3% 戊巴比妥钠（1 mL/kg）麻醉后，以 L₃ 棘突为中心，作腰背部脊柱后正中切口，由右侧骨膜下剥离椎旁肌，暴露 L₃ 椎板和上、下关节突关节，暴露 L₃ 横突、L₃ 椎头侧右侧前方约 1 cm 可操作区域。以 L₃ 横突基底为标志，在椎体右前方用薄椎板咬骨钳制备 4 mm×3 mm×3 mm（长×宽×高）骨缺损。根据分组分别在骨缺损中填入多孔复合骨水泥（实验组）和 CPC（对照组），植入量以材料填充满缺损为宜。间断缝合切口。手术当天及术后第 1 天各肌肉注射青霉素 20 万 U 预防感染。术后第 4、8、12 周，每组各取 5 只动物，采用空气栓塞法处死，切取标本（包括骨水泥填充椎体及远、近端正常椎体），剔除周围韧带及肌肉，修剪成 4 cm 长标准样本进行观测。

1.4. 观测指标

1.4.1. 一般情况

观察手术情况和术后动物饮食、活动、切口愈合情况。

1.4.2. X 线片观察

取标本摄正侧位X线片，观察植入材料与宿主骨融合情况。曝光条件：电压80 kV、电流125 mA、曝光时间40 ms、投照距离100 cm。

1.4.3. Micro-CT 检测

取标本行 micro-CT 扫描，所得图像经三维可视化重建及自带骨骼分析软件后处理，选取椎体内复合材料植入感兴趣区域，测算骨密度（bone mineral density，BMD）、骨体积分数（bone volume fraction，BVF）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb. Th.）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N.）和骨小梁分离度（trabecular spacing，Tb. Sp.）。

1.4.4. 组织学观察

将标本置于 4% 多聚甲醛固定，乙醇梯度脱水，过滤及包埋，硬组织切片，片厚 60 μm，甲苯胺蓝染色。镜下观察植入材料周围及内部新生骨形成情况。椎体骨为浅蓝色，新生骨为深蓝色，材料为灰色。

1.5. 统计学方法

采用 SPSS16.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. 理化特性观察

静置后两种骨水泥在 PBS 液体中大体形状完整，无明显溃散，提示均有较好抗溃散性。见图 1。多孔复合骨水泥孔隙率为 55.06%±1.18%，抗压强度为（51.63±6.73） MPa，与 CPC 的孔隙率 49.38%±1.75% 及抗压强度（63.34±3.27）MPa 相比，差异有统计学意义（t=4.254，P=0.006；t=2.476，P=0.034）。

图 1.

Anti-washout observation of the cements

骨水泥抗溃散性观察

a. CPC；b. 多孔复合骨水泥

a. CPC; b. Porous composite cement

2.2. 一般情况

两组动物手术顺利完成，手术时间约 60 min，无神经、血管损伤等并发症。术后无切口感染发生，对照组 2 只动物出现切口裂开再次缝合后愈合。所有动物均存活至实验完成。

2.3. X 线片观察

随时间延长，两组材料与宿主之间的边界逐步模糊。对照组第 4、8 周可见材料与椎体有明显边界，第 12 周边界模糊但仍然可见； 实验组第 4 周材料与椎体边界变模糊，第 8、12 周材料与宿主边界逐步消失并融合为一体。见图 2。

图 2.

X-ray films at different time points in 2 groups

两组各时间点 X 线片观察

箭头示骨水泥植入部位　从左至右分别为第 4、8、12 周　a. 对照组；b. 实验组

Arrow indicated cement implanting area　From left to right for 4, 8, and 12 weeksa. Control group; b. Experimental group

2.4. micro-CT 检测

随着时间延长，两组 BMD、BVF、Tb. Th.和 Tb. N.逐步增大，Tb. Sp.逐步减小。各时间点实验组以上指标与对照组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。

表 1.

Comparison of assessment of new-born bone in 2 groups (n=5, )

两组新生骨检测指标比较（n=5， ）

组别 Group	BMD (mg/cm3)				BVF (%)				Tb. Th.(mm)
	第 4 周 Four weeks	第 8 周 Eight weeks	第 12 周 Twelve weeks		第 4 周 Four weeks	第 8 周 Eight weeks	第 12 周 Twelve weeks		第 4 周 Four weeks	第 8 周 Eight weeks	第 12 周 Twelve weeks
对照组 Control group	125.8±6.5	136.2±8.9	149.9±12.9		0.725±0.055	0.778±0.043	0.876±0.040		0.180±0.031	0.233±0.021	0.261±0.017
实验组 Experimental group	133.4±8.6	145.7±6.2	161.8± 8.8		0.875±0.028	0.918±0.015	0.957±0.035		0.203±0.013	0.257±0.041	0.311±0.046
统计值 Statistic	t=2.430 P=0.041	t=2.893 P=0.020	t=2.761 P=0.025		t=5.442 P=0.001	t=6.842 P=0.000	t=3.379 P=0.010		t=3.985 P=0.004	t=2.392 P=0.044	t=2.640 P=0.030

2.5. 组织学观察

对照组：第 4 周骨缺损边缘有极少量新骨生长；第 8 周见新生骨由周围向中部生长，材料中部无新骨形成；第 12 周新生骨逐步长入至材料中部，并有少量骨桥形成。实验组：第 4 周材料开始降解吸收，逐步有新生骨长入；第 8 周材料边缘及中部骨细胞增生活跃，形成颗粒状或散在骨岛；第 12 周，新生骨增多，部分相互连接，由编织骨重塑为板层骨，材料周围新生骨与宿主骨形成骨性连接，无论是材料与宿主接触周围还是材料中部均有大量新生骨。见图 3。

图 3.

Histological observation at different time points in 2 groups (Toluidine blue × 200)

两组各时间点组织学观察（甲苯胺蓝×200）

NB：新生骨，HB：宿主骨，M：骨水泥，F：成纤维细胞　从左至右分别为第 4、8、12 周　a. 对照组；b. 实验组

NB: New-born bone, HB: Host bone, M: Cements, F: Fibroblasts　From left to right for 4, 8, and 12 weeks　a. Control group; b. Experimental group

3. 讨论

3.1. 多孔复合骨水泥理化性质分析

研究表明，BMG 具有强诱导成骨活性，其成骨能力与自体骨相似^[9]。PLGA 空白微球在体内可快速降解，降解产物无毒无害，微球降解后留下的孔隙有利于骨组织和血管长入^[10]。同时，PLGA 降解的酸性产物和孔隙中组织液渗入也有助于材料降解^[11]。因此，本研究选择将 BMG 和 PLGA 加入 CPC 固相中，探讨制备具有传导成骨和诱导成骨活性的多孔复合骨水泥的可行性。

结果显示，本研究构建的多孔复合骨水泥抗溃散较好。与 CPC 相比，材料孔隙率增至 55.06%±1.18%，这有助于体液渗入和新生骨组织长入^[10]；但 PLGA 空白微球的加入也使多孔复合骨水泥的抗压强度明显降低。文献报道，人体松质骨的抗压强度为 4～12 MPa，皮质骨强度为 130～180 MPa^[12]。本研究制备的多孔复合骨水泥的抗压强度为（51.63±6.73）MPa，超过松质骨的强度，可以达到皮质骨 1/4～1/2 强度，提示有望用于承重部位的骨缺损修复^[13]。

3.2. 动物体内实验分析

3.2.1. 动物模型选择

脊柱是重要的承重部位，兔腰椎在椎体两端邻近椎间盘部位膨大，便于制作骨缺损模型。另外，兔前肢欠发达，生活体位以半直立屈曲位为主，脊柱在此体位处于负重状态，用腰椎椎体骨缺损模型能模拟人椎体骨折愈合过程^[14]。本研究采用兔腰椎椎体作骨缺损模型，手术经后路从 L₃ 横突基底剥离至椎体侧前方，用统一规格椎板咬骨钳，制作一致性较好的可重复骨缺损模型，术中未发生神经血管损伤及动物死亡等并发症。

3.2.2. 观测结果分析

多孔复合骨水泥修复兔腰椎椎体骨缺损模型术后，未出现异物排斥反应。micro-CT 和组织学观察显示，材料植入区周围无组织变性、坏死出现。植入第 4 周，材料与周围骨组织之间有缝隙，随着时间延长，在第 8 周时缝隙模糊或消失，在第 12 周时复合材料与周围骨组织之间形成骨性连接、融合或骨组织已长入材料内部，这表明多孔复合骨水泥与兔椎体骨组织之间有良好的组织相容性。大量 CPC、BMG 与 PLGA 相关研究显示，单纯使用以上材料均具有良好生物相容性^[15-18]。本研究结果显示 CPC、BMG 与 PLGA 复合后，仍具有良好的生物相容性。

骨移植替代材料修复骨缺损的主要机制包括骨传导和骨诱导。骨传导是以材料为支架，新生血管、新生骨沿着孔隙长入材料内部，破骨细胞导致材料的逐步降解吸收，成骨细胞形成新骨不断修复骨缺损，最终完成材料的降解和骨缺损的重建^[19-20]。骨诱导是通过人工复合材料携带的生长因子对 MSCs 趋化、诱导，使其分化为成软骨细胞和成骨细胞，从而完成骨组织的再生与修复^[21-22]。BMP、MSCs、骨生长环境是诱导成骨的关键要素，BMP 作为诱导刺激物作用于 MSCs，在有利于骨生长的血液环境中，诱导刺激骨形成^[23-25]。异种骨或同种异体骨经过脱脂、脱钙、脱蛋白处理后制成 BMG，去掉了除 BMP 以外 95% 的非胶原蛋白和具有阻滞作用的脂质成分。因此，BMG 具有一定强度和孔隙，免疫原性低，生物相容性好，在体内可诱导成骨前体细胞，产生骨原细胞，经成骨细胞形成新骨，并逐渐吸收，被新骨所替代^[6]。

本研究发现，CPC 植入后，新生骨自周围长入，随着时间延长，逐步向材料中部生长，CPC 材料在兔椎体骨缺损部位起骨传导作用，CPC 降解的同时，新生骨逐步长入，与文献报道一致^[26-27]；加入 PLGA 空白微球的多孔复合骨水泥显示了优越的生物活性，材料周围及中部均有大量新生骨长入。结果表明，多孔材料同时具有骨传导和骨诱导活性。早期以 CPC 材料为支架，周围新生血管、新生骨长入^[28]；随着 PLGA 空白微球的迅速降解，降解后留下的大孔有助于组织液的渗入、血管与新生骨长入，材料内部的 BMG 与之充分接触，BMG 内的 BMP 发挥作用，诱导 MSCs 分化为成软骨细胞和成骨细胞^{[24-25, 29]}。本研究结果显示，多孔复合骨水泥材料植入后，可在椎体骨缺损周围及中部发现有成骨细胞，提示材料周围及中央新骨同步形成，多孔复合骨水泥兼具骨诱导活性和骨传导作用，可以有效修复兔椎体骨缺损，为临床应用该骨水泥提供了实验依据。

Funding Statement

四川省医学会科研课题（2015GK005）；泸州-川医大联合课题（2015LZCYD-S05）

Sichuan Medical Association Science Funds (2015GK005); Joint Research Funds of Luzhou and Sichuan Medical University (2015LZCYD-S05)