组织工程技术促进股骨头坏死骨组织再血管化的研究进展

Abstract

目的

总结采用组织工程技术促进股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）骨组织再血管化的研究进展。

方法

广泛查阅近年国内外相关文献，阐明股骨头血管化机制，对组织工程技术在促进 ONFH 骨组织再血管化中的应用进展进行总结归纳。

结果

重建或改善股骨头血供是治疗 ONFH 的关键，目前组织工程研究热点主要基于种子细胞、支架材料以及促血管生成因子三方面，联合 3D 打印技术和药物递送系统来促进股骨头骨组织再血管化。

结论

基于组织工程技术的股骨头再血管化策略，有望改善局部血供，延缓甚至逆转 ONFH 进展。

股骨头坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是由于多种因素致股骨头血液减少或中断，造成骨细胞、BMSCs、骨髓造血细胞和脂肪细胞等细胞异常肥大或死亡的病理过程。ONFH 发病机制主要包括脂质代谢异常、血管内凝血、成脂分化、细胞凋亡自噬、骨质疏松、基因多态性等^[1]。在 ONFH 病变进程中，多因素及多种机制共同参与、交叉叠加，最终导致股骨头微循环受损，造成骨组织缺血缺氧，加之无足够侧支循环补给或具有丰富血运的骨组织填补，从而进一步诱发 ONFH。局部微循环重建是保证骨组织再生、修复、愈合的先决条件，有学者认为坏死的股骨头骨组织经过再血管化，不仅能重建血供，还能促进成骨进程，加速股骨头修复^[2-4]。因此，促进股骨头再血管化是治疗 ONFH 的关键。现就国内外文献报道的利用组织工程技术促进ONFH 骨组织再血管化策略及相关研究进展作一综述。

1. ONFH 血管化机制

股骨头血供主要依靠圆韧带动脉、旋股内动脉和旋股外动脉，动脉之间缺乏侧支循环，阻塞后难以代偿，导致股骨头局部骨质及骨髓死亡，坏死病灶超过一定范围后难以自行修复。虽然 ONFH 发病机制尚不清楚，但是重建或改善股骨头血供是治疗 ONFH 的关键已达成共识。血管重建机制主要分为血管生成与血管形成。其中，血管生成是指在已有的血管网络基础上，由内皮细胞出芽形成新生血管，涉及细胞外基质降解、增殖、迁移、萌发及形成管状结构，最后募集周细胞稳定新形成的血管结构及促进其成熟^[5]；血管形成则是由内皮细胞或内皮祖细胞自发形成管状结构，与原有血管网吻合形成新血管的过程。目前，更多学者认为血管重建是一个动态过程，涉及多种因素、多种因子及多种（干）细胞类型的参与和调控，例如内皮细胞、内皮祖细胞、MSCs 等，但组织血管化的具体机制尚未明确。

此外，有学者认为在 ONFH 修复中血管细胞和成骨细胞紧密联系。在骨组织（如长管状骨）中血供主要由 3 种类型血管（滋养动脉、干骺端-骺端动脉和骨膜动脉）提供，特别是在哺乳动物骨骼中，血管又分为 H 亚型血管和 L 亚型血管。H 亚型血管主要由 H 亚型血管内皮细胞构成，周围聚集了大量骨祖细胞及成骨细胞^[4]。激活与血管生成相关的 Notch 信号后，长管状骨的 H 亚型血管内皮细胞增加，分泌的 Noggin 蛋白增多，刺激软骨细胞成熟、小梁形成以及骨祖细胞增殖，加速骨矿化及血管生成^[6]。此外，H 亚型血管内皮细胞还能分泌 VEGF，再次支持血管生成以及激活血管周围骨祖细胞和成骨细胞。Gao 等^[7]通过酶消化和密度梯度离心法成功分离 H 亚型血管内皮细胞，并对其进行纯化，证实了 H 亚型血管内皮细胞的存在。

经典信号通路也有促进血管化等作用，如 Akt/Bad/Bcl-2、P13K/Akt、Notch、VEGF/VEGFR、Wnt5a^{[6, 8-9]}。Akt/Bad/Bcl-2 信号通路能够抑制糖皮质激素相关内质网应激诱导的大鼠股骨头细胞凋亡，而 Akt 途径又可以激活血管生成信号通路，在抑制细胞凋亡与促血管化方面起到双重作用^[8]。

2. 利用组织工程技术治疗 ONFH 的研究进展

大段骨缺损修复困难主要与其解剖部位血供不足有关，而利用组织工程技术体外构建富含血运的骨组织，可以直接修复股骨头骨缺损区域。目前组织工程技术促进血管化的方法主要基于细胞、生长因子、支架材料三大因素，同时联合 3D 打印技术、药物递送系统等^[10]。

2.1. 细胞与血管化再生

2.1.1. MSCs 作用与机制

研究表明，MSCs 参与调控机体血管形成，在促进组织修复方面具有一定优势^[11]。不同来源的 MSCs 具有多谱系分化潜能，在一定条件下能够诱导分化为多种细胞类型，如成骨细胞、内皮细胞等，因此其可能具有成骨和成血管双重作用，有望同时促进骨修复及血管生成^[12-13]。Abudusaimi 等^[14]通过移植自体脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）治疗激素性 ONFH，结果显示不仅能增加骨钙素的表达促进新骨形成，还可改善骨坏死区域血供。Pak^[15]从 2 例 ONFH 伴严重髋关节疼痛患者的脂肪组织中提取自体 ADSCs，然后经皮注射至患侧髋关节内，4 周后患者关节疼痛减轻，MRI 显示伴新生血管的骨组织再生。Chen 等^[16]对 9 例国际骨循环协会（ARCO）Ⅱ～Ⅲa 期 ONFH 患者经动脉注射脐带 MSCs，采用氧气输送指数（oxygen delivery index，ODI）评估组织有效灌注率，结果显示术后 3 d ODI 增高，12、24 个月 MRI 显示 ONFH 骨坏死体积明显减小。Chen 等认为这可能与脐带 MSCs 迁移至坏死区域，并分化为成骨细胞或内皮细胞有关。此外，MSCs 还可以通过旁分泌途径分泌多种生长因子来加速坏死区域的血管新生。上述研究结果提示 MSCs 可用于 ONFH 治疗，能促进骨修复及血管生成。

2.1.2. 内皮细胞调节血管形成功能

血管扩散能力有限，体内细胞与毛细血管网距离不宜超过 100～200 μm，超出此范围难以保证营养物质的供应^[17]。因此植入体内的移植物形成内部毛细血管网或加速与宿主血管吻合，是保证移植物成活的关键。内皮细胞是一类血管形成或血管新生的主要细胞，其存在 2 种特定亚型：H 亚型与 L 亚型血管内皮细胞。特别是 H 亚型血管内皮细胞，在调控成骨微环境和骨形成过程中起重要作用，通过产生独特的代谢和分子微环境，不仅介导骨骼脉管系统的生长，还为血管周围骨祖细胞提供生态位信号^[4]。

内皮祖细胞是一类可定向增殖分化为内皮细胞的前体细胞，可在损伤及缺血缺氧的区域被观察到，维持血管稳定（如血管修复）和启动新生血管形成。在正常生理活动中，外源性和内源性因素可刺激骨髓来源的内皮祖细胞增殖并释放进入外周血，调控新血管形成；而发生 ONFH 后，宿主内循环的内皮祖细胞数量及聚集能力显著下降，迅速衰老，成血管能力大大受损^[18]。

将不同类型细胞共培养能通过细胞间相互调控作用，促进细胞定向分化。有研究提示将内皮细胞或内皮祖细胞单独或与其他骨细胞共培养后，这些细胞能够直接参与或以旁分泌形式分泌多种血管活性因子加速血管化，经体外培养后形成初级血管结构，植入动物体内后与宿主成熟血管以吻合方式互相连通^[11]。这种体外血管预构形式能实现移植物体内早期血管化，更好地保证植入细胞的成活，对成骨分化也有着积极的影响。Zigdon-Giladi 等^[19]将 MSCs 和内皮祖细胞共培养后植入严重骨缺损大鼠体内，可以观察到大量血管生成，MSCs 分化为成骨细胞，还将宿主内皮祖细胞和 MSCs 募集到坏死部位，证实两种细胞联合移植具有协同修复骨缺损作用，显示出良好的骨再生和血管化潜能。上述不同类型细胞联合移植在骨再生及血管再生方面效果均优于单一细胞^[20]。但也有报道提出植入的内皮细胞不能形成广泛的功能性血管网^[21]。

2.1.3. 细胞膜片技术的应用

各种类型细胞膜片已用于组织或器官的构建，膜片组织能保留丰富的细胞外基质和表面蛋白，保持细胞间整个信号通讯网络，也能实现多种细胞的共培养体系。目前，已有将不同类型细胞膜片复合，成功构建组织工程骨并修复骨缺损的报道^[22-23]。近年来，利用高细胞密度的细胞膜片技术合成仿生骨膜也是促进股骨头血管化策略之一。正常股骨头骨膜是骨组织血供来源之一，支持骨营养及骨再生。Ren 等^[22]将人脐静脉内皮细胞接种在未分化的 BMSCs 细胞膜片上，复合形成预血管化仿生骨膜组织。体外实验结果表明该复合物改变了人脐静脉内皮细胞的排列，促进血管样网络的形成，且植入体内后快速与宿主血管系统吻合，形成功能性血管。

然而细胞膜片机械性能较弱，可进一步与支架结合，形成可塑性强、机械强度大的三维组织结构。Zhang 等^[23]采用兔来源 ADSCs 制备成骨细胞膜片和内皮细胞膜片，组成具有成骨和血管形成潜力的双细胞膜片复合物后覆盖于羟基磷灰石支架，然后植入裸鼠皮下，移植 12 周后该复合物出现明显胶原纤维矿化和血管化，毛细血管生成增多，成骨及成血管能力远优于单纯羟基磷灰石支架。

此外，细胞膜片技术还存在细胞数量需求较大、体外培养周期长等问题，膜片制备技术仍需进一步优化。

2.1.4. 细胞外泌体的作用

外泌体是细胞分泌的细胞外囊泡，含有丰富的蛋白质、脂质、微小 RNAs（micro RNAs，miRNAs），传递细胞间信号，调节免疫、炎症反应及促进损伤细胞自我修复等生理过程。血管内皮细胞释放的外泌体被认为是血管形成的重要介质，是其发挥细胞间和细胞-基质间相互作用以及与外界沟通的关键因子，将各种信号级联传递至靶细胞，参与细胞生长、迁移和血管发育的调节^[5]。而 MSCs 释放的外泌体可以直接将 miRNAs 转移至血管内皮细胞促进血管生成^[24]。有学者指出局部缺氧环境能刺激细胞外泌体增加，加速血管新生^[4]。Song 等^[25]研究发现血管内皮细胞释放的外泌体能够高效特异性靶向骨组织，抑制破骨细胞活性，并可通过递送 miR-15 促进骨再生。张根生等^[3]的研究体外构建过表达 miRNA-27a 的人脐静脉血管内皮细胞来源外泌体，经尾静脉注射至小鼠体内，可明显改善激素性 ONFH，在一定程度上促进骨再生。Liu 等^[26]将人诱导多能干细胞来源的 MSCs 分泌的外泌体经静脉注射至激素性 ONFH 大鼠体内，3 周后局部微血管密度增加，体外血管内皮细胞增殖、迁移和成管等实验表明血管内皮细胞增殖、迁移和成管能力增强，而这与外泌体激活了与血管生成相关的 P13K/Akt 信号通路有关。

2.2. 支架材料与血管化

理想的骨支架材料应保持细胞活力，允许细胞附着、增殖和归巢以及提供机械支撑，此外还应允许宿主微循环流动，宿主血管侵入支架材料中心形成新的脉管系统，从而达到长期血管化并募集 MSCs，以促进骨发育。支架结构形态会影响其植入后血管生成与成骨分化，孔隙率是一个关键参数，决定细胞在支架迁移的速度以及支架实现血管化所需时间。支架孔隙过小会限制宿主血管入侵，过大则导致孔隙之间交联不足。文献报道 200～500 μm 是支架骨再生和血管形成的最理想孔径^[27]。

3D 打印技术能够有效控制支架孔隙率，还允许内部结构相互连通，高精度地形成多层次组织和器官样结构。Liu 等^[28]在多孔三维骨支架接种 BMSCs，培养 3 周后加入人脐静脉内皮细胞，6 d 后加入纤维蛋白填充孔隙以提供一种水凝胶环境，之后细胞迅速增殖，在支架内部人脐静脉内皮细胞出芽并形成微血管结构。构建与原位骨组织力学性能相似的支架是骨组织工程研究一直以来的关注点，支架的结构设计与材料选择非常重要。Maruyama 等^[29]利用 3D 打印技术制备多孔聚己内酯-β 磷酸三钙支架，该支架通过提供机械支撑来改善兔髓芯减压术后股骨头骨生长。此外，还可以将天然材料与化学材料进行加工融合制备支架材料，如人或动物的胶原、脱蛋白骨以及聚己内酯等^[30]。多孔结构支架虽然保证了血管与骨长入的空间，但也削弱了机械支撑，因此支架还可以进一步融合坚韧的纳米材料来提高机械支撑。

目前对支架材料的研究己从动物实验逐渐转向临床应用阶段，单一支架材料不能完全满足骨缺损修复所有要求，特别是血管生成。综合应用 3D 打印技术、纳米技术、细胞膜片技术等新技术，设计多功能生物材料或血管化骨支架是未来研究的方向。

2.3. 生长因子与血管化

2.3.1. 生长因子类型及作用

多种生长因子参与调控血管新生，在组织工程构建中引入生长因子，可有效刺激内皮细胞、内皮祖细胞、成骨细胞、BMSCs 等细胞迁移与增殖，促进血管形成及成熟。现已知 VEGF、BMP、缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）、IGF、FGF 以及富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）等均具有直接或间接加速 ONFH 血管化的作用。

VEGF 又称血管通透性因子，是一种血管内皮细胞特异性的促有丝分裂原，能够调节脉管系统的生长。主要作用机制为通过与血管内皮细胞表面特异性受体相结合，诱导细胞定向移动、分裂以及增殖。此外，VEGF 还具有维持血管周围骨祖细胞和成骨细胞的功能，在促成骨及血管侵入的骨修复过程中扮演着重要角色。

BMP 为体内成骨及成软骨诱导主要因子，能够同时促进骨再生与刺激新血管形成。在 ONFH 坏死区 BMP-4 mRNA 高表达，骨硬化加速，而 BMP-7 则通过促进 BMSCs 的增殖及成骨分化起保护作用，二者维系着成骨平衡^[31-32]。

HIF 负责调控细胞对氧气的感知这一重要生理过程，一旦激活 HIF-1α 通路，多种促血管生长细胞因子包括 VEGF-A、基质细胞衍生因子1、胎盘生长因子和血管生成素表达均增加，这些因子均是生理血管形成所必需的，特别是 VEGF-A 上升，不仅诱导内皮细胞和内皮细胞转录物上调，增加了 VEGF mRNA 的表达，还能促进骨祖细胞和成骨细胞标记表达水平增加^{[4, 33]}。冯勇^[18]应用 HIF-1α 激活剂二甲基乙二酰基甘氨酸激活内皮祖细胞中 HIF-1α 蛋白表达，结果显示内皮祖细胞增殖能力以及成血管能力显著提高，在坏死区观察到新骨形成与血管密度增加。

脂质代谢紊乱是导致 ONFH 的因素之一，IGF 能够作用于脂肪细胞促进脂肪分解，降低血液中甘油三酯水平。Song 等^[34]研究了中国人群 ONFH 与相关基因变异之间的关系，发现作为成脂分化的中枢调节因子胰岛素样结合蛋白 3（insulin growth factor binding protein 3，IGFBP3），其基因型 IGFBP3rs2132572、IGFBP3rs24538th9、IGFBP3rs3110697 与 ONFH 风险和双侧髋关节病变密切相关，通过干扰脂肪细胞分化依赖的 PPAR-γ 途径、维持成熟脂肪细胞的基因表达、减少脂质积累，在一定程度上能延缓 ONFH 进展，这与 Wang 等^[35]的研究结果一致。

FGF 被认为是体内最有效的血管生长因子之一。Kuroda 等^[36]利用水凝明胶混合 rhFGF-2 治疗 10 例塌陷前期 ONFH 患者，术后 1 年患者平均临床评分显著提高，除 1 例发生股骨头塌陷外，其他 9 例未发生阶段进展或塌陷；Peng等^[37]应用经慢病毒转染 bFGF 的 MSCs 联合松质骨移植修复兔股骨头，获得较好效果。他们发现这与激活 OPG/RANK/RANKL 通路有关，该通路维持促骨生长的成骨细胞及促骨吸收的破骨细胞之间的平衡，被认为是骨代谢重要途径。

PRP 因富含 FGF、TGF、IGF 和 PDGF 等因子，在刺激新骨和血管组织形成方面具有巨大应用前景^[38]。Tong 等^[39]采用 PRP 治疗小鼠 ONFH，相关炎症因子如 IL-17A、IL-1β、TNF-α、NK-κB 受体激活剂配体、IL-6 和干扰素-γ 等表达下调，而细胞间黏附分子 1、PDGF、VEGF、IGF、TGF-β 等表达上调。此外，PRP 还能显著降低血液黏度、血浆黏度及红细胞聚集性，改善 ONFH 血液流变学指标，在一定程度上改善股骨头供血动脉的梗阻，修复局部血管^[40]。见表 1。

表 1.

Effect of growth factors in promoting revascularization of the femoral head

生长因子在促进股骨头再血管化中的作用

生长因子 Growth factor	作用细胞 Cells	主要效应 Main effect	参考文献 Reference
VEGF	血管内皮细胞、骨祖细胞、成 骨细胞	诱导血管内皮细胞定向移动、分裂以及增殖，促进血管新生，维持骨祖细胞和成骨细胞的功能	[2]
BMP-4、BMP-7	成骨细胞、软骨细胞、破骨细胞、MSCs、血管内皮细胞	加速骨硬化，维持成骨稳定，促进骨修复及血管生成	[31-32]
HIF-1α	血管内皮细胞、成骨细胞、骨祖细胞	诱导多种促血管生长因子的表达，刺激骨组织中血管生成及骨再生	[4, 33]
IGF	脂肪细胞	加速脂肪分解，减少脂质积累及脂联素表达	[34-35]
FGF	成骨细胞、破骨细胞、血管内皮细胞	调节骨代谢，促进骨生长及骨吸收，刺激血管形成	[36-37]
PRP	富含 FGF、TGF、IGF 和 PDGF	刺激新骨及血管形成、减轻炎症反应，降低血液黏度及改善血管梗阻	[34, 39-40]

2.3.2. 生长因子存在问题及解决方法

生长因子存在生物半衰期过短、局部有效浓度难以控制等问题，可与缓释系统联合应用，在特定的骨坏死区域连续递送血管生成因子与成骨因子。Dailiana 等^[2]利用渗透微泵连续输送 VEGF 治疗犬 ONFH，12 周后出现骨坏死逆转，他认为经过有效的再血管化，能阻止坏死进一步发展。Wang 等^[41]将 rhBMP-2 包埋于聚乳酸-羟基磷灰石微球，使其缓慢释放达 4 周，之后观察到死骨被大量新生骨组织包裹，在坏死骨内部可见许多新生血管。此外，基因治疗技术在生长因子控释方面也获得较好效果，携带生长因子的基因片段通过载体病毒或脂质体转染至种子细胞，赋予种子细胞持续稳定表达一种或多种生长因子的能力，使细胞具有更强的促血管化与成骨能力。Liao 等^[42]利用腺病毒将 VEGF 和 BMP-6 基因片段转染至 BMSCs，经过扩增并筛选出高表达的 BMSCs 后，将其与仿生合成支架聚丙交酯-乙交酯复合培养，最后植入裸鼠皮下；4 周后发现 VEGF 和 BMP-6 表达水平显著增加，毛细血管数量和骨形成明显高于其他对照组。虽然基因修饰取得一定促血管化结果，但也存在与载体病毒相关的生物安全风险。另外体内血管化往往是多种生长因子共同参与的级联反应，因此与单用一种因子相比，多种因子联合应用可达到更快速形成更致密、更成熟血管系统的目的，促血管效果更显著^[43]。

生长因子治疗可以在股骨头塌陷前任意阶段进行，无需考虑 ONFH 病因，这可能是在 ONFH 早期一种有用的治疗形式。虽然，目前动物实验结果显示生长因子能有效促进股骨头骨组织血管化，但该治疗方式缺乏特异性且价格昂贵，也缺乏临床治疗有效性的有力证据，因此仍需进一步系统、有效的临床研究。

3. 3D 打印技术

3D 打印技术是基于数字三维模型，按照增材制造原理定位装配生物材料或细胞单元，构建具有类似于天然对应物分层结构的生物结构^[44]，满足了支架或无支架组织和器官构建的需求。骨生物打印可替代传统的自体和同种异体骨移植，避免了与传统骨移植相关的移植物不适合、供体部位并发症、免疫原性和疾病传播风险等问题，有望成为治疗 ONFH 的方法。

3D 打印技术制备的三维支架具有相互连接孔隙和较大的体表面积，支持细胞附着、生长、细胞间通讯以及气体和营养物质的交换，远远优于传统溶剂浇铸、相分离和熔融成型技术^[28-29]。通过 3D 打印技术，还能在构建支架基础上同时添加促成骨及血管生成的材料。Fielding 等^[45]在 3D 打印磷酸三钙支架基础上，加入具有成骨诱导及促进血管生成的金属氧化物二氧化硅和氧化锌，然后修复小鼠股骨缺损模型，16 周后Ⅰ型胶原和骨钙素水平上调，提示早期骨形成能力提高，新血管形成数量是单一磷酸三钙支架的 3 倍。此外，构建具有功能性脉管系统的三维大规模骨组织构建体也是治疗 ONFH 策略之一。Byambaa 等^[46]利用 3D 打印技术制造包含可灌注血管腔微结构的骨状组织复合体，首先打印硅酸盐纳米片负载甲基丙烯酰水凝胶圆柱体，内载有 hMSCs 以诱导成骨；同时合成具有 VEGF 的水凝胶制剂，建立生长因子内在梯度，以进一步促进人脐静脉内皮细胞增殖，促进微毛细管形成。体外试验表明构建体既能支持成骨，又能支持血管生成。

自然组织再生涉及复杂的三维结构、细胞功能和细胞外基质以及组织结构的动态变化。特别是近年来提出的 4D 生物打印将时间概念作为第四维度与 3D 打印相结合，以期随着时间推移实现组织功能转化与成熟^[47]。

4. 药物递送系统

随着医学、工学、材料、机械、药物等领域的快速发展，大量研究对药物本身、搭载药物的载体材料等进行物理化学改性、修饰，不仅实现了药物缓释，而且能够对药物缓释曲线进行更精确及智能调控、靶向治疗瞄准特定的病变部位，局部药物浓度能够在较长时间内维持在有效范围内。药物递送系统的快速发展对靶向治疗 ONFH 有着积极作用，将组织工程技术与药物递送系统结合起来，对增强 ONFH 治疗效果有一定意义。

在组织工程中药物递送系统主要包括无机材料、高分子材料（如明胶、海藻酸盐、壳聚糖、渗透微泵、聚乳酸-羟基磷灰石微球、微球、载体病毒或脂质体）等。相关细胞生长因子通过与多种药物递送系统联合应用，能达到持续递送 VEGF 或成骨因子的目的^{[2, 41-42]}。药物递送系统除了能够递送药物外，还能递送细胞所需的营养物质刺激细胞增殖。Wang 等^[48]设计的 CaO₂/明胶微球可以持续释放氧气达 19 d，通过靶向提供氧气以促进极端缺氧条件下的细胞增殖，减少局部细胞凋亡并提高移植细胞存活率，增强移植干细胞的血管生成及细胞存活来提高 ONFH 治疗效果。

5. 总结与展望

如何改善局部血液供应，延缓甚至逆转 ONFH 进展是临床治疗一大挑战。利用骨组织工程促使股骨头再血管化是目前研究热点，已有研究证实该方法能够延缓疾病进展，在治疗 ONFH 方面取得一定成效^[49]。但目前相关研究以动物实验为主，临床应用尚在试验阶段，因此仍需多方研究证实疗效。基于种子细胞、支架材料以及促血管生成因子等促血管化策略的效果及其差异尚未明确，但联合重建骨组织所需元素和血管网已被证明有效，能够较快形成成熟的新血管并维持稳定。未来通过基因技术深入了解并引入成骨遗传物质，同时联合骨组织工程技术，有望为治疗 ONFH 提供新思路及方法。

作者贡献：林苗远、李豫皖负责综述构思设计；闫文强、胡宁负责文章写作校对；林苗远、李豫皖、杨继滨、刘子铭参与文献收集、分析总结；张莉、李豫皖负责项目指导。

利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点及其报道。

Funding Statement

中国博士后科学基金第68批面上项目（2020M680258、2020M680259）；国家自然科学基金面上项目（82072443）

China Postdoctoral Science Foundation, the 68th Batch of Founding (2020M680258, 2020M680259); National Natural Science Foundation of China (82072443)