咳嗽变异性哮喘患儿外周血miR-138及RUNX3对Th1/Th2平衡的调节作用

Abstract

Objective

To study the expression levels of microRNA-138 (miR-138) and Runt-related transcription factor 3 (RUNX3) in peripheral blood of children with cough variant asthma (CVA) and their regulatory effects on Th1/Th2 balance.

Methods

Sixty-five children with CVA (CVA group) and 30 healthy children (control group) were enrolled. Peripheral venous blood samples were collected for both groups, and CD4⁺ T cells were isolated and cultured. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to measure the levels of interferon (IFN)-γ, interleukin (IL)-2, IL-4, IL-5, and IL-13 that were secreted by CD4⁺ T cells. Flow cytometry was used to determine the percentages of Th1 and Th2 cells. Quantitative real-time PCR was used to measure the level of RUNX3 mRNA in CD4⁺ T cells and the level of miR-138 in peripheral blood. Western blot was used to determine the protein expression of RUNX3 in CD4⁺ T cells. The dual-luciferase reporter assay was used to determine the targeting effects of miR-138 and RUNX3. The RUNX3-mimic plasmid was transfected into CD4⁺ T cells, and the effects on the levels of IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5, and IL-13 and the percentages of Th1 and Th2 cells were measured.

Results

Compared with the control group, the CVA group showed significantly decreased levels of IFN-γ and IL-2 from CD4⁺ T cells, significantly increased levels of IL-4, IL-5, and IL-13 from CD4⁺ T cells, significantly decreased Th1 cell percentage and Th1/Th2 ratio, and a significantly increased Th2 cell percentage (P<0.05). The CVA group showed significantly lower relative expression levels of RUNX3 mRNA and protein in CD4⁺ T cells in peripheral blood than the control group (P<0.001). The relative expression level of miR-138 was significantly higher in the CVA group than in the control group (P<0.001). MiR-138 could target the expression of RUNX3. Upregulating the expression of RUNX3 in CD4⁺ T cells induced significantly increased levels of IFN-γ and IL-2, significantly decreased levels of IL-4, IL-5, and IL-13, significantly increased Th1 cell percentage and Th1/Th2 ratio, and a significantly decreased Th2 cell percentage (P<0.05).

Conclusions

MiR-138 regulates Th1/Th2 balance by targeting RUNX3 in children with CVA, providing a new direction for the treatment of CVA.

咳嗽变异性哮喘（cough variant asthma，CVA）是一种特殊类型的哮喘，临床上以咳嗽为主要症状甚至是唯一症状。在学龄前期和学龄期儿童中常见，以反复发作和迁延不愈为特点。因此探索CVA的发病机制，合理治疗对避免CVA发展为典型哮喘具有一定帮助。近年来，T辅助细胞反应的不平衡一直受到关注，T辅助细胞分为两大类，Th1和Th2^［1］。Th1细胞主要分泌白细胞介素（interleukin，IL）-2、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF），它们参与细胞感染的防御机制^［2］。Th2细胞主要分泌的细胞因子有IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13，参与过敏性炎症反应^［3］。然而，在哮喘患者中观察到Th1/Th2失衡，Th2过度反应使其分泌的细胞因子增多，引发一连串免疫激活反应，导致IgE产生增加，促进嗜酸性粒细胞的生长和分化及黏液分泌增加，诱发气道炎症^［4］。有研究显示，叶乙醇提取物通过抑制过敏性哮喘小鼠模型中的核转录因子-κB信号转导和组胺分泌，调节Th1/Th2失衡，从而减轻小鼠气道炎症反应^［5］。间充质干细胞条件培养基通过调节CD4⁺T细胞向Th1/Th2效应细胞分化，可缓解卵清蛋白诱导的小鼠哮喘反应^［6］。这些研究表明调节Th1/Th2 平衡可能是治疗CVA的一种新颖策略。

Runt相关转录因子3（Runt-related transcrip-tion factor 3，RUNX3）由高度保守且结构相似的RUNX基因家族编码，分布于外周血和免疫系统中，RUNX3蛋白表达失衡与多种疾病有关^［7-9］。RUNX3在T细胞发育中具有关键功能，参与T辅助细胞分化，具有增强IFN-γ分泌和抑制IL-4分泌的双重作用，还可作用于T细胞的分化，影响Th1/Th2的平衡^［10］。因此RUNX3对Th1/Th2平衡具有一定调节作用，有可能成为治疗哮喘的潜在靶点。微小RNA （microRNA，miR）是18~22个核苷酸组成的非编码RNA，是基因表达的微妙调控因子，在多种疾病中发挥作用，尤其是在慢性多因素疾病如哮喘^［11］。有研究显示，miR-138在哮喘中可调节树突状细胞介导的Th2型免疫反应，参与哮喘的发病^［12］。另有研究显示在银屑病中miR-138可通过靶向调节RUNX3的表达影响Th1/Th2的平衡^［13］。因此本文探讨miR-138和RUNX3对CVA Th1/Th2平衡的影响，并进一步分析二者间是否具有靶向作用，为CVA的临床治疗提供方向。

1. 资料与方法

1.1. 一般资料

前瞻性选取2019年1月至2021年1月在我院接受治疗的CVA患儿65例纳入CVA组，其中男35例，女30例，年龄（8.7±2.6）岁。纳入标准：（1）CVA患儿的诊断符合《中国儿童慢性咳嗽诊断与治疗指南（2013年修订）》^［14］；（2）均为首次确诊患儿。排除标准：（1）合并肺结核或肺部感染；（2）合并免疫性疾病或过敏性疾病；（3）近期服用过免疫抑制剂或抗生素；（4）合并血液系统疾病；（5）合并肿瘤。同期选取健康受试者30例纳入健康对照组，排除近3个月有呼吸道感染史或有哮喘史的儿童，其中男18例，女12例，年龄（7.3±2.0）岁。两组儿童性别构成比和年龄比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经过医院伦理委员会批准（20181576），家属知情同意。

1.2. 外周血中CD4⁺T细胞的分离培养

收集CVA组和健康对照组儿童外周静脉血样本，乙二胺四乙酸抗凝后保存待用。通过Ficoll分离液溶液（北京索莱宝科技有限公司）梯度离心分离外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），利用RPMI培养基洗涤并重悬于RPMI培养基中。然后将PBMC与抗CD4⁺单克隆抗体的磁珠包被，分离CD4⁺T细胞，采用完全T细胞培养基（RPMI1640培养基，10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素，50 μmol/L β-巯基乙醇，100 U/mL IL-2）培养CD4⁺T细胞。

1.3. ELISA法检测IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-13水平

收集CVA组和健康对照组儿童CD4⁺T细胞的培养上清液，根据ELISA试剂盒说明书检测IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-13的浓度。

1.4. 流式细胞仪检测Th1和Th2细胞所占比例

收集CVA组和健康对照组CD4⁺T细胞，加入10 μL IFN-γ或IL-4细胞因子，促进T细胞向Th1细胞和Th2细胞分化，放置恒温箱中孵育4 h。加入10 μL CD3-PC5和CD8-PC7单克隆抗体，室温避光孵育15 min。加入固定液，再次放置15 min。加入3 mL PBS溶液，3 000 r/min离心5 min，弃上清。加入10 μL IL-4-藻红蛋白单克隆抗体、IFN-γ-异硫氰酸荧光素单克隆抗体避光孵育15 min。各管加入3 mL PBS，3 000 r/min 离心5 min，弃上清。0.5 mL PBS溶液重悬细胞，流式细胞仪检测Th1、Th2细胞百分比。

1.5. 实时荧光定量PCR检测CD4⁺T细胞中RUNX3 mRNA的表达水平

利用TRIzol试剂（上海联迈生物工程有限公司）提取CD4⁺T细胞的总RNA。根据TaKaRa RNA反转录试剂盒（宝生物工程大连有限公司）说明书将总RNA反转录为cDNA，反转录条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。以cDNA为模板，RUNX3上游引物序列5'-UACCGACCGAGCACAUCCAU-3'，下游引物序列5'-AGCCGCGAGGACUCGAUCCU-3'；以管家基因U6 mRNA水平作为内参照，U6上游引物序列5'-UCAAGCACGAUCAUGAU-3'，下游引物序列5'-GUCAAGUUAGGUCGGUA-3'。按照TaKaRa实时荧光定量PCR试剂盒（宝生物工程大连有限公司）说明书进行PCR扩增。PCR扩增反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。采用2^-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.6. Western blot检测CD4⁺T细胞中RUNX3蛋白表达水平

提取CD4⁺T细胞的总蛋白，经BCA蛋白定量，取30 μg蛋白，经SDS-PAGE分离。将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上。1%BSA室温封闭2 h，加入anti-RUNX3或anti-β-actin抗体（1∶1 000稀释），4℃孵育过夜。次日，加入相对应的二抗（1∶4 000稀释），室温孵育1 h。滴加化学发光剂，在Amersham Imager 600凝胶成像系统中拍照曝光。RUNX3蛋白表达水平以RUNX3蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值表示。

1.7. 双荧光素酶报告基因实验

Starbase数据库显示，miR-138基因序列中GUGGUCG碱基与RUNX3 3'UTR野生型（wild type，WT）基因序列中CACCAGC碱基配对，形成沉默复合体，阻碍RUNX3基因转录翻译，降低RUNX3蛋白表达水平；RUNX3 3'UTR突变型（mutation type，MUT）基因序列中与miR-138基因序列互补配对的碱基突变为CGUAUCG（图1）。根据RUNX3突变位点设计WT和MUT荧光素酶报告载体，分别设置RUNX3 WT组、RUNX3 WT+miR-138 mimic组、RUNX3 MUT组和RUNX3 MUT+miR-138 mimic组，各组对应加入RUNX3 WT荧光素酶报告载体、RUNX3 WT荧光素酶报告载体+miR-138 mimic、RUNX3 MUT荧光素酶报告载体、RUNX3 MUT荧光素酶报告载体+miR-138 mimic。采用Lipofectamine^TM 2000转染试剂辅助共转染至CD4⁺T细胞中，转染48 h后，PBS清洗1次，每孔加入100 μL裂解液，室温震荡10 min，收集细胞裂解液。每组取20 μL细胞裂解液与10 μL荧光素酶检测试剂快速混匀后，用生物发光检测仪检测各组荧光值。

图1. miR-138靶向调节RUNX3 .

1.8. RUNX3-mimic质粒转染CVA组CD4⁺T细胞

将CD4⁺T细胞接种于6孔板中，每孔40万个细胞，培养24 h后，随机分为对照组、NC-mimic组和RUNX3-mimic组，每组设3个复孔，参照Lipofectamine 2000说明书，NC-mimic组和RUNX3-mimic组分别转染NC-mimic（对照质粒）、RUNX3-mimic质粒，对照组不予转染（质粒均由湖南丰晖生物科技有限公司合成）。转染6 h后，更换新的培养基，继续培养48 h，收集各组细胞，采用Western blot检测转染效率。然后检测对照组、NC-mimic和RUNX3-mimic组间IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-13水平及Th1、Th2细胞比例。

1.9. 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（$\overline{x}\pm s$）表示，两组间比较采用两样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 两组间Th1、Th2细胞比例及其分泌主要细胞因子水平变化

CVA组与健康对照组相比，Th1分泌的主要细胞因子IFN-γ和IL-2水平降低，Th2分泌的主要细胞因子IL-4、IL-5和IL-13水平增加（P<0.001）。CVA组Th1细胞比例和Th1/Th2比值低于健康对照组，Th2细胞比例高于健康对照组（P<0.05）。见表1。

表1.

两组间Th1、Th2细胞比例及其分泌主要细胞因子水平比较 （$\overline{x}\pm s$）

组别	n	IFN-γ (ng/L)	IL-2 (ng/L)	IL-4 (ng/L)	IL-5 (ng/L)	IL-13 (ng/L)	Th1 (%)	Th2 (%)	Th1/Th2
健康对照组	30	564±62	305±32	136±14	126±16	176±15	8.4±1.6	1.5±0.4	4.2±1.2
CVA组	65	322±24	174±21	252±18	284±21	326±28	3.8±0.5	2.3±0.8	1.2±0.3
t值		23.652	32.145	15.214	18.325	20.625	8.201	3.652	4.263
P值		<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	0.026	0.005

注：［IFN-γ］干扰素-γ；［IL］白细胞介素。

2.2. 两组外周血CD4⁺T细胞RUNX3 mRNA及其蛋白表达水平变化

CVA组外周血CD4⁺T细胞RUNX3 mRNA相对表达水平为0.42±0.10，低于健康对照组（3.14±0.16，t=8.251，P<0.001）。CVA组外周血中CD4⁺T细胞RUNX3蛋白相对表达水平为0.14±0.03，低于健康对照组（1.16±0.12，t=5.965，P<0.001），见图2。

图2. Western blot检测两组外周血CD4⁺T细胞RUNX3蛋白表达电泳图.

2.3. CVA组miR-138的表达水平及与RUNX3的靶向调节作用

CVA组miR-138的相对表达水平为2.35±0.21，高于健康对照组（0.41±0.07，t=6.458，P<0.001）。RUNX3 WT组、RUNX3 WT+miR-138 mimic组、RUNX3 MUT组和RUNX3 MUT+miR-138 mimic组间相对荧光素酶活性分别为1.02±0.23、0.42±0.09、1.10±0.12、1.07±0.18，4组比较差异有统计学意义（F=9.251，P<0.001）。RUNX3 WT+miR-138 mimic组相对荧光素酶活性低于RUNX3 WT组（P=0.008），而RUNX3 MUT组和RUNX3 MUT+miR-138 mimic组相对荧光素酶活性与RUNX3 WT组相比差异无统计学意义（P>0.05）。

2.4. 增加CD4⁺T细胞中RUNX3的表达对Th1/Th2及其分泌的主要细胞因子的影响

对照组、NC-mimic组和RUNX3-mimic组的RUNX3蛋白灰度值分别为0.56±0.12、0.62±0.14和1.52±0.17，三组比较差异有统计学意义（F=8.634，P<0.001），且RUNX3-mimic组RUNX3蛋白灰度值高于对照组和NC-mimic组（P<0.001）（图3）。与对照组和NC-mimic组相比，RUNX3-mimic组中IFN-γ和IL-2水平升高，IL-4、IL-5和IL-13水平降低，Th1细胞比例和Th1/Th2比值增加，Th2比值细胞比例降低（P<0.05），见表2。

图3. Western blot法检测各组CD4⁺T细胞中RUNX3蛋白表达电泳图.

表2.

增加CD4⁺T细胞中RUNX3的表达对Th1/Th2及其分泌主要因子的影响 （n=3，$\overline{x}\pm s$）

组别	IFN-γ (mg/L)	IL-2 (mg/L)	IL-4 (mg/L)	IL-5 (mg/L)	IL-13 (mg/L)	Th1 (%)	Th2 (%)	Th1/Th2
对照组	307±17	186±15	236±18	282±15	275±17	3.2±0.8	2.1±0.4	1.2±0.5
NC-mimic组	315±19	180±18	248±16	276±22	270±18	3.5±0.9	2.3±0.6	1.2±0.4
RUNX3-mimic组	378±25a	284±19a	124±14a	140±19a	147±13a	7.3±1.8a	1.7±0.4a	3.8±1.0a
F值	11.251	15.654	16.632	17.625	18.142	6.625	3.854	4.210
P值	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	0.010	0.006

注：［IFN-γ］干扰素-γ；［IL］白细胞介素。a示与对照组和NC-mimic组相比，P<0.05。

3. 讨论

众所周知，Th1/Th2细胞失衡及其分泌的细胞因子与哮喘的发生密切相关。在生理条件下，Th1和Th2细胞之间存在动态平衡，当这种平衡被打破时，会诱发哮喘发生^［15］。Th2细胞主要产生IL-4、IL-5和IL-13，它们可增加血清中的IgE水平并募集嗜酸性粒细胞，诱导气道高反应^［16］。Th1细胞分泌IFN-γ和IL-2可拮抗Th2诱导的免疫反应并抑制哮喘的发展^［17］。本研究发现CVA组的IL-2和IFN-γ水平低于健康对照组，而IL-4、IL-5和IL-13水平高于健康对照组，表明CVA患儿存在Th1/Th2细胞失衡。通过提高Th1细胞水平同时抑制Th2细胞水平以恢复Th1/Th2平衡，应该是治疗哮喘的有效策略。已有研究显示，调节Th1/Th2细胞因子失衡可以减轻哮喘的炎症反应^［15-18］。目前调节Th1/Th2平衡的主要为化学药物制剂，在本研究中主要探讨miRNA对Th1/Th2平衡的调节作用。因为miRNAs具有独特的特性，且易于合成和操作，在治疗疾病方面具有一定优势，另外其在哮喘中起着不可或缺的作用。

本研究中，CVA组miR-138的表达水平高于健康对照组，推测其可能参与哮喘的发病。以往有研究显示在银屑病中，miR-138可靶向调节RUNX3，缓解Th1/Th2的失衡^［13］。在本研究中通过荧光素酶活性试验检测结果显示miR-138亦可直接靶向调节RUNX3。通常miRNAs通过调节相关靶基因来发挥作用，因此值得寻找miRNA相关的靶基因，并分析其对Th1、Th2的影响，为CVA的治疗提供方向。以往有研究显示miRNAs参与气道重塑诱发支气管哮喘发病^［19-22］。然而miR-138靶向调节RUNX3后对Th1/Th2平衡是否存在影响，本研究通过转染实验增加RUNX3的表达水平后可改善Th1/Th2失衡，表明RUNX3对Th1/Th2平衡有一定调节作用。RUNX3对Th1/Th2平衡调节可能的作用机制如下：在Th1细胞分化过程中，RUNX3在CD4⁺T细胞中的表达增加，并以正反馈方式作用于T-bet转录因子^［23］。T-bet是Th1细胞分化和IFN-γ分泌的启动子，同时抑制Th2相关的免疫事件^［24］。另有研究表明RUNX3可以减弱Th2相关转录因子，后者是Th2分化的主要调节因子，并且是Th2介导的免疫反应所必需的^［13］。

综上所述，CVA患儿存在Th1/Th2失衡、miR-138表达水平增加，RUNX3表达水平降低，miR-138可直接靶向调节RUNX3。增加RUNX3的表达水平后可改善Th1/Th2失衡，为CVA的治疗提供新的方向。