登革病毒IgG抗体的检测：基于登革病毒E蛋白的荧光素酶免疫吸附法

Abstract

Objective

To establish a luciferase immunosorbent assay (DENV-LISA) based on dengue virus (DENV) E protein, a specific antigen of DENV, for detection of DENV IgG antibody.

Methods

The fused expression plasmids of DENV1-E1 and DENV2-E2 with luciferase were constructed. The plasmids were transfected into 293T cells, and the fusion protein containing the specific antigen and luciferase was obtained for establishing DENV-LISA. The specificity and sensitivity of DENV-LISA were assessed and compared with those of commercial DENV IgG antibody detection kit (ELISA).

Results

The established DENV-LISA had a positive detection rate of 32.4% and a specificity of 96.6%, showing a similar positive detection rate with the commercial ELISA kit (35.3%; P>0.05). DENV-LISA was capable of detecting positive samples with a 1: 6400 dilution with a high sensitivity. The test values of DENV-LISA did not differ significantly between plates or within plates in the same batch (P> 0.05), suggesting a good reproducibility of the test.

Conclusion

The luciferase immunosorbent assay based on DENV E protein has high specificity and sensitivity for detecting DENV IgG antibody, and can be used for early screening, surveillance and epidemiological investigation of DENV infection.

登革病毒（DENV）引发的登革热（DF）是全球重大虫媒传染病，在热带、亚热带地区均有流行。随着气候变化和人口流动增多，登革热日益严重^{[1, 2]}。据统计，DENV原发性感染大部分为隐性感染^[3]，可作为传染源导致更多感染发生^[4]。目前，DENV存在四种血清型（DENV1-4），单一血清型的原发感染能产生该特定血清型持久的同型免疫，但对其他血清型只能产生短暂的免疫保护^[5]。研究表明，DENV二次异型感染更易引发重症，包括致死性登革出血热（DHF）和登革休克综合征（DSS）等^{[6, 7]}，给疾病防控带来沉重的医疗负担^[8]。另一方面，猩猩、猴类等动物对登革病毒易感，是丛林型登革热的主要传染源，可通过蚊媒感染人。因此，建立准确、便捷的DENV检测技术，能提升DENV现场或野外监测站点的检测能力，便于开展岛礁、边防、丛林等特殊哨点的DENV早期筛查、流行病学调查。

DENV实验室检验方法有病毒分离、RT-PCR、抗体检测等，病毒分离法操作繁多、费时；RT-PCR检测核酸，快速、准确、便捷，但不反映抗体水平；抗体检测是目前最常用的快速检测技术^[10]。通过抗体检测，DENV原发感染发病后8~10 d，可检测到IgG抗体^[11]，并在体内维持多年^[12]，二次感染时迅速增多^[13]，已作为区分原发感染和继发感染的指标。但辣根过氧化物酶联免疫法测量光密度（OD值），检测范围较窄；特殊动物检测所需的种属二抗难获取，应用范围受限；抗原制备、蛋白表达、纯化折叠复杂，制备周期较长。

本研究采用G蛋白捕获血清中IgG抗体，Nanoluc荧光素酶与DENV特异性抗原融合表达蛋白为检测抗原，检测DENV IgG特异性抗体，建立基于DENV E蛋白的荧光素酶免疫吸附法（DENV-LISA）^[14]，具有特异、快速、灵敏、不需要种属二抗等特点，为人群中DENV感染的筛查、预警与自然疫源地病原微生物大规模监测、风险评估提供技术支持。

1. 材料和方法

1.1. 细胞、试剂与样本

DENV1（GenBank：KM204119.1），DENV2（GenBank：KU094070.1）。293T细胞为本实验室保存。大肠杆菌DH5ɑ（北京天根生物科技），荧光素酶表达载体pNLF1-N和发光底物（Promega），病毒RNA提取试剂盒（Qiagen），质粒提取试剂盒（广州美基生物科技），脂质体核酸转染试剂（上海翊圣生物科技），G蛋白（金斯瑞生物科技），商用DENV IgG检测试剂盒（ELISA）（中山生物）。登革病人血清样本由本实验室、广东省疾病预防控制中心提供，正常人血清样本由南方医院提供。

1.2. 构建pNLF1-E1、pNLF1-E2荧光素酶表达载体

根据DENV E基因核苷酸序列^{[15, 16]}，设计引物（表 1），并在5'端引入EcoR Ⅰ酶切位点（斜体加粗），3'端引入Xba Ⅰ酶切位点（斜体加粗）和蛋白标签（下划线），交由生工生物工程（上海）合成。提取病毒RNA，逆转录为cDNA，扩增DENV1-E1、DENV2-E2基因片段，纯化、回收；经双酶切，连接至pNLF1-N载体，并转化至DH5α感受态细胞。将阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，对测序正确的菌株经37 ℃振荡培养16 h，提取pNLF1-E1、pNLF1-E2重组质粒。

1.

扩增DENV1-E1、DENV2-E2的引物序列及位置

Primer sequences and locations of the coding sequences of DENV1-E1 and DENV2-E2

Gene	Primer 5'-3'	Position
F: Forward primer; R: Revise primer.
DENV1-E1	F: CGGAATTCATGTGCACAGGCTCATT R: GCTCTAGAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACATCCTTCGTGCTCCTC	901-1236 (DENV1-E)
DENV2-E2	F: CGGAATTCAGAGACTTTGTAGAAGG R: GCTCTAGAATGGTGATGGTGATGATGTTTTCCTGTGTCATTTCC	25-471 (DENV2-E)

1.3. 转染、获取NLu-E1、NLu-E2融合蛋白

将293T细胞无抗生素培养24 h，转染pNLF1-E1、pNLF1-E2重组质粒至293T细胞中，8 h后更换维持培养基。培养48 h，裂解细胞，经4 ℃、13 000 g离心10 min，保存细胞裂解上清液。

1.4. Western blot检测NLu-E1、NLu-E2融合蛋白表达

将上述细胞裂解上清液加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，置于100 ℃金属浴，加热10 min，使蛋白变性。按照等蛋白质量上样，进行SDS-PAGE电泳，使用半干转膜法，转印至0.45 μm NC膜，使用抗蛋白标签鼠单克隆抗体作为一抗（1∶5000稀释），HRP标记羊抗鼠IgG作为二抗（1∶10 000稀释），进行ECL检测。

1.5. 建立DENV-LISA检测

使用G蛋白，按照每孔100 μL，包被96孔白色酶标板，4 ℃孵育12 h；5%脱脂奶粉（0.05% PBST稀释）37 ℃封闭2 h；0.05%PBST洗板1次，2%脱脂奶粉稀释待测样品，每孔加样95 μL，37 ℃孵育2 h；洗板3次，将NLu-E1与NLu-E2细胞裂解液等量混匀，按照1∶200稀释，每孔加样50 μL，37 ℃孵育45 min；弃液，洗板3次，加入荧光素酶发光底物，使用酶标仪读取相对荧光值（RFI）。以经两种检测方法检测为阳性的样本为阳性对照，以正常人样本为阴性对照，2%脱脂奶粉为空白对照。根据RFI判断血清样品中是否存在特异性抗体，将20份正常人血清样品RFI均值的二倍定义Cut-off值，样品RFI大于该值即判断为阳性。

1.6. 特异性、灵敏度及稳定性评价

检测68份DENV感染的病人血清样本、20份正常人血清样本与9份基孔肯雅病毒（CHIKV）感染的病人血清样本，计算DENV-LISA的阳性检出率及特异度。分别使用DENV-LISA和商用检测试剂盒，对DENV IgG阳性血清样本和正常人血清样本进行梯度稀释，同时比较两种方法的灵敏度。使用同一批次3张酶标板做重复性试验，每次试验每个样品做3个复孔，分别分析板间、板内RFI差异，计算变异系数，评价DENVLISA的稳定性。

2. 结果

2.1. DENV-LISA的建立

挑取DH5α/pNLF1-E1/E2阳性菌落进行PCR，1.3%琼脂糖凝胶电泳，可见单一特异条带，与预计的DENV1-E1与DENV2-E2片段大小相似，测序结果与预期一致；Western blot结果显示，在预计蛋白相对分子质量处，pNLF1-E1/E2转染组标签蛋白有特异印迹反应，pNLF1-N空载体转染组与空白对照组无显色条带，提示NLu-E1与NLu-E2融合蛋白表达成功。建立DENV-LISA技术，在1∶400稀释度下，DENV IgG阳性样本的RFI明显高于正常人样本，表明DENV-LISA建立成功（图 1）。计算正常人血清样本RFI的算术均数，其二倍为31 405，取整，定义Cut-off值为30 000。

1.

DENV1-LISA的建立

Establishment of DENV1-LISA. A: Identification of clone DH5α/pNLF1-E1/E2. Lane 1: PCR product of E1 from DH5α/pNLF1-E1; Lane 2: PCR product of E2 from DH5α/pNLF1-E2. B: Western blotting for identification of NLu-E1 fusion protein. 1: pNLF1-E1; p: pNLF1-N; c: Blank control. C: Western blotting for identification of NLu-E2 fusion protein. 2: pNLF1-E2; p: pNLF1-N; c: Blank control. D: DENV-LISA.

2.2. 特异性评价

共检测97份血清样本，DENV-LISA阳性检出率32.4%，特异度100%，CHIKV假阳性率11.1%；商用ELISA检测试剂盒阳性检出率35.3%，特异度100%，假阳性率0（表 2）。经χ²检验，两种方法阳性检出率差异无统计学意义（P>0.05）；Kappa系数0.47（P < 0.01）。

2.

特异性试验

Specificity test of the assay

ELISA kit	Positive rate	Specificity	False positive rate
DENV-LISA	32.4% (22/68)	100% (0/20)	11.1% (1/9)
Commercial ELISA	35.3% (24/68)	100% (0/20)	0 (0/9)

2.3. 灵敏度评价

DENV-LISA与商用ELISA试剂盒灵敏度试验结果显示，DENV-LISA中，稀释6400倍时可以判断阳性，其中1号样本在12 800倍稀释时仍可判断为阳性；商用ELISA检测试剂盒按照说明书设定的判断标准，在稀释1600倍时已无法判断阳性样本（图 2）。

2.

灵敏度试验

Sensitivity test of DENV-LISA.A: DENV-LISA; B: Commercial ELISA.

2.4. 稳定性评价

DENV-LISA 3次重复性试验结果如表 3所示。板内变异系数0.46% ~4.69%，板间变异系数3.66% ~ 9.37%，同批板间、板内变异系数均低于10%；经方差分析，板间、板内RFI差异无统计学意义（P>0.05），提示该方法检测效果稳定、重复性良好。

3.

DENV-LISA重复性试验

Repeatability test of DENV-LISA

Sample	Plate	Replication			Mean	CV
		1	2	3
CV: Coefficient of variation.
	A	140 160	145 431	142 956	142 849.00	1.85%
	B	132 928	133 809	137 642	134 793.00	1.86%
NO.1	C	130 751	121 090	122 183	124 674.67	4.24%
	Mean	134 613.00	133 443.33	134 260.33	-	-
	CV	3.66%	9.12%	8.04%	-	-
	A	91 086	89 527	87 546	89 386.33	1.98%
	B	78 765	79 728.75	84 244	80 912.58	3.62%
NO.2	C	76 903	80 405	80 675	79 327.67	2.65%
	Mean	82 251.33	83 220.25	84 155.00	-	-
	CV	9.37%	6.58%	4.08%	-	-
	A	20 249	20 131	20 064	20 148.00	0.46%
	B	18 264	19617	19 982	19 287.67	4.69%
NO.3	C	17 130	17 209	18317	17 552.00	3.78%
	Mean	18 547.67	18 985.67	19 454.33	-	-
	CV	8.51%	8.22%	5.07%	-	-

3. 讨论

DENV继发性感染可引发严重的DHF/DSS。研究表明，DENV突变可能改变了DENV的抗原性，患者再次暴露时，获得的免疫失去保护作用^[17]；患者的流动能造成非流行区的本地传播，当患者来自其他国家或隐性感染时，传播风险更大^{[18, 19]}。检测DENV IgG抗体能有效区分初次感染和继发感染^[20]，如果IgG抗体滴度在患者发病1周内迅速增高，提示患者可能为继发感染，作为登革热重症预警指征^[5]；为保证接种的安全性和有效性，DENV疫苗接种前应检测血清抗体^[21]。因此，建立DENV-LISA用于人群中DENV IgG抗体水平筛查，可及时发现隐性感染患者，避免疫情跨区域传播，降低DHF/DSS发生概率。

本研究采用的Nanoluc荧光素酶在底物催化下发出荧光，相较于传统辣根过氧化物酶（HRP），光强度高、衰减速度慢，适用于开发新的酶免疫吸附检测系统^{[22, 23]}。G蛋白能结合人和动物的IgG抗体，因此，DENV-LISA没有种属特异性，不需要动物源性二抗，使检测应用范围更广泛。

目前，DENV血清学抗体检测主要针对E蛋白特异性抗体，但是抗体检测不可避免存在交叉反应^[24]；此外，CHIKV感染临床症状与DENV感染类似，这给抗体检测增加了难度，要求检测抗原具备更高特异性^[25]。

商品化DENV IgG ELISA试剂盒多为C6/36细胞培养病毒获取检测抗原，或利用原核表达系统制备检测抗原。而本研究利用基因工程技术及真核表达系统，获取NLu-E1与NLu-E2融合蛋白作为检测抗原，既避免培养病毒，又保留天然表位，降低抗原制备的危险性与难度，制备时间短，成本低^[26]。本研究还发现，以NLuE1作为检测抗原，阳性检出率10.3%，特异度96.6%；以NLu-E2作为检测抗原，阳性检出率29.4%，特异度89.7%；以NLu-E1/E2作为检测抗原，阳性检出率32.4%，特异度96.6%。结果显示，NLu-E1与NLu-E2存在不同的抗原表位，并且组合使用，增加了阳性检出率和检测特异性^[27]。NLu-E1、NLu-E2分别作为检测抗原，阳性检出率差异有统计学意义（P < 0.05），可能因为E蛋白第一、第三区域存在型特异性表位^[28]。全类型检测试剂盒使用DENV1-4混合抗原，本研究使用DENV1与DENV2混合抗原，阳性检出率（32.4%）与全类型检测试剂盒（35.3%）差异无统计学意义。可能因为血清样本来自广东省，患者主要感染DENV1或DENV2^[29]，与本研究使用检测抗原来源一致。DENV全类型检测增加了IgG抗体结合位点，但由于存在空间位阻效应，可能会影响抗原与抗体的特异性结合^[24]。

本研究正常人血清样本中未检出阳性，CHIKV患者样本假阳性率11.1%（1/9），假阳性率较低^[30]，特异度高，优于部分检测试剂盒。登革热患者血清样本IgG抗体阳性检出率32.4%，与商用检测试剂盒持平，但总体偏低，可能是部分患者采血时处于病程早期，体内尚未产生足量E蛋白特异性IgG抗体^[31]。

采用DENV-LISA技术，样品稀释12 800倍时，仍可检出阳性，灵敏度高于商用检测试剂盒，可以更早地检测出患者体内IgG抗体。由于样品数量有限，且缺乏流行病学资料，灵敏度与阳性检出率之间的关联，有待更多临床样本，做进一步验证。

DENV-LISA重复性试验显示，同批板间、板内RFI变异系数均小于10%，低于检测试剂盒规定的15%，重复性好；检测抗原置于-20 ℃，保存6个月，阳性检出率和特异度没有变化。由于检测抗原直接取细胞裂解上清液，裂解液中加入甘油，可防止冰晶形成，以延长保存时间，并保持活性^{[32, 33]}。

综上所述，本研究使用DENV E蛋白两段特异性序列编码的融合蛋白，作为检测抗原，检测登革病毒IgG抗体，建立DENV新型荧光素酶免疫吸附检测技术，特异性好，灵敏度高，重复性强，制备简便，成本低，可应用于登革热的流行病学调查、自然疫源地病原微生物的早期筛查、监测预警、跨种传播、溯源和传染病疫情风险评估等。

Biography

刘金月，硕士，E-mail: 562250862@qq.com