Abstract
目的
探究足月健康新生儿生后3月龄时的免疫功能特点，并分析其与喂养方式及性别的关系。
方法
前瞻性选取北京及呼和浩特4家医院出生的足月健康新生儿84例为研究对象，生后4月龄内喂养方式不变，根据喂养方式分为母乳喂养组（26例）和奶粉喂养组（58例）。于生后3月龄时采集两组婴儿外周静脉血标本，检测细胞免疫、体液免疫功能及血常规，比较上述实验室指标在不同喂养方式、性别的婴儿中有无显著性差异。
结果
母乳喂养组T细胞第二信号受体CD28表达比例、免疫球蛋白M、中性粒细胞比例及计数均显著低于奶粉喂养组（P<0.05），CD8+T细胞表面激活标记物HLA-DR的计数及比例、淋巴细胞比例显著高于奶粉喂养组（P<0.05）。男婴白细胞计数低于女婴，嗜酸性粒细胞比例高于女婴（P<0.05）。
结论
性别对3月龄足月婴儿淋巴细胞亚群比例无显著影响；不同喂养方式可改变其CD28+T细胞（淋巴细胞功能亚群）和HLA-DR+T细胞（淋巴细胞激活亚群）表达比例，提示喂养方式对3月龄足月婴儿免疫功能发育过程存在一定影响。
Keywords: 喂养方式, 细胞亚群, 免疫球蛋白, 婴儿
Abstract
Objective
To explore the characteristics of immune function of healthy full-term infants at the age of 3 months, and to analyze the relationship of immune function with feeding pattern and sex.
Methods
A total of 84 healthy full-term infants born in four hospitals in Beijing and Hohhot, China were prospectively recruited. Their feeding patterns remained unchanged within 4 months after birth. They were divided into a breast-feeding group and a milk powder feeding group according to their feeding patterns. At the age of 3 months after birth, peripheral venous blood samples of the two groups were collected to evaluate cellular immunity and humoral immunity and perform routine blood test. The laboratory indices were compared between infants with different feeding patterns and sexes.
Results
Compared with the milk powder feeding group, the breast-feeding group had significantly lower proportion of T cell second signal receptor CD28, immunoglobulin M, and proportion and absolute count of neutrophils (P<0.05) and significantly higher expression and proportion of HLA-DR, a surface activation marker of CD8+ T cells, and proportion of lymphocytes (P<0.05). The male infants had a significantly lower white blood cell count and a significantly higher proportion of eosinophils compared with the female infants (P<0.05).
Conclusions
Sex has no significant effect on the proportion of lymphocyte subsets in 3-month-old full-term infants, but feeding patterns are associated with the proportion of CD28+ T cells (lymphocyte functional subset) and HLA-DR+ T cells (lymphocyte activation subset), suggesting that feeding patterns have a certain effect on the development of immune function in 3-month-old full-term infants.
Keywords: Feeding pattern, Lymphocyte subset, Immunoglobulin, Infant
母乳喂养可以降低婴幼儿患感染性疾病的风险，这与母乳中的很多活性成分有关，这些成分参与婴幼儿的体液免疫反应及细胞免疫反应，也可促进婴幼儿器官功能成熟。目前关于喂养方式与婴儿自身免疫功能关系的研究逐步开展，本研究检测了不同喂养方式在3月龄健康足月婴儿中，包括外周血淋巴细胞亚群在内的免疫功能特点，并分析其与喂养方式、性别的关系。
此外，婴儿的免疫系统处在较快发育过程中，但婴儿免疫功能检测受到参考值不规范的制约，开展较少。有文献报道儿童淋巴细胞亚群的参考值，但因儿童淋巴细胞亚群随年龄而变化，文献中3月龄及以下婴儿样本量少，无法在婴儿中按月龄区分参考值；另外，淋巴细胞亚群可能受到种族、地理位置、性别、环境因素等影响，导致参考值存在一定差异［1］，使国外研究数据在中国人中的应用价值受到影响。本研究探讨了中国3月龄足月婴儿免疫功能指标的参考值，为评估健康婴儿免疫功能提供参考数据。
1. 资料与方法
1.1. 研究对象
本研究为前瞻性队列研究，研究对象来自北京及呼和浩特共4家医院（华北新生儿联盟成员单位），包括北京协和医院、内蒙古自治区人民医院、内蒙古医科大学附属医院、内蒙古妇幼保健院。本研究经过北京协和医院伦理委员会审批（ZS-1148）。
纳入标准：（1）2016年12月至2017年12月期间出生。（2）出生胎龄≥37周。（3）出生体重≥2.5 kg。（4）家长自愿加入研究，并签署知情同意书。
排除标准：（1）出生胎龄<37周。（2）出生体重<2.5 kg。（3）患儿存在严重慢性疾病，如心力衰竭、遗传代谢性疾病或先天性消化道畸形等。（4）患儿在随访期间出现原发性免疫缺陷病（primary immunodeficiency disorder，PID）可疑表现者［2］。
根据家长所选择的喂养方式分为母乳喂养组和奶粉喂养组。将生后4个月内纯母乳喂养儿纳入母乳喂养组，在生后40 d常规随诊时入组。将由于母亲疾病或用药而不能母乳喂养者纳入奶粉喂养组，生后即入组；喂养奶粉为在本研究所免费提供奶粉中自选种类，均为上市销售的产品，生后4个月内使用同一奶粉品牌纯奶粉喂养。两组婴儿在生后4个月内均为纯母乳喂养或纯奶粉喂养，均未添加辅食。
退出标准：（1）喂养方式在4个月内发生改变者；（2）家长因任何原因要求退出研究者。
1.2. 研究方法
两组婴儿于生后3月龄时采集外周静脉血标本5 mL，检测细胞免疫（淋巴细胞亚群）、体液免疫（包括IgG、IgA、IgM）功能，以及血常规。比较上述指标在不同喂养方式和性别的婴儿中有无显著性差异。
外周血淋巴细胞亚群检测：所检测淋巴细胞亚群包括B细胞（CD3-CD19+）、NK细胞（CD3-CD56+CD16+）、CD4+T细胞（CD3+CD4+）、CD8+T细胞（CD3+CD8+）、CD4+T和CD8+T细胞的第二信号受体CD28表达比例（CD4+CD28+/CD4+、CD8+CD28+/CD8+）、CD8+T细胞的HLA-DR、CD38表达比例（CD8+DR+/CD8+、CD8+CD38+/CD8+）、Naive细胞比例（CD4+CD45RA+/CD4+）、记忆T4细胞比例（CD4+CD45RA-/CD4+）。具体检测方法参照文献［3］。细胞计数和比例采用中位数表示，计数单位为个/μL。
1.3. 统计学分析
使用SPSS 22.0统计软件对数据进行统计学分析。正态分布计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用两样本t检验；非正态分布计量资料以中位数（P 10，P 90）表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料采用百分率（%）表示，两组间比较采用Fisher确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 基本资料特征
本研究入组91例，中途退出7例，共84例婴儿纳入研究。其中男45例，女39例；出生胎龄（39.3±1.1）周（范围37~42周），出生体重（3 313±395）g（范围2 500~4 400 g），出生身长（50.1±1.9）cm（范围45.0~54.0 cm），出生头围（33.7±0.8）cm（范围32.0~35.0 cm）；母亲年龄（31±4）岁（范围21~42岁）。母乳喂养组26例，奶粉喂养组58例。因婴儿外周静脉血采集存在一定技术困难，最终共采得84例有效血常规，82例有效免疫球蛋白检查；21例行淋巴细胞亚群检查。其中随访60例，随访年龄（23.5±3.7）月龄，均无慢性疾病及PID在婴儿期的可疑表现。表1列出了3月龄婴儿免疫功能及血常规指标检测结果，以供临床参考。
表1.
3月龄婴儿免疫功能及血常规检测结果［（）或中位数（P 10，P 90）］
| 实验室指标 | n | 数值 |
|---|---|---|
| IgG (g/L) | 82 | 3.0±1.5 |
| IgA (g/L) | 82 | 0.16±0.19 |
| IgM (g/L) | 82 | 0.35(0.21, 0.58) |
| WBC计数 (×109/L) | 84 | 8.5±2.8 |
| LY (%) | 83 | 64±12 |
| LY计数 (×109/L) | 83 | 5.00(3.05, 8.11) |
| NEUT (%) | 83 | 24±11 |
| NEUT计数 (×109/L) | 83 | 2.1±1.5 |
| Mono (%) | 83 | 6.6±2.2 |
| EOS (%) | 83 | 3.6±2.0 |
| RBC计数 (×1012/L) | 84 | 4.1±0.5 |
| Hb (g/L) | 84 | 117±14 |
| HCT (%) | 84 | 36±5 |
| PLT计数 (×109/L) | 84 | 377±127 |
| B (%) | 20 | 23±7 |
| B计数 (个/μL) | 20 | 1 070.5(626.4, 2 126.1) |
| NK (%) | 21 | 4.70(2.02, 9.36) |
| NK计数 (个/μL) | 21 | 215.0(82.0, 853.2) |
| T (%) | 21 | 71±7 |
| T计数 (个/μL) | 21 | 3 420.0(2 234.0, 5 883.8) |
| CD4+T (%) | 21 | 50±8 |
| CD4+T计数 (个/μL) | 21 | 2 251.0(1 628.0, 4 334.6) |
| CD8+T (%) | 21 | 18±5 |
| CD8+T计数 (个/μL) | 21 | 919±378 |
| CD4+CD28+/CD4+ (%) | 18 | 99.70(97.96, 100.00) |
| CD4+CD28+/CD4+计数 (个/μL) | 18 | 2 161.5(1 565.5, 4 641.3) |
| CD8+CD28+/CD8+ (%) | 18 | 93.00(66.86, 95.86) |
| CD8+CD28+/CD8+计数 (个/μL) | 18 | 819±349 |
| CD8+DR+/CD8+ (%) | 18 | 2.90(0.74, 27.94) |
| CD8+DR+/CD8+计数 (个/μL) | 18 | 23.0(5.7, 343.6) |
| CD8+CD38+/CD8+ (%) | 18 | 95.2±1.7 |
| CD8+CD38+/CD8+计数 (个/μL) | 18 | 891±361 |
| Naive细胞CD4+CD45RA+/CD4+ (%) | 18 | 77.60(56.53, 86.50) |
| Naive细胞CD4+CD45RA+/CD4+计数 (个/μL) | 18 | 1 713.5(934.9, 3 228.5) |
| 记忆T4细胞CD4+CD45RA-/CD4+ (%) | 18 | 22.40(13.50, 43.47) |
| 记忆T4细胞CD4+CD45RA-/CD4+计数 (个/μL) | 18 | 478.5(366.2, 1 006.5) |
| CD4/CD8 (%) | 21 | 2.94(1.71, 5.46) |
注：［Ig］免疫球蛋白；［WBC］白细胞；［LY］淋巴细胞；［NEUT］中性粒细胞；［Mono］单核细胞；［EOS］嗜酸性粒细胞；［RBC］红细胞；［Hb］血红蛋白；［HCT］红细胞压积；［PLT］血小板；［B］B淋巴细胞；［NK］自然杀伤细胞；［T］T淋巴细胞。
2.2. 不同喂养方式的婴儿基本资料及在生后3月龄时的实验室指标分析
母乳喂养组中，男10例，女16例；出生胎龄（39.6±1.1）周，出生体重（3 340±460）g，出生身长49.0（46.2，52.0）cm，出生头围（33.8±1.3）cm；母亲年龄30（27，34）岁。资料完整的18例中，母亲怀孕前BMI（21.1±4.1）kg/m2，孕期增重（16±7）kg，围生期有6%（1/18）使用过抗生素；婴儿3月龄内均未使用抗生素；44%（8/18）的婴儿有兄弟姐妹，6%（1/18）的婴儿家庭有宠物，89%（16/18）的婴儿居住在城市，50%（9/18）的婴儿为顺产。
奶粉喂养组中，男35例，女23例；出生胎龄（39.0±1.1）周，出生体重（3 283±385）g，出生身长50.0（48.0，53.0）cm，出生头围（33.6±0.8）cm；母亲年龄31（25，39）岁；资料完整的42例中，母亲怀孕前BMI（21.3±4.0）kg/m2，孕期增重（13±6）kg，围生期有17%（7/42）使用过抗生素；婴儿3月龄内有17%（7/42）使用过抗生素；50%（21/42）的婴儿有兄弟姐妹，5%（2/42）的婴儿家庭有宠物，79%（33/42）的婴儿居住在城市，40%（17/42）的婴儿为顺产。两组间婴儿的上述基本情况中，仅母乳喂养组的母亲年龄小于奶粉喂养组（Z=-2.001，P=0.045），余资料比较差异均无统计学意义（P>0.05）。
实验室指标方面，T细胞第二信号受体CD28表达比例（包括CD4+T细胞和CD8+T细胞），在母乳喂养组显著低于奶粉喂养组（P<0.05）。CD8+T细胞表面激活标记物HLA-DR的计数及比例，在母乳喂养组显著高于奶粉喂养组（P<0.05）。母乳喂养组免疫球蛋白M、中性粒细胞比例及计数均显著低于奶粉喂养组，淋巴细胞比例显著高于奶粉喂养组（P<0.05）。见表2。
表2.
不同喂养方式的婴儿在3月龄时差异有统计学意义的实验室指标比较 ［中位数（P 10，P 90）］
| 实验室指标 | n | 母乳喂养组 | n | 奶粉喂养组 | Z值 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| IgM (g/L) | 25 | 0.31(0.18, 0.47) | 57 | 0.37(0.21, 0.63) | -2.011 | 0.044 |
| LY (%) | 26 | 68.75(59.09, 79.83) | 57 | 62.50(44.38, 78.26) | -2.612 | 0.009 |
| NEUT (%) | 26 | 19.60(9.49, 28.76) | 57 | 24.00(14.04, 45.42) | -2.788 | 0.005 |
| NEUT计数 (×109/L) | 26 | 1.53(0.64, 2.88) | 57 | 1.76(1.12, 3.71) | -2.067 | 0.039 |
| CD4+CD28+/CD4+ (%) | 6 | 98.85(97.60, 99.62) | 12 | 99.70(99.13, 100.00) | -2.804 | 0.005 |
| CD8+CD28+/CD8+ (%) | 6 | 69.70(65.60, 91.74) | 12 | 94.60(90.02, 96.22) | -2.905 | 0.004 |
| CD8+DR+/CD8+ (%) | 6 | 22.80(3.20, 28.64) | 12 | 2.35(0.38, 3.97) | -3.188 | 0.001 |
| CD8+DR+/CD8+计数 (个/μL) | 6 | 157.50(20.00, 346.60) | 12 | 20.00(3.90, 58.10) | -2.719 | 0.007 |
注：［IgM］免疫球蛋白M；［LY］淋巴细胞；［NEUT］中性粒细胞。
2.3. 不同性别的婴儿在生后3月龄的免疫功能及血常规的特点分析
男婴45例，出生胎龄39+2（37+3，40+3）周，出生体重（3 356±355）g，出生身长（50.3±1.7）cm，出生头围（33.6±0.8）cm；母亲年龄（31±4）岁，怀孕前BMI（22.1±3.8）kg/m2，孕期增重（14±6）kg。资料完整的32例中，母亲围生期有12%（4/32）使用过抗生素；婴儿3月龄内有12%（4/32）使用过抗生素；44%（14/32）的婴儿有兄弟姐妹，3%（1/32）的婴儿家庭有宠物，91%（29/32）的婴儿居住在城市，47%（15/32）的婴儿为顺产，22%（10/45）的婴儿为纯母乳喂养。
女婴39例，出生胎龄39+3（37，40+4）周，出生体重（3 237±457）g，出生身长（49.8±2.2）cm，出生头围（33.7±0.8）cm；母亲年龄（31±5）岁，怀孕前BMI（20.3±4.0）kg/m2，孕期增重（14±7）kg。资料完整的28例中，母亲围生期有14%（4/28）使用过抗生素；婴儿3月龄内有11%（3/28）使用过抗生素；54%（15/28）的婴儿有兄弟姐妹，7%（2/28）的婴儿家庭有宠物，71%（20/28）的婴儿居住在城市，39%（11/28）的婴儿为顺产，41%（16/39）的婴儿为纯母乳喂养。按性别分组，比较两组间婴儿的上述基本情况，差异均无统计学意义（P>0.05）。
实验室指标方面，男婴白细胞计数低于女婴，嗜酸性粒细胞比例高于女婴（P<0.05）。余免疫功能及血常规指标在两组婴儿3月龄时比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3。
表3.
男婴和女婴在3月龄时免疫功能及血常规指标比较 ［中位数（P 10，P 90）］
| 实验室指标 | n | 男 | n | 女 | Z值 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| IgG (g/L) | 44 | 2.89(1.56, 4.65) | 38 | 2.74(1.62, 4.48) | -0.135 | 0.893 |
| IgA (g/L) | 44 | 0.12(0.06, 0.23) | 38 | 0.12(0.07, 0.25) | -0.144 | 0.885 |
| IgM (g/L) | 44 | 0.35(0.20, 0.76) | 38 | 0.35(0.22, 0.51) | -0.540 | 0.589 |
| WBC计数 (×109/L) | 45 | 7.53(5.00, 11.29) | 39 | 8.68(6.11, 14.47) | -2.466 | 0.014 |
| LY (%) | 45 | 63.60(49.30, 78.32) | 38 | 65.40(44.58, 78.90) | -0.443 | 0.658 |
| LY计数 (×109/L) | 45 | 4.68(2.71, 7.55) | 38 | 5.18(3.27, 9.12) | -1.791 | 0.073 |
| NEUT (%) | 45 | 22.00(11.16, 34.62) | 38 | 22.95(10.28, 45.26) | -0.411 | 0.681 |
| NEUT计数 (×109/L) | 45 | 1.74(0.81, 2.80) | 38 | 1.79(1.07, 4.75) | -1.417 | 0.157 |
| Mono (%) | 45 | 6.70(4.52, 9.34) | 38 | 5.95(3.70, 8.20) | -1.957 | 0.050 |
| EOS (%) | 45 | 3.80(1.70, 7.76) | 38 | 2.75(0.90, 3.81) | -3.553 | <0.001 |
| RBC计数 (×1012/L) | 45 | 4.10(3.61, 4.71) | 39 | 4.05(3.63, 4.85) | -0.233 | 0.816 |
| Hb (g/L) | 45 | 114.0(103.0, 129.6) | 39 | 115.0(106.0, 128.0) | -1.136 | 0.256 |
| HCT (%) | 45 | 35.20(30.96, 40.26) | 39 | 35.80(32.10, 40.40) | -1.700 | 0.089 |
| PLT计数 (×109/L) | 45 | 382.0(201.4, 550.0) | 39 | 389.0(168.0, 534.0) | -0.655 | 0.513 |
| B (%) | 11 | 22.70(14.98, 34.70) | 9 | 20.40(13.80, 30.70) | -0.152 | 0.879 |
| B计数 (个/μL) | 11 | 1 135.0(532.8, 2 082.2) | 9 | 966.0(620.0, 1 236.0) | -1.026 | 0.305 |
| NK (%) | 12 | 3.80(2.16, 13.05) | 9 | 6.00(1.70, 8.40) | -1.209 | 0.227 |
| NK计数 (个/μL) | 12 | 199.5(87.2, 810.8) | 9 | 237.0(61.0, 418.0) | -0.640 | 0.522 |
| T (%) | 12 | 69.40(61.79, 80.31) | 9 | 71.30(57.30, 76.90) | -0.071 | 0.943 |
| T计数 (个/μL) | 12 | 3 410.0(2 529.5, 5 750.2) | 9 | 3 551.0(1 857.0, 4 270.0) | -0.142 | 0.887 |
| CD4+T (%) | 12 | 47.75(40.34, 58.17) | 9 | 48.70(40.80, 60.70) | -0.355 | 0.722 |
| CD4+T计数 (个/μL) | 12 | 2 330.5(1 806.6, 4 181.9) | 9 | 2 211.0(1 322.0, 3 497.0) | -0.000 | 1.000 |
| CD8+T (%) | 12 | 19.10(10.24, 26.60) | 9 | 14.30(11.50, 24.30) | -1.600 | 0.110 |
| CD8+T计数 (个/μL) | 12 | 1 037.0(445.3, 1 411.9) | 9 | 635.0(450.0, 1 255.0) | -0.995 | 0.320 |
| CD4+CD28+/CD4+ (%) | 9 | 99.7(99.0, 100.0) | 9 | 99.7(97.6, 99.9) | -0.775 | 0.438 |
| CD4+CD28+/CD4+计数 (个/μL) | 9 | 2 064(1 760, 2 457) | 9 | 2 167(1 318, 3 486) | -0.221 | 0.825 |
| CD8+CD28+/CD8+ (%) | 9 | 94.6(65.6, 95.8) | 9 | 91.0(67.0, 94.6) | -1.590 | 0.112 |
| CD8+CD28+/CD8+计数 (个/μL) | 9 | 891(487, 1 167) | 9 | 599(319, 861) | -1.722 | 0.085 |
| CD8+DR+/CD8+ (%) | 9 | 2.5(0.2, 7.5) | 9 | 3.9(2.2, 24.6) | -1.724 | 0.085 |
| CD8+DR+/CD8+计数 (个/μL) | 9 | 21(3, 39) | 9 | 25(10, 202) | -1.017 | 0.309 |
| CD8+CD38+/CD8+ (%) | 9 | 95.7(90.6, 96.5) | 9 | 96.1(93.0, 97.2) | -0.486 | 0.627 |
| CD8+CD38+/CD8+计数 (个/μL) | 9 | 1 089(487, 1 166) | 9 | 611(426, 1 222) | -1.104 | 0.270 |
| Naive细胞CD4+CD45RA+/CD4+ (%) | 9 | 76.5(41.5, 84.4) | 9 | 78.0(58.2, 86.4) | -0.663 | 0.507 |
| Naive细胞 CD4+CD45RA+/CD4+计数 (个/μL) | 9 | 1 621(1 156, 2 071) | 9 | 1 749(826, 3 056) | -0.574 | 0.566 |
| 记忆T4细胞 CD4+CD45RA-/CD4+ (%) | 9 | 23.5(14.8, 34.9) | 9 | 22.0(12.6, 37.5) | -0.663 | 0.507 |
| 记忆T4细胞 CD4+CD45RA-/CD4+计数 (个/μL) | 9 | 441(367, 620) | 9 | 495(359, 753) | -0.310 | 0.757 |
| CD4/CD8 (%) | 12 | 2.37(1.69, 5.21) | 9 | 3.12(1.70, 5.28) | -1.369 | 0.356 |
注：［Ig］免疫球蛋白；［WBC］白细胞；［LY］淋巴细胞；［NEUT］中性粒细胞；［Mono］单核细胞；［EOS］嗜酸性粒细胞；［RBC］红细胞；［Hb］血红蛋白；［HCT］红细胞压积；［PLT］血小板；［B］B淋巴细胞；［NK］自然杀伤细胞；［T］T淋巴细胞。
3. 讨论
婴儿期免疫功能的监测具有重要意义，可以指导某些疾病如巨细胞病毒感染、先天性免疫缺陷等的筛查及诊疗。上述疾病逐渐引起人们重视且并不少见。但婴儿的免疫系统处在较快发育过程中，不同月龄的婴儿，其免疫功能指标的参考范围数据来源有限，限制了相关检测项目的开展。目前关于儿童淋巴细胞亚群的参考值存在一定局限性。首先，儿童细胞亚群随年龄而变化，既往国内外报道的细胞亚群值均为某一年龄段数据［1，4-8］，国内数据为1~6月龄参考值，其中3月龄及以下婴儿样本量少；因年龄跨度大，无法在婴儿中按月龄区分参考值，且参考值区间大。其次，细胞亚群可能受到种族、地理位置、性别、环境因素等影响，导致参考值存在一定差异［1］，使国外研究数据在中国人中的应用价值受到影响。本文给出了中国3月龄健康足月婴儿B细胞、NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+T和CD8+T细胞的第二信号受体CD28比例、CD8+T细胞的HLA-DR、CD38比例、Naive细胞比例、记忆T4细胞比例等参考值。本文尽管是横断面数据，但集中在3月龄婴儿，更准确地反映这一年龄婴儿的免疫功能，且所有标本均标准运送至同一实验室进行检测，避免相关检测误差，填补了3月龄这一特定月龄中国婴儿数据的空白，可以为儿童保健及自身免疫病专家识别免疫功能缺陷的婴儿提供参考数据。婴儿期免疫功能监测的难点为随访依从性差、血样稀缺，本研究的不足和局限也在于缺乏后续数据，不能评估免疫功能的动态变化。
除数量外，T细胞的功能也是评价疾病严重程度的指标。我们发现喂养方式对CD28表达（CD4+T细胞和CD8+T细胞）、HLA-DR表达（CD8+T细胞）有显著影响，纯母乳喂养者与纯奶粉喂养者相比，淋巴细胞功能亚群CD28表达比例显著降低，淋巴细胞激活亚群HLA-DR表达比例显著增高。以往研究多为混合喂养，以母乳或奶粉为主，而本研究中为纯母乳喂养或纯奶粉喂养，更能反映喂养方式对免疫功能的影响。CD28是T细胞最重要的第二信号受体，其表达情况可作为T细胞功能的评估指标之一，如活化、细胞因子产生、增殖等。正常人CD4+T细胞90%以上表达CD28，缺乏CD28的CD4+T细胞无法被活化呈“无能”状态［3］。HLA-DR+T细胞可免疫激活包括细胞活化、增殖、凋亡、细胞因子分泌等一系列过程，多种指标均可用来反映激活水平，目前应用较多的为CD8+T细胞表面的活化分子HLA-DR和CD38表达比例［9］。CD8+T细胞表面激活标记物HLA-DR的表达在母乳喂养组显著高于奶粉喂养组，而CD38表达无显著性差异。仅表达HLA-DR而CD38阴性的CD8+T细胞具有更好的细胞因子分泌、增殖及细胞毒作用。重症感染时T细胞活化，如2019冠状病毒病患者中，重症和极重症患者的HLA-DR表达较轻症患者显著增加［10］。艾滋病患儿CD8+T细胞活化程度与病毒载量呈正比［11］。但在健康婴儿免疫系统发育过程中，CD8+T细胞活化的意义尚不明确。且有研究发现，HLA-DR在低龄儿童中表达更高，并随年龄增长而降低［8］。本文中母乳喂养组的T细胞功能亚群显著减少，激活亚群显著增加，提示喂养方式对T细胞发育过程存在一定影响，说明母乳喂养婴儿在3月龄时T细胞发育可能欠成熟，而并非感染表现。
国内的研究发现，1~6月龄男婴的CD4表达（41.96个/μL）显著低于女婴（45.13个/μL），余细胞亚群指标无显著性差异［4］。国外关于早产儿及足月儿的研究表明，校正胎龄自22~28周至44~55周，性别对淋巴细胞亚群均无显著影响［1］。本研究中，性别对3月龄婴儿的淋巴细胞亚群均无影响，但尚需更大样本。
综上，本研究提供了3月龄这一特定月龄中国健康足月婴儿免疫功能参考值，尤其是淋巴细胞亚群，并发现纯母乳喂养者与纯奶粉喂养者相比，T细胞功能亚群显著减少，激活亚群显著增加，即喂养方式对T细胞发育及功能有显著影响，是否与远期疾病相关还需长期随访及更大样本数据支持。
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