表皮葡萄球菌胞间黏附素基因操纵子对细菌与真菌混合生物膜相关炎症作用影响的体内研究

Abstract

目的

探讨表皮葡萄球菌胞间黏附素基因（intercellular adhesion，ica）操纵子对气管导管材料表面表皮葡萄球菌与白假丝酵母菌混合生物膜相关炎症作用影响的体内研究。

方法

取表皮葡萄球菌标准株 RP62A（ica 操纵子阳性，阳性组）、ATCC12228（ica 操纵子阴性，阴性组）制备浓度为 1×10⁶CFU/mL 的菌液，分别与相同浓度的白假丝酵母菌标准株 ATCC10231 菌液按照 1∶1 比例制备成混合培养菌液后，与气管导管材料片孵育 24 h，扫描电镜观察材料表面混合生物膜形成情况。取 4～6 月龄新西兰兔 30 只分为两组（n=15），分别于气管旁植入孵育 24 h 的阳性组及阴性组气管导管材料。于术前及术后 1、3、7 d 测量两组兔体质量。术后 1、3、7 d，采用 ELISA 检测试剂盒检测血浆中 IL-1β、IL-6、TNF-α 和单核细胞趋化蛋白 1（monocytechemotactic protein 1，MCP-1）水平；术后 7 d，扫描电镜观察取出的气管导管材料片表面混合生物膜形成情况，HE 染色观察材料周围组织炎症浸润情况，平板菌落计数法观察心脏、肺、肝脏、肾脏细菌感染情况。

结果

扫描电镜观察示体外孵育 24 h 后阳性组可见明显混合生物膜结构，阴性组未见混合生物膜形成。体内实验显示两组术前及术后 1、3、7 d 体质量比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。与阴性组相比，阳性组术后 1 d IL-1β 及 MCP-1 水平，术后 3、7 d IL-1β、MCP-1、IL-6、TNF-α 水平均升高，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。扫描电镜观察示阳性组可见大量表皮葡萄球菌残留以及混合生物膜结构，阴性组见极少量表皮葡萄球菌残留，未见混合生物膜结构。HE 染色示两组材料周围组织均可见炎症细胞浸润，其中阳性组中性粒细胞及淋巴细胞浸润较阴性组严重。两组心脏、肝脏细菌感染数量差异无统计学意义（P>0.05），阳性组肺、肾脏细菌感染数量高于阴性组（P<0.05）。

结论

ica 操纵子在表皮葡萄球菌与白假丝酵母菌混合感染中可能由于增强了混合生物膜结构及其在体内的传播，导致炎症因子升高，细菌难以清除，感染迁延不愈。

目前，临床麻醉常用的气管导管通常为聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）制成，使用此类气管导管时可能发生以生物材料为中心形成感染（biomaterial centered infection，BCI）这一严重并发症。PVC 材料触发的微生物黏附和生物膜形成通常与表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌相关，有研究发现存在白假丝酵母菌生物膜结构是导致患者死亡率增加的危险因素^[1-3]。表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌作为共生生物存在于人体中，是免疫功能低下患者体内的机会病原体，能形成具有多细胞结构的混合生物膜，由此引发的 BCI 具有复发性、难治性及耐药性等特点^[4-6]。

表皮葡萄球菌胞间黏附素基因（intercellular adhesion，ica）操纵子是生物膜形成过程中重要的调控基因。体外实验显示在细菌与真菌混合生长过程中，ica 操纵子会影响混合生物膜的立体结构，但其对动物或人类宿主体内混合生物膜形成及感染后炎症等有无影响尚未明确^[7-10]。微生物组入侵和宿主免疫系统功能降低是促进表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌等机会病原体从共生状态转变为致病状态的条件，进而介导了体内炎症的开始。炎症因子的表达和释放是 BCI 中重要免疫反应，体内混合生物膜的形成可能会导致细菌及真菌全身播散增加，并引起强烈的免疫反应，局部细胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 等相应升高^[11-14]。因此，细胞因子水平变化是临床早期监测混合生物膜感染的良好指标^[15-17]。本研究旨在通过动物实验，观察表皮葡萄球菌 ica 操纵子对气管导管表面的表皮葡萄球菌与白假丝酵母菌混合生物膜炎症作用的影响。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及主要试剂、仪器

4～6 月龄健康新西兰兔 30 只，雌雄不限，体质量（2.5±0.5）kg，由昆明医科大学实验动物学部提供，实验前适应性饲养 1 周。

表皮葡萄球菌标准株 RP62A（ica 操纵子阳性；美国典型菌种保藏中心）；表皮葡萄球菌标准株 ATCC12228（ica 操纵子阴性）、白假丝酵母菌标准株 ATCC10231（中国科学院微生物研究所）；PVC 气管导管（杭州坦帕医疗科技有限公司）；MH 琼脂平板、沙保罗琼脂平板、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（tryptic soy broth，TSB）、胰酪胨大豆羊血琼脂平板（广州环凯生物科技有限公司）；IL-1β、单核细胞趋化蛋白 1（monocytechemotactic protein 1，MCP-1）检测试剂盒（武汉云克隆科技有限公司）；TNF-α、IL-6 检测试剂盒（Signalway Antibody 公司，美国）。多功能酶标仪（Thermo 公司，美国）；扫描电镜（Hitachi 公司，日本）。

1.2. 实验方法

1.2.1. 气管导管材料表面混合生物膜制备及观测

① 制备方法：将表皮葡萄球菌标准株 RP62A、ATCC12228 接种于 MH 琼脂平板，白假丝酵母菌标准株 ATCC10231 接种至沙保罗琼脂平板，37℃ 隔水式恒温培养箱培养 24 h。选取平板上单个菌落接种至 TSB 培养基，置于 37℃、90 r/min 恒温摇床中孵育 12～16 h 至对数生长期，用 TSB 培养基将各菌液浓度调整至 1×10⁶ CFU/mL；按照 1∶1 比例，将表皮葡萄球菌标准株 RP62A（阳性组）、ATCC12228（阴性组）菌液分别与白假丝酵母菌标准株 ATCC10231 菌液混合，制备混合培养菌液，均为临用前配置。

气管导管材料片使用打孔器制备成直径为 1 mm 的圆片，灭菌后置于 24 孔细胞培养板，每孔 1 片；分别加入配制的混合培养菌液，每孔 2 mL；置于 37℃ 温箱孵育 24 h，获得两组气管导管材料表面混合生物膜模型。

② 扫描电镜观察：取两组孵育 24 h 的气管导管材料，置于 2.5% 戊二醛中固定 24 h，PBS 冲洗 3 次，1% 锇酸溶液固定后乙醇梯度脱水处理，醋酸异戊酯置换；叔丁醇 40℃ 渗透处理；CO₂ 临界干燥、真空镀金。扫描电镜下观察材料表面混合生物膜结构。

1.2.2. 动物体内实验

取 30 只兔耳缘静脉注射 3% 戊巴比妥钠（1 mL/kg）麻醉后，取仰卧位固定四肢，颈部备皮，0.5% 聚维酮碘消毒，铺无菌洞巾。作颈部正中切口 2 cm，切开皮肤筋膜，分离组织肌肉，于气管旁植入孵育 24 h 的阳性组或阴性组气管导管材料，每组 15 只兔，每只植入 2 片气管导管材料。缝合颈部切口。术后正常饮食。

1.3. 观测指标

1.3.1. 一般情况

观察两组兔存活情况，于术前（0 d）及术后 1、3、7 d 采用电子称测量体质量。

1.3.2. ELISA 检测血浆炎症因子

术后 1、3、7 d，两组兔耳缘静脉采血 3 mL，采用 ELISA 检测试剂盒检测血浆中 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MCP-1 水平。

1.3.3. 扫描电镜观察

术后 7 d，两组兔经注射过量麻醉药物处死后，按照原切口入路，取出气管导管材料，同 1.2.1 方法处理后扫描电镜观察材料表面混合细菌膜形成。

1.3.4. 组织学观察

术后 7 d，取两组气管导管材料周围组织置于甲醛中固定，石蜡包埋，切片（片厚 5 μm），常规 HE 染色后光镜下观察组织炎症细胞浸润情况。

1.3.5. 器官细菌感染检测

术后 7 d，取两组兔心脏、肺、肝脏、肾脏组织各 1 g，组织匀浆后接种于胰酪胨大豆羊血琼脂平板，采用平板菌落计数法观察器官细菌感染情况。

1.4. 统计学方法

采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。计量资料符合正态分布时，以均数±标准差表示，两组比较采用重复测量方差分析，若不满足球形检验，采用 Greenhouse-Geisser 法进行校正，同一组别不同时间点比较采用 Bonferroni 法，同一时间点不同组别间比较采用多因素方差分析；不符合正态分布时，以中位数（四分位数间距）表示，组间比较采用 Wilcoxon 秩和检验。检验水准α=0.05。

2. 结果

2.1. 气管导管材料表面混合生物膜形成观察

体外孵育 24 h 后，扫描电镜下阳性组可见表皮葡萄球菌和白假丝酵母菌菌丝及孢子混杂生长，形成具有复杂多层次结构的混合生物膜；阴性组表皮葡萄球菌呈团状生长，未见立体结构的混合生物膜形成。见图 1。

图 1.

Scanning electron microscope observation of the mixed biofilm formation on the surface of the endotracheal tube materials of the two groups after 24 hours in vitro incubation

体外孵育 24 h 后扫描电镜观察两组气管导管材料表面混合生物膜形成

红色箭头示表皮葡萄球菌　绿色箭头示白假丝酵母菌 a. 阳性组（×2 000）；b. 阳性组（×4 000）；c. 阴性组（×2 000）；d. 阴性组（×4 000）

Red arrows indicated Staphylococcus epidermidis　Green arrows indicated Candida albicans a. Positive group (×2 000); b. Positive group (×4 000); c. Negative group (×2 000); d. Negative group (×4 000)

2.2. 动物体内实验观测

2.2.1. 一般情况

实验过程中因麻醉意外死亡 2 只、静脉栓塞死亡 1 只，均相应补充。两组术前及术后 1、3、7 d 体质量比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见图 2、表 1。

图 2.

Changes in body mass of the two groups

两组体质量变化趋势

表 1.

Comparison of the body mass of the two groups before and after operation (n=15, , g)

两组手术前后体质量比较（n=15， ，g）

组别 Group	0 d	1 d	3 d	7 d
阳性组 Positive group	2 020.00±162.27	2 024.13±186.02	2 095.40±182.07	2 067.73±171.56
阴性组 Negative group	2 067.87±139.09	2 068.47±169.09	2 157.13±175.86	2 110.33±1 137.59
统计值 Statistic	时间效应F=9.379，P=0.005 交互效应F=0.001，P=0.991 组间效应F=0.770，P=0.388

2.2.2. ELISA 检测血浆炎症因子

与阴性组相比，阳性组术后 1 d MCP-1 及 IL-1β 水平，术后 3、7 d IL-1β、MCP-1、IL-6、TNF-α 水平均升高，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。其余时间点组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 2、图 3。

表 2.

Comparison of plasma inflammatory factor levels between the two groups at various time points after operation (n=15, )

两组术后各时间点血浆炎症因子水平比较（n=15， ）

组别 Group	IL-1β（pg/mL）				MCP-1（ng/mL）
	1 d	3 d	7 d		1 d	3 d	7 d
阳性组 Positive group	90.20±30.35	87.29±32.06	85.91±38.51		2.02±0.75	2.09±0.72	2.14±0.71
阴性组 Negative group	54.33±19.19	56.37±22.53	57.34±24.06		0.95±0.06	1.03±0.52	0.96±0.67
统计值 Statistic	时间效应F=0.018，P=0.894 交互效应F=0.589，P=0.449 组间效应F=11.538，P=0.002				时间效应F=0.437，P=0.497 交互效应F=0.390，P=0.537 组间效应F=28.172，P=0.000
组别 Group	IL-6（pg/mL）				TNF-α（pg/mL）
	1 d	3 d	7 d		1 d	3 d	7 d
阳性组 Positive group	120.43±6.83	125.95±6.65	123.78±7.89		25.89±11.68	33.07±10.97	38.28±18.86
阴性组 Negative group	114.25±11.35	113.80±7.59	111.48±9.54		20.40±8.19	20.83±7.28	20.16±7.09
统计值 Statistic	时间效应F=0.230，P=0.880 交互效应F=2.630，P=0.116 组间效应F=18.609，P=0.000				时间效应F=6.608，P=0.016 交互效应F=7.153，P=0.012 组间效应F=14.008，P=0.001

图 3.

Changes of plasma inflammatory factors in the two groups after operation

两组术后血浆炎症因子变化趋势

a. IL-1β；b. MCP-1；c. IL-6；d. TNF-α

a. IL-1β; b. MCP-1; c. IL-6; d. TNF-α

2.2.3. 扫描电镜观察

术后 7 d 阳性组可见大量炎症细胞浸润吞噬细菌及真菌，大片残留表皮葡萄球菌，且观察到混合生物膜结构。阴性组可见炎症细胞浸润，与阳性组相比只残余极少量表皮葡萄球菌，未观察到混合生物膜结构。见图 4。

图 4.

Scanning electron microscope observation of endotracheal tube materials in the two groups at 7 days after operation

术后 7 d 两组气管导管材料扫描电镜观察

红色箭头示表皮葡萄球菌　绿色箭头示白假丝酵母菌　蓝色箭头示炎症细胞　a. 阳性组（×2 000）；b. 阳性组（×4 000）；c. 阴性组（×2 000）；d. 阴性组（×4 000）

Red arrows indicated Staphylococcus epidermidis　Green arrows indicated Candida albicans　Blue arrows indicated inflammatory cells　a. Positive group (×2 000); b. Positive group (×4 000); c. Negative group (×2 000); d. Negative group (×4 000)

2.2.4. 组织学观察

术后 7 d 两组气管导管材料周围组织均可见明显炎症细胞浸润。与阴性组相比，阳性组周围组织中中性粒细胞与淋巴细胞浸润更严重，且有坏死组织。见图 5。

图 5.

HE staining observation of tissues surrounding endotracheal tube materials in the two groups at 7 days after operation

术后 7 d 两组气管导管材料周围组织 HE 染色观察

从左至右分别为放大 40、200、400 倍　a. 阳性组；b. 阴性组

From left to right for magnifications of 40, 200, and 400 times, respectively　a. Positive group; b. Negative group

2.2.5. 器官细菌感染检测

两组心脏、肝脏细菌感染数量差异无统计学意义（P>0.05）；阳性组肺、肾脏细菌感染数量高于阴性组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 3。

表 3.

Comparison of bacterial infections in organs at 7 days after operation [n=15，M (P₂₅, P₇₅), CFU/g]

术后 7 d 两组器官细菌感染情况比较 ［n=15，M（P₂₅，P₇₅），CFU/g］

组别 Group	心脏 Heart	肺 Lung	肝脏 Liver	肾脏 Kidney
阳性组 Positive group	5（0，50）	20（5，50）	10（5，50）	10（10，25）
阴性组 Negative group	0（0，20）	5（0，20）	5（0，20）	0（0，10）
统计值 Statistic	Z=206.000 P=0.239	Z=182.000 P=0.034	Z=198.000 P=0.144	Z=172.500 P=0.009

3. 讨论

凝固酶阴性葡萄球菌与念珠菌属形成的混合微生物感染是重要的医院内感染类型，其中约 25% 患者由于念珠菌属感染而引发菌血症，故与混合微生物相关的 BCI 日益受到临床关注^[18]。BCI 发生的重要机制是机体细菌与真菌感染后形成混合生物膜，以往研究多集中于探讨 ica 操纵子在单一微生物感染或体外生物膜中的作用，但在多种微生物感染背景下，了解种间相互作用及其对宿主的具体影响至关重要，因此进行符合人类宿主因素的体内研究成为新的挑战^[19]。在体内环境中，抵抗细菌与真菌感染的第一道防线是由先天免疫应答介导的，免疫细胞表面表达的模式识别受体（pattern-recognition receptor，PRR）可以识别病原体中相关的分子模式，PRR 包括巨噬细胞和树突状细胞中存在的 Toll 样受体（toll like receptor，TLR）和 C 型凝集素受体^[20]，大多数真菌的细胞壁组成成分可以通过 TLR-2、TLR-4 和 TLR-9 触发炎症因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 等的表达^[21]。其中 IL-6 释放与宿主体内微生物的感染密切相关，其水平升高会导致患者并发症发生率和死亡率增加^[22]。

本课题组前期体外研究将浓度为 1×10⁶ CFU/mL 的 ica 操纵子阳性表皮葡萄球菌与白假丝酵母菌混合培养 24 h，在气管导管材料表面能形成结构成熟的混合生物膜^[23]，故本次研究按照此方法制备气管导管材料混合生物膜后放置于兔体内。术后 7 d 阳性组 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 水平均明显高于阴性组，说明 ica 操纵子介导的混合生物膜导致炎症因子持续升高。有研究表明，在与白假丝酵母菌相关的混合生物膜体内模型中，炎症因子水平明显上调，分析可能与混合生物膜诱导炎症因子表达增加有关^{[2, 24]}。Holt 等^[4]的研究同样表明，在线虫宿主体内，白假丝酵母菌与表皮葡萄球菌形成的混合生物膜阳性组感染水平较未形成混合生物膜的阴性组升高，真菌细胞外基质可能是造成生物膜感染毒力增强的原因。本研究结果显示，术后 7 d 阳性组肺、肾脏细菌数量多于阴性组，提示 ica 操纵子介导了阳性组混合生物膜的形成，导致体内细菌在肺以及肾脏的传播增强。Pammi 等^[18]的研究也证实了混合生物膜相关的导管感染可导致表皮葡萄球菌向全身播散程度增加。另外，扫描电镜观察显示阳性组气管导管材料残余大量细菌，并存在混合生物膜结构，而阴性组清除情况良好。结合上述检测指标结果分析，ica 操纵子可能加强了混合生物膜结构，导致细菌感染持续存在。

表皮葡萄球菌 ica 操纵子介导的四基因产物多糖细胞间黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA）是细菌黏附生物材料过程中的重要因素，在细菌黏附后期聚集阶段，可能起到保护细菌免受宿主吞噬、改善局部营养环境的作用^[25]。与白假丝酵母菌相关的混合感染研究显示，PIA 加强了感染，提高了宿主死亡率。PIA 可以在宿主体内大量产生并大量消耗机体能量，这需要表达 ica 操纵子来进行严格调控。而研究表明 PIA 的产生和 ica 操纵子的表达取决于环境条件，这可能是 PIA 在不同葡萄球菌菌株以及不同类型感染中差异性表达的基础^[26]。在与白假丝酵母菌共生的环境中，ica 操纵子可能在增加细菌总体毒力方面发挥了作用，使共生的表皮葡萄球菌菌株更具有侵袭性，增强了混合生物膜结构和播散能力，导致细菌在宿主体内感染扩散增强且难以清除^[27]。既往研究已经确定了 Sar 蛋白家族、TcaR、σ^B、生物膜调节剂 Rbf、LuxS 等调节蛋白可直接作用于 ica 操纵子 DNA，而 ica 操纵子也可能通过改变调节蛋白的表达或活性与调节蛋白产生相互作用^[26]。即使在调节蛋白已被证明与 ica 操纵子 DNA 相结合的情况下，这些因子是如何调节转录仍不完全清楚^[28]。有研究认为多种调节因子在感染期间很可能共表达，但缺少关于这些因子如何与 DNA 或其他大分子相互作用来调节 ica 操纵子表达的信息。在与白假丝酵母菌的混合体内感染中，真菌也可以产生细胞外聚合物质（extracellular polymeric substances，EPS）调节生物膜和感染毒力，其他物种的 EPS 与 ica 操纵子调节的蛋白质是否也能发生相互作用并共同调节基因表达的信息，有待深入探究。

ica 操纵子介导的混合物感染可能导致临床治疗效果不理想，增加了患者感染发生率和死亡率^[29]。此外，从临床 BCI 患者气管导管装置表面获得的表皮葡萄球菌分离株，其 ica 操纵子基因座阳性率比常见的表皮葡萄球菌分离株更高，更具耐药性^[30]。本研究结果提示，ica 操纵子可能导致了气管导管材料表面细菌与真菌混合生物膜的加强及传播，造成感染的难治性，炎症迁延不愈。由于植入的气管导管周围环境复杂，这些条件很难在体外或动物模型中复制，且与 ica 操纵子作用产物相关的调节机制仍不清楚。因此，本研究仅对 ica 操纵子对混合生物膜相关炎症作用影响进行了初步体内探索，将进一步研究与 ica 操纵子调节多种微生物相关感染机制。

作者贡献：张国婧负责实验规划及实施、数据收集整理及统计学分析、文章撰写；万子琳参与实验实施、协助数据收集整理；周友全、陈颖、雷玉洁、乔丽梅协助数据收集整理、细菌复苏转板及生物材料制备；黄云超、王小燕负责实验设计、指导实验实施及文章撰写，对文章内容作批评性审阅。

利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中无利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

机构伦理问题：研究方案经昆明医科大学动物实验伦理审查委员会批准（KMMU2021007）。实验动物使用许可证号：SYXK（滇）2020-0006。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（81960335）；云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项资金项目［2017FE467（-098）］

National Natural Science Foundation of China (81960335); Yunnan Provincial Department of Science and Technology-Kunming Medical University Applied Fundamental Research Joint Special Fund Project [2017FE467(-098)]