鹿茸软骨组织脱细胞基质材料的制备及生物相容性研究

Abstract

目的

探讨鹿茸软骨制备脱细胞基质材料的可行性以及生物相容性，为软骨修复重建探索新材料。

方法

取梅花鹿鹿茸生长中心间充质层，进行由 DNA 酶、RNA 酶、抑肽酶等介导的脱细胞处理；行组织学和 DNA 含量检测，评价脱细胞效果。取第 2 代鹿生茸区骨膜（antlerogenic periosteum，AP）细胞，行荧光干细胞标记明确其干细胞特性后，用 PKH26 荧光标记并与制备的间充质层脱细胞基质进行复合培养；7 d 后取材行HE染色观察以及荧光显微镜下观察 PKH26 标记的 AP 细胞在基质表面生长情况。以上观测均以未复合 AP 细胞的脱细胞基质作为对照。将复合培养 7 d 的样本移植至裸鼠一侧腹股沟（实验组），取空白培养样本移植于另一侧（对照组）。于移植后 7、21 d 取材行 HE 染色，同时对组织进行冰冻切片并在荧光显微镜下观察 PKH26 标记成功的 AP 细胞在脱细胞基质表面及内部的生长情况，评价含 AP 细胞的脱细胞基质在裸鼠体内的组织相容性。

结果

HE 和 DAPI 染色显示脱细胞处理后材料中无细胞残留，DNA 含量为（19.367±5.254）ng/mg，较脱细胞处理前的（3 805.500±519.119）ng/mg 显著降低（t=12.630，P=0.000），提示成功制备间充质层脱细胞基质。AP 细胞与间充质层脱细胞基质复合培养 7 d 后，AP 细胞主要黏附于材料表面，部分进入脱细胞基质内部。植入裸鼠体内后，随观察时间延长，接种 AP 细胞可以在脱细胞基质材料中增殖并逐渐进入材料内部，并诱导血管生成。

结论

实验成功制备鹿茸软骨脱细胞基质，该基质材料在离体和活体情况下适于种子细胞（AP 细胞）的黏附和增殖，并具有刺激血管生成的功能，为其用于软骨组织修复提供理论依据。

由创伤和各种疾病导致的关节软骨缺损临床常见，由于软骨内无血管，缺乏血液供应，缺损后自身修复能力有限^[1-3]。目前，临床治疗关节软骨损伤方法较多，包括软骨或骨膜移植、软骨下骨钻孔以及关节削磨成形术等，但均不能实现长期的软骨修复^[4]。随着组织工程技术的发展，脱细胞基质材料，特别是软骨脱细胞基质材料，成为了修复软骨组织的一种新材料^[5-7]。大量动物实验及临床研究发现，应用自体软骨组织或同种异体、异种脱细胞基质作为支架材料修复软骨组织缺损的方法仅适合小范围软骨缺损修复^[8-10]，由于缺乏充足营养供应或血管化不及时，大段软骨缺损修复效果不理想^[11-12]。

鹿茸是一种骨软骨组织复合物，其软骨组织中富含血管、多种软骨/骨生成相关因子^[13-15]，可以作为一种良好的软骨脱细胞基质材料来源。鹿茸尖部至基部分为间充质层、前成软骨层、过渡区、软骨层，间充质层是鹿茸能快速生长的关键组织^[16]。研究发现，鹿茸间充质层细胞可以被多种干细胞标记物标记，且处于快速分裂状态^[17]。因此，本研究以鹿茸软骨间充质层为研究对象，制备脱细胞基质材料并评价其脱细胞效果；同时将其移植至裸鼠体内，观察间充质层脱细胞基质组织相容性，并研究鹿茸干细胞即生茸区骨膜（antlerogenic perios-teum，AP）细胞结合脱细胞基质材料在活体内诱导血管生成的情况。报告如下。

1. 材料与方法

1.1. 实验材料及主要试剂、仪器

3 头梅花鹿的标准二杠鹿茸，由中国农业科学院特产研究所实验鹿场提供。48 日龄雄性裸鼠（BALB/c-nu）6 只，平均体质量 35 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。原代 AP 细胞由本实验室保存。

弹力蛋白酶、抑肽酶、RNA 酶、DNA 酶、PKH26 细胞荧光染色试剂盒（Sigma 公司，美国）；DNA 提取试剂盒（Promega 公司，美国）；Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠免疫荧光染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Stro-1 抗体（Abcam 公司，英国）；DMEM、FBS（GIBCO 公司，澳大利亚）。

Bullet Blender 细胞组织破碎仪（Next Advance 公司，美国）；酶标仪（BioTek 公司，美国）；组织切片机（Leica 公司，德国）；细胞培养箱（SANYO 公司，日本）；荧光显微镜（AMG 公司，美国）；倒置显微镜（Olympus 公司，日本）。

1.2. 间充质层脱细胞基质制备及观测

1.2.1 间充质层脱细胞基质制备　取鹿茸按照 Li 等^[18]方法进行组织分层，获得鹿茸软骨间充质层组织，切割成大小为 0.2 mm × 0.2 mm 的组织块，PBS 冲洗数次去除血液和污渍后，4℃ 冰箱保存备用。参照 Utomo 等^[19]的软骨脱细胞方法并进行改良，具体步骤：① 将组织块置于低渗溶液中连续冻融 2 个周期，每个周期 –20℃ 冻 12 h、4℃ 融 12 h，然后置于 45℃ 低渗溶液中孵育 24 h；② 置于去离子剂中振荡处理 24 h，然后于洗涤液中常温振荡清洗 2 次，每次 30 min；③ 45℃，于洗涤剂中振荡孵育 24 h；④ 37℃，于低浓度弹力蛋白酶溶液中振荡处理 24 h，然后洗涤液中常温振荡清洗 2 次，每次 30 min；⑤ 37℃，于核酸清除液中振荡孵育 3 h，然后洗涤液中常温振荡清洗 2 次，每次 30 min；⑥ 于去污剂中振荡洗涤 3 h，然后洗涤液中常温振荡洗涤 2 次，每次 30 min；⑦ 45℃，于 PBS 中振荡处理 24 h。脱细胞处理结束后，将标本置于低渗溶液中，4℃ 冰箱保存备用。

1.2.2 脱细胞效果评价　① 组织学观察：取脱细胞基质材料置于 4% 多聚甲醛固定，制作石蜡切片，片厚 5 μm，常规行 HE 染色和 DAPI 染色，于光镜及荧光显微镜下分别观察脱细胞处理后残留细胞量以及基质内纤维组织状态。② DNA 含量检测：称取 20 mg 脱细胞基质材料，按照 DNA 提取试剂盒说明书步骤进行 DNA 提取，使用酶标仪测定 DNA 浓度。实验重复 3 次。以上两检测指标均取未行脱细胞处理的间充质层组织作为对照。

1.3. 间充质层脱细胞基质与 AP 细胞复合培养观察

1.3.1 AP 细胞免疫荧光染色观察　取原代 AP 细胞常规复苏并传至第 2 代，按照 1×10⁴ 个/孔密度接种于含有多聚赖氨酸爬片的 24 孔板中；常规培养 24 h 后，4% 多聚甲醛固定爬片 15 min，PBS 浸洗玻片 3 次，吸干 PBS，滴加正常山羊血清，室温封闭 30 min；吸弃封闭液，滴加一抗 Stro-1，湿盒中 4℃ 孵育过夜；同型对照代替一抗 Stro-1 作为阴性对照。TBST 浸洗爬片 3 次，吸干爬片上多余液体后滴加二抗 Alexa Fluor 488，湿盒中 37℃ 孵育 1 h，TBST 浸洗 3 次；吸干液体后滴加 20 μL 罗丹明染液，湿盒中室温下染色 20 min，TBST 浸洗 3 次；滴加 DAPI 避光孵育 5 min，TBST 浸洗 3 次；吸干液体后封片，荧光显微镜下观察绿色荧光标记的 Stro-1 蛋白在 AP 细胞膜表面表达情况。

1.3.2 PKH26 标记 AP 细胞　取原代 AP 细胞常规复苏并传至第 2 代，消化后 1 mL DMEM 培养基（含 10% FBS 及青、链霉素各 100 U/mL）重悬，计数细胞为 5×10⁶ 个。按 PKH26 细胞荧光染色试剂盒操作说明书进行操作，将 1 μL 染料与 0.5 mL 稀释液 C 混合均匀后，加至细胞悬液中混合，于 37℃ 细胞培养箱中孵育 3 min，然后加入同体积 FBS 中和反应。细胞混合液以 1 000×g、离心 5 min 后，去除上清，加入 1 mL DMEM 培养基重悬后进行常规 AP 细胞培养，培养 2 d 后荧光显微镜下观察 PKH26 标记结果。以等量 PBS 代替细胞混合液作为阴性对照，其余操作相同。

1.3.3 复合培养观察　待 1.3.2 中 PKH26 标记的 AP 细胞长满后进行消化处理，计数细胞为 2×10⁷ 个，以 2 mL DMEM 培养基重悬；取 20 mg 间充质层脱细胞基质加至重悬液中，室温下孵育 5 min，将基质连同细胞悬浮液一同转移至 6 孔培养板，再加入 1 mL DMEM 培养基，于 37℃、5%CO₂ 细胞培养箱内进行常规培养，作为实验组。每隔 2 d 换液 1 次。对照组为 1.3.2 中等量 PBS 代替细胞混合液，其余操作相同；即不接种 PKH26 标记的 AP 细胞、只进行脱细胞基质空培养。培养 7 d 后，取两组样本同 1.2.2 方法制备石蜡切片，常规 HE 染色，光镜下观察。另外，荧光显微镜下观察 PKH26 标记的 AP 细胞在材料表面分布情况。

1.4. 动物体内实验

取 6 只裸鼠，腹腔注射 0.1 mL 10% 水合氯醛麻醉后，腹股沟处消毒。取 1.3.3 中培养 7 d 的实验组及对照组样本，分别移植至每只裸鼠左、右侧腹股沟，每侧 20 mg。见图 1。移植后 7、21 d，分别取 3 只裸鼠同上法麻醉后，按照原切口入路取出移植物。取部分样本制备冰冻切片，荧光显微镜下观察 PKH26 标记的 AP 细胞在体内增殖及迁移情况；部分样本制备石蜡切片，常规 HE 染色后光镜下观察。

图 1.

The process of transplantation of M layer acelluar matrix into nude mice　a. M layer acellular matrix for transplantation; b. Location of transplantation; c. Transplantation of M layer acellular matrix into nude mice by sterile operation

间充质层脱细胞基质植入裸鼠操作步骤　a. 间充质层脱细胞基质；b. 移植部位；c. 于无菌操作台中将间充质层脱细胞基质植入裸鼠腹股沟部

1.5. 统计学方法

采用 SPSS 20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. 脱细胞处理效果评价

2.1.1 组织学观察　HE 染色显示，脱细胞处理前，间充质层组织细胞排列紧密，大部分细胞胞核细长，排列方向与生长轴垂直，少数与生长轴平行，存在血管前体结构。脱细胞处理后，细胞完全从间充质层组织中脱去，留下空隙均匀的基质材料。DAPI 染色显示，脱细胞处理前，间充质层组织内细胞核明显；脱细胞处理后，间充质层组织内无细胞核。见图 2。

图 2.

Histological observation of M layer tissue before and after cell extraction　From left to right for M layer tissue before and after cell extraction, respectively a. HE staining (×10); b. DAPI staining (Fluorescence microscope×20)

脱细胞前后间充质层组织学观察　从左至右分别为脱细胞处理前及处理后 a. HE 染色（×10）；b. DAPI 染色（荧光显微镜×20）

2.1.2 DNA 含量检测　脱细胞处理前，间充质层组织内 DNA 含量为（3 805.500±519.119）ng/mg，脱细胞处理后为（19.367±5.254）ng/mg，比较差异有统计学意义（t=12.630，P=0.000）。

2.2. AP 细胞染色及标记观察

2.2.1 免疫荧光染色　荧光显微镜下见，部分 AP 细胞呈 Stro-1 标记阳性，Stro-1 蛋白分布于 AP 细胞表面，呈颗粒状镶嵌于细胞膜中。见图 3。

图 3.

Immunofluorescent staining of AP cells (Fluorescence microscope×10)　a. Merge; b. Immunofluorescent staining of cell membrane; c. Immunofluorescent staining of cytoskeleton; d. DAPI staining of cell nucleus

AP 细胞免疫荧光染色观察（荧光显微镜×10）　a. 叠加图；b. Stor-1 细胞膜染色；c. 罗丹明细胞骨架染色；d. DAPI 细胞核染色

2.2.2 PKH26 标记　荧光显微镜下观察，PKH26 染料与 AP 细胞结合良好，其均匀分布于 AP 细胞胞膜上，阳性细胞率达 100%。标记后 AP 细胞形态良好，可用于后续实验。见图 4。

图 4.

Observation of AP cells labelled by PKH26 (Fluorescence microscope×20)　a. Fluorescent expression of AP cells; b. Morphological observation of AP cells

PKH26 标记的 AP 细胞观察（荧光显微镜×20）　a. AP 细胞荧光表达情况；b. AP 细胞形态

2.3. 间充质层脱细胞基质与 AP 细胞复合培养

复合培养 7 d，与对照组相比，荧光显微镜下见实验组 PKH26 标记的 AP 细胞均匀分布于脱细胞基质材料上；HE 染色示，实验组 AP 细胞主要分布于脱细胞基质表面，部分 AP 细胞迁徙至脱细胞基质内部。见图 5。

图 5.

Observation of the acelluar matrix tissue in vitro after co-cultured with AP cells for 7 days

间充质层脱细胞基质与 AP 细胞复合培养 7 d 观察

从左至右分别为对照组、实验组 a. 荧光显微镜观察（×10）；b. HE 染色观察（×10）

From left to right for control group and experimental group, respectively a. Fluorescence microscope (×10); b. HE staining (×10)

2.4. 动物体内实验观察

移植 7 d 后，荧光显微镜下见，实验组 AP 细胞存活于间充质层脱细胞基质表面，并且有部分细胞向脱细胞基质内部迁徙，在不同组织块交接处出现大团荧光聚集；对照组为阴性表达。HE 染色观察，实验组可见大团细胞聚集，并由聚集处向脱细胞基质内部迁徙；对照组移植脱细胞基质边缘有少量裸鼠真皮细胞自发迁徙，不同组织块交接处几乎无细胞。

移植 21 d 后，荧光显微镜下见，实验组 AP 细胞较 7 d 时进一步增殖并扩散至间充质层脱细胞基质内部；对照组仍为阴性表达。HE 染色观察，实验组脱细胞基质内部细胞较 7 d 时进一步增加，且内部出现穿行血管，血管四周由细胞包裹；对照组自体迁徙进入脱细胞基质的细胞进一步增多，部分组织块趋于融合，且没有坏死迹象。见图 6、7。

图 6.

Fluorescence microscope observation of the acelluar matrix tissue at different time points after transplantation in vivo (×10)

体内移植各时间点荧光显微镜观察（×10）

a. 对照组移植 7 d；b. 实验组移植 7 d；c. 对照组移植 21 d；d. 实验组移植 21 d

a. Control group at 7 days; b. Experimental group at 7 days; c. Control group at 21 days; d. Experimental group at 21 days

图 7.

HE staining of the acellular matrix tissue at different time points after transplantation in vivo (×10)

体内移植各时间点 HE 染色观察（×10）

a. 对照组移植 7 d；b. 实验组移植 7 d；c. 对照组移植 21 d；d. 实验组移植 21 d

a. Control group at 7 days; b. Experimental group at 7 days; c. Control group at 21 days; d. Experimental group at 21 days

3. 讨论

软骨组织工程为解决软骨类疾病，如关节软骨磨损提供了新方法，其中软骨组织脱细胞基质材料由于富含天然生长因子、良好的生物相容性、生物力学特性等成为近年来相关研究热点之一^[20-22]。目前，多种不同来源的软骨组织已被成功制备为软骨脱细胞基质材料，包括猪关节软骨、兔耳软骨、兔关节软骨、人自体关节软骨等，但鹿茸软骨的脱细胞基质材料相关研究较少。鹿茸是天然的骨软骨器官，其中的间充质层为鹿茸的生长中心，同时也是 MSCs 所在区域，其为干细胞提供了所需的微环境，即细胞外基质成分。正常软骨组织的细胞外基质中有机成分主要为胶原蛋白，约占 90%，余下为蛋白酶类以及多种非胶原蛋白，例如骨连接蛋白、纤维连接蛋白、骨钙素等^[23]，而生长因子含量较少或缺失。而鹿茸软骨脱细胞基质材料在提供传统软骨基质组分的同时，还能提供多种生长因子，帮助种子细胞在体内进一步增殖和分化。鹿茸软骨组织与其他软骨相比，含有丰富的血管系统，正是丰富的血供保证了鹿茸的快速生长。本课题组系列研究中，经扫描电镜发现，与普通软骨组织不同，鹿茸的软骨基质中含有综合交错的网络结构，既有横向软骨陷窝结构又有纵向的血管管腔结构。而良好的孔隙便于软骨细胞营养物质的供应及代谢废物排出^[24]。因此，鹿茸软骨这一结构特点具有以下优势：① 有利于脱细胞处理过程中脱细胞试剂的灌注，如核酸清除剂等；② 有利于脱细胞基质材料的制备；③ 有利于种子细胞的进入及新生血管的侵入，从而保障种子细胞的成活效率。本研究制备了鹿茸软骨间充质层脱细胞基质，HE染色和 DAPI 染色结果显示，脱细胞处理后间充质层组织中无细胞核存在，DNA 含量检测发现，脱细胞处理后基质材料中 DNA 含量低至（19.367±5.254）ng/mg，国际上将每毫克干组织中 DNA 含量<50 ng/mg 定义为脱细胞处理成功^[25]，对比脱细胞处理前后DNA含量，说明脱细胞处理成功，仅保留了细胞外基质组分。

软骨组织工程中制备的脱细胞基质材料必须具有良好的生物组织相容性，适于种子细胞的存活及增殖^[26]。本研究中，我们选择了 AP 细胞与脱细胞基质材料结合后移植入裸鼠体内（实验组）和脱细胞基质材料单独移植（对照组）两种方式。首先，在离体情况下 AP 细胞接种后迅速布满材料表面，7 d 后有少量细胞迁徙至组织内部。种子细胞结合脱细胞基质材料修复组织缺损的过程中，种子细胞与材料的黏附是基础，细胞必须与材料发生适当的黏附才能进行迁移、分化和增殖^[27]。本实验中，接种的 AP 细胞在爬布于材料表面的同时，还有少数细胞进一步浸润迁徙至组织内部，说明制备的脱细胞基质材料在离体情况下适于种子细胞的黏附及进一步增殖。其次，评价生物材料组织相容性的另一标准是体内植入^[28]。将复合培养 7 d 的脱细胞基质植入裸鼠体内 21 d 后，HE 检测发现，种子细胞在组织内部进一步增殖并产生功能，诱导血管新生；而对照组单独移植鹿茸软骨脱细胞基质后，移植的基质材料没有抑制裸鼠真皮细胞增殖，反而有部分细胞迁移至组织内部，说明制备的脱细胞基质材料具有良好的生物相容性。

综上述，本研究成功建立了鹿茸软骨间充质层组织的脱细胞方法，间充质层脱细胞基质有利于种子细胞的黏附及增殖，具有良好组织相容性。我们下一步研究将参照 ISO10993-1 生物学评价和试验标准，对鹿茸间充质层组织脱细胞基质材料的生物相容性进行全面评估，包括体外细胞毒性、全身急性毒性、亚急性毒性、溶血实验、热原实验等，以及该材料的功能性应用研究，如软骨修复。由于鹿茸具有类似于生长板的多个分层，包括间充质层、前成软骨层、过渡区、软骨层，在完成间充质层的脱细胞基质材料制备后，还需要对前成软骨层等 3 个分层组织进一步进行脱细胞研究，并发掘相关材料的特性进行功能研究。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（31500792）；吉林省自然科学基金资助项目（20170101032JC）

National Natural Science Foundation of China (31500792); Natural Science Foundation of Jilin Province (20170101032JC)