框架核酸在骨再生领域应用的研究进展

Abstract

框架核酸（FNA）是一组以框架形态为特征的DNA纳米结构，通过设计合理的碱基序列，按照碱基互补配对原则组合而成。近期发现通过DNA纳米技术构建出的三维FNA纳米结构在骨再生领域具有一定的应用优势，可通过诱导干细胞成骨分化与骨再生、促进血管再生、神经调节、免疫调节、药物递送等多种机制发挥着巨大成骨应用潜能，成为骨再生领域的新型候选纳米材料。本文就FNA在骨组织再生领域中的研究现状作一综述。

创伤和骨疾病，如骨质疏松症和骨代谢异常，可造成骨折和缺损，常常需要骨修复和再生治疗[1]。随着骨疾病发病率上升和老龄化人口增加，这种需求日益加剧。而目前临床上有针对性地修复和重建骨缺损，仍然是一个挑战。自1997年Cao等[2]首次提出“组织工程”这一定义以来，其已被设计用于损伤、病变组织再生。其中骨组织工程作为针对骨修复再生的组织工程为骨缺损患者带来了福音，其基本过程是利用细胞、支架、生物活性因子的组合，在体外预培养细胞增殖分化、基质形成和骨重塑，然后将载细胞材料植入人体，引导骨再生[3]–[4]。然而，目前的生物材料的成骨效果有限，并倾向于降低细胞的活性，因此亟需新型的成骨材料。

自1982年Seeman[5]提出用DNA构建固定连接的创新思想来，DNA纳米技术在过去几十年里以惊人的速度发展。从霍利迪连接到DNA瓷砖[6]、二维晶格[6]–[7]，再到高阶DNA折纸[8]和DNA纳米复合物[7]，多种DNA纳米结构应运而生，由于其在生物介质中具有较高的抗酶降解能力、可编辑性、可控性和良好的力学性能，而逐渐受到人们的关注。在不同形式的DNA纳米结构中，以框架形态为特征的框架核酸（framework nucleic acid，FNA）纳米结构，被认为是最有前途的类型之一[9]–[10]。有越来越多的证据表明，FNA可通过多个机制促进骨再生修复，具体来说：1）FNA可诱导多种干细胞成骨分化，如FNA帮助分离和富集骨骼干细胞，诱导脂肪源性干细胞、口腔源性干细胞的增殖、迁移和成骨分化；2）FNA可促进血管生成，进而促进骨再生；3）FNA可促进神经化骨组织再生；4）FNA可参与骨组织免疫调节。总之，FNA在构建骨组织再生微环境中具有巨大的应用潜力，现将FNA在骨组织再生工程中的研究现状作一综述。

1. FNA作为纳米材料在骨再生组织工程中的应用优势

从材料的角度看，骨是一种由有机（主要是纳米胶原纤维）和无机（纳米晶羟磷灰石）组成的纳米材料，具有从纳米到宏观的层次结构。纳米技术的总体理念是通过操纵材料的最小成分来控制其结构和产生的特性来设计材料，由于天然骨组织的纳米级结构特征对其独特性至关重要，因此纳米材料很容易在骨再生中得到应用。

纳米材料在骨再生组织工程中的应用优势，具体表现在5个方面：1）生物材料中适当的成分可以为骨的生物矿化提供持续的营养；2）材料的纳米特性可能介导细胞行为（细胞黏附、细胞分化）和骨整合；3）纳米元素本身是很好的增强剂，可以提高新生骨的强度[11]–[13]；4）纳米材料呈现出的宏观或微观纳米多孔结构的层次结构，有利于细胞渗透、营养或废物运输、骨内生长和血管化；5）纳米结构的引入可能改变生长因子的传递方式，使支架具有吸收内源性细胞和加速新骨和血管形成的能力[14]。

尽管可供骨组织工程应用的纳米材料有很多，但大多数尺寸和形状很难实现精确控制。相反，由DNA纳米技术构建出的三维FNA纳米结构，具有分子量单一、结构明确、尺寸形状可控等力学性能可调的特点，为纳米材料在骨组织工程中的应用提供了先进的工具。在进一步的发展中，具有预定尺寸和功能的多种FNA结构被设计合成，包括四面体、立方体、八面体、十二面体空心球体等[15]–[18]。其中，最简单最稳定的框架结构模型之一是4条特定单链DNA通过互补碱基配对自组装的四面体框架核酸（tetrahedral framework nucleic acid，tFNA）。tFNA在骨再生领域应用具有众多优势：1）组装快速，组装合成需0.5 h左右；2）产率高，可达90%；3）结构稳定，具有相对血清稳定性和一定的机械刚度；4）强大的入胞能力，tFNA可以通过多种活细胞的细胞膜甚至微生物的硬壁，它以顶角迅速攻击细胞膜，使电荷排斥最小化并引发电荷再分配，随后通过小窝蛋白介导的内吞途径进入细胞质，然后以微管依赖性的方式转移到溶酶体中，也正因为这一特性，tFNA还可以作为载体间接帮助骨再生[19]–[24]。

2. FNA诱导干细胞成骨分化与骨再生

多能干细胞由于自我更新和多系分化性质，而被认为是组织工程中的一种很有前途的解决方案。胚胎干细胞和成体干细胞是哺乳动物常见的干细胞，由于人类胚胎干细胞的来源和伦理要求有限，成体干细胞在组织工程中的应用更为普遍。成体干细胞中的骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSC）和脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSC）因其操作简便、操作简单、不存在美学难题等优点，在骨修复的细胞治疗中显示出巨大的应用前景。

2.1. FNA帮助分离和富集骨骼干细胞

人骨髓中含有大量的骨骼干细胞（skeletal stem cells，SSC），具有向成骨、成脂肪和成软骨细胞分化的能力。起初，BMSC只能在体外培养基上分离，干细胞种类丰富，但这些并不是最原始的SSC。在缺乏特异性SSC标记物的情况下，目前从人体组织中分离和富集SSC的方法仍具有挑战性。

Xavier等[25]将多个寡核苷酸通过硫醇键连接固定在金纳米离子上形成球形核酸（spherical nucleic acids，SNA），该结构不仅可以检测基于mRNA表达的SSC，而且可以快速从人骨髓中分离SSC，而不影响骨骼细胞的长期存活，这是组织工程策略中利用SSC帮助骨再生的关键。尽管骨髓中存在SSC数量有限，但该研究表明在骨髓的每200个SSC中，SNA能特异性的检测和富集1个，这相当于一个50~500倍的富集。再加上这种策略的速度和简单性，这种方法具有广泛的应用潜力。

2.2. FNA诱导脂肪源性干细胞的增殖、迁移和成骨分化

脂肪组织来源的干细胞已被认为是一种可行的替代方案，因为它们具有体外成骨能力，易获得性以及在低氧和低糖环境中生存的能力[26]–[27]。

目前，ADSC在许多动物模型中被广泛应用于骨缺损的修复和重建。然而，仅依靠ADSC的成骨分化能力不足以修复大骨缺损。Shao等[28]将ADSC暴露于250×10⁻⁹ mol·L⁻¹浓度的tFNA后，碱性磷酸酶染色和钙沉积实验表明，tFNA通过促进碱性磷酸酶活性和促进基质矿化，在促进骨形成中起重要作用。经典Wnt/β-连环蛋白通路的激活似乎是tFNA诱导ADSC成骨分化的主要机制，Wnt/β-连环蛋白通路是调节细胞成骨分化的重要信号，与骨形成和发育密切相关[29]–[30]。Wnt与受体结合后产生下游信号，激活β-连环蛋白，减少β-连环蛋白的降解，Wnt/β-连环蛋白信号的激活导致Runt相关基因2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）的表达，Runx-2被认为是主要的成骨转录因子和成骨细胞[31]–[32]的最早标记。随后，Runx-2的表达诱导成骨相关蛋白的表达，并调节成骨分化。此外，Wnt信号还可以抑制脂肪形成的早期阶段，同时促进成骨[33]。250×10⁻⁹ mol·L⁻¹浓度的tFNA可能提供一种独特的细胞环境，促进ADSC的成骨分化和增殖，为其在骨组织再生治疗中的潜在应用开辟了未来的机会。

细胞迁移是非常复杂的细胞行为，是许多生物学过程（包括胚胎发育、组织再生和免疫反应）的关键组成部分[34]–[37]。在机制方面，已经广泛证明蛋白质Ras相关C3肉毒菌毒素底物（ras-related C3 botulinum toxin substrate，RAC）和视紫质重组蛋白（recombinant rhodopsin，RHO）的相互调节对细胞迁移至关重要。Shi等[38]将ADSC暴露于tFNA后，结果表明，tFNA以浓度依赖性的方式促进ADSC的细胞迁移。值得注意的是，当tFNA被ADSC内化时，它们抑制lncRNA XLOC 101623的转录，激活TIAM1/RAC1和RHOA/ROCK2信号通路，导致相关基因和蛋白质表达的改变，最终促进ADSC的迁移。基于这些发现，tFNA作为一种功能性三维DNA纳米材料，在组织修复和再生医学中显示出了很高的应用潜力。Lin等[39]进一步的特异性聚合酶链反应和基因功能分析显示，tFNA通过Dlg3基因启动子的DNA甲基化，促进ADSC增殖。此外，tFNA还降低了ADSC中凋亡相关蛋白半胱天冬酶-3（casepase3）和Bcl-2相关X蛋白（bax）的基因和蛋白质表达，这些结果表明，tFNA有助于抑制ADSC的凋亡。

2.3. FNA诱导口腔源性干细胞的增殖、迁移和成骨分化

最近，越来越多的研究[26],[40]–[43]开始关注口腔间充质干细胞以及生物制骨。牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）和牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）作为分别来源于牙周膜和牙髓的间充质干细胞，具有强的可克隆、自我更新和多能性等多种优势，可以在不同的诱导条件下分化为神经、骨、肌肉和脂肪组织等各种组织。此外，与BMSC相比，PDLSC和DPSC由于创伤小，免疫原性低，被认为是口腔骨再生中理想的种子细胞，特别是对牙槽骨缺损的重建。

根据先前的一些研究表明，PDLSC可以分化为成纤维细胞、成骨细胞样细胞和骨水泥细胞样细胞，以产生天然的牙周组织、骨样组织和骨水泥组织。DPSC可以在不同的细胞微环境中诱导形成骨、脂肪、牙齿、神经、肌肉、血管组织[44]–[48]。此外，PDLSC和DPSC已经被加载到各种各样的支架材料上，如羟磷灰石、胶原海绵、壳聚糖和水凝胶，然后移植到动物模型中，以探索其对骨和牙组织再生的能力[49]–[51]。Zhou等[52]利用tFNA刺激PDLSC来调节其生物行为，研究结果表明，250×10⁻⁹ mol·L⁻¹浓度的tFNA能通过调节Wnt/β-连环蛋白通路，促进PDLSC的增殖，大大增强PDLSC的成骨分化。进一步研究[53]表明，tFNA还可以促进PDLSC在体外的迁移；促进成骨相关因子Runx2、骨桥蛋白的表达，从而促进成骨分化；明显抑制牙周炎对牙周组织的破坏。这些作用可能与tFNA抑制肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1、白细胞介素-6、一氧化氮以及细胞活性氧的产生，抑制破骨细胞的生成从而减少牙槽骨的吸收有关。另一项研究[54]结果表明，tFNA不需要其他转染试剂的辅助就可以被导入DPSC。同时，tFNA通过上调经典Notch信号通路相关基因和蛋白的表达，促进了DPSC的增殖和成骨/成牙分化。因此，利用tFNA作为新型的框架核酸纳米材料，可以被认为是DPSC为基础的骨和牙组织再生的一个有希望的替代方法。

3. FNA血管调节作用与骨再生

骨组织作为一种高度血管化的组织，其形成过程往往离不开血管的生长与生成。血管可以为细胞提供足够的营养和氧气，以维持细胞和新形成的组织的活力。骨血管化不足可能导致细胞和/或组织死亡，阻碍骨形成和/或减少新形成的骨量[55]。新生血管为骨移植工程的仿生研究增加了第四维度，已经被证明是移植存活，整合和宿主功能的关键[56]。

血管与骨组织之间的耦合作用涉及多种复杂的机制，其中内皮细胞的Notch通路激活可有效促进骨骼中的血管生成和成骨[57]。有研究[58]表明，在250×10⁻⁹ mol·L⁻¹浓度下，tFNA可进入内皮细胞，并通过激活Notch信号通路，促进内皮细胞的增殖、迁移；通过上调血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受体、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等多种血管生成生长因子的表达，促进血管生成，这为FNA进一步在血管和成骨组织工程中的应用提供了理论基础。另外，tFNA的血管生成作用在Lin等[59]的研究中也得以验证，该研究表明，在血管的炎症和氧化损伤反应中，tFNA可通过活化Akt促进VEGF基因的表达和新血管的形成。

双膦酸盐相关的颌骨坏死（bisphosphonates-related osteonecrosis of the jaw，BRONJ）是一种严重影响患者的生活质量的骨代谢疾病，其发生可能是由骨代谢不平衡、抗血管生成、异常的免疫功能等一种或多种原因引起的[60]。双膦酸盐可通过抑制多种血管生成因子的表达，进而抑制血管的生成，从而导致颌骨缺血坏死。其中VEGF是刺激血管生成的特异性因子，可以促进内皮细胞的存活、增殖、迁移，并增加血液通透性[61]。缺氧诱导因子1α可以促进血管形成和参与介导血管与骨组织之间的耦合作用[62]，MMP2和MMP9可以降解细胞外基质，促进内皮细胞迁移，并为血管的生成打开空间[63]。在Zhao等[64]的体外研究中，tFNA可通过上调上述血管生成生长因子的表达，发挥其促进血管生成的能力并逆转双膦酸盐对血管生成的抑制作用。这一结果在其体内实验中也得以验证，tFNA可以促进BRONJ大鼠血管的生成，并减少拔牙部位的骨骼暴露，进而增加拔牙部位牙槽骨的相对高度，最终很大程度上改善了BRONJ的预后。值得注意的是，在tFNA促进血管生成的机制上，该研究认为信号传导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）起到了关键的作用，tFNA可以在双膦酸盐刺激的环境中促进STAT的磷酸化，从而促进血管生成。

4. FNA的神经调节作用与骨再生

除了血管化，神经化骨组织的产生也被认为是骨组织工程最大的障碍之一，感觉神经和自主神经的神经支配与骨稳态调节之间的关系越来越受到重视。根据希尔顿规则[65]，支配肌肉的神经也支配附着的骨骼，此外，伴随血管的大神经束在不同部位滋养骨骼。大量对机械应力和疼痛敏感的感觉神经纤维支配小梁骨和骨膜[66]–[67]，这些感觉神经纤维可通过分泌感觉神经递质[68]–[69]影响骨代谢和骨重塑；此外，重建神经支配能够有效预防骨移植的骨质疏松，这提示神经支配可能在促进组织工程骨形成中发挥了重要的作用[70]。

在神经组织重建过程中，神经干细胞向损伤区迁移，并在损伤区分泌一定的生长因子，会进一步加速神经干细胞的迁移，进而分化为神经细胞[71]，这是神经及其附属细胞修复和再生的关键过程。然而，神经干细胞的增殖、迁移和分化能力较差，很难修复和再生损伤的神经组织。因此，研究安全有效地促进神经干细胞迁移的生物材料，对神经化骨组织的产生具有重要意义。Ma等[24]的一项研究结果提示，250×10⁻⁹ mol·L⁻¹浓度的tFNA通过激活Wnt/β-连环蛋白通路，进而促进了小鼠神经干细胞的增殖，并通过抑制Notch信号通路促进了神经元的分化，并进一步用划痕实验和transwell小室实验研究不同条件下培养小鼠神经干细胞的迁移行为，结果发现，干细胞能快速内化tFNA，并有效促进细胞的平行和垂直迁移。此外，tFNA能够上调RhoA、Rock2和黏着斑蛋白的基因和蛋白表达水平，这表明tFNA在细胞迁移过程中激活了RhoA/Rock2通路，最终促进小鼠神经干细胞的迁移[72]。这些结果表明，tFNA在神经组织修复和再生方面有很大的应用潜力。

5. FNA的免疫调节作用与骨再生

在某些情况下，当骨缺损较大或并存某些疾病（如肿瘤、骨质疏松症）时，可能需要使用合成骨移植物来促进骨再生过程。在这些情况下，外源性的生物材料会立即触发宿主反应，包括蛋白质吸附、血凝块形成和炎症过程。免疫系统在骨中的作用，并不局限于细菌产物和抗原[73]–[74]的吞噬功能或对骨损伤的反应[75]–[77]，免疫系统在骨中的相关功能还包括：刺激成骨细胞的矿化、多核巨细胞和破骨细胞的形成、参与建模和重塑阶段以及维持骨组织的内稳态[78]。因此，开发能够通过与免疫系统的正反馈促进组织愈合的生物材料，目前正成为一个基础研究课题。

巨噬细胞是免疫系统的主要组成部分之一，其分化为促炎或抗炎表型对细胞干扰和随后的正常骨再生过程有很大影响。巨噬细胞的这种调节作用是至关重要的，因为它可以诱导和决定骨组织主动再生或持续炎症的两种不同结局。经典活化巨噬细胞M1表型作为促炎性巨噬细胞，分泌各种促炎因子，如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1、白细胞介素-6、活性氧、一氧化氮等，维持骨组织炎性损伤反应；替代活化巨噬细胞M2表型作为抗炎症的巨噬细胞分泌抗炎因子，如抗炎因子白细胞介素-10和转化生长因子-β，有助于消除炎症，促进伤口愈合和组织重塑[79]–[82]。

Zhao等[64]的研究表明，tFNA可以在无载体的情况下进入小鼠单核巨噬细胞，减少脂多糖联合干扰素-α处理后M1型标志物诱导型一氧化氮合酶，促炎因子（肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1、白细胞介素-6），一氧化氮和活性氧的产生，同时M2型标志物精氨酸酶1和白细胞介素-10、转化生长因子-β表达增加，提示tFNA抑制了巨噬细胞M1表型极化，并促进了巨噬细胞向M2表型极化，在阻止炎症反应进程的同时，促进了伤口愈合和骨组织重塑。进一步研究表明，tFNA在体内外通过调节STAT的磷酸化，促进巨噬细胞向M2型极化，这为tFNA作为骨免疫调节材料，在骨愈合的各个阶段支持骨组织的再生提供了理论依据。另外，在牙周病的细菌感染过程中，牙周组织细胞会暴露于外源性炎症因子如脂多糖中，Zhou等[53]将250×10⁻⁹ mol·L⁻¹浓度tFNA加入脂多糖刺激后的牙周膜干细胞中观察到，牙周膜干细胞分泌了促炎细胞因子，并且其细胞活性氧水平降低，成骨分化增加。这一结果在丝线结扎致牙周炎的体内牙周炎模型中也得以证实，250×10⁻⁹ mol·L⁻¹ 和500×10⁻⁹ mol·L⁻¹浓度tFNA通过减少炎症渗出和抑制破骨细胞的形成，均减少了牙槽骨的吸收。进一步研究表明，tFNA的体内外免疫调节作用与减少白细胞介素-1、白细胞介素-6等抗炎因子的释放有关，从而抑制了破骨细胞的生成，对牙周组织包括牙槽骨、牙骨质和牙周韧带有明显的保护作用。

6. 总结与展望

综上所述，FNA独特的物理和化学性质吸引了大量学者对其进行研究。如图1所示，在骨组织再生方面，FNA可以调节干细胞的增殖迁移和成骨分化，可以通过骨组织纳米外环境模拟、骨组织血管化、神经化以及炎症免疫调节，为骨组织再生提供良好的内外环境。值得注意的是，FNA强大的入胞能力和可编辑特性，为骨组织再生过程中各种生长因子和小分子药物的靶向递送和可控性释放提供了巨大的可能性。笔者相信，FNA将会是未来促进血管化和神经支配骨组织产生的一种重要手段，在骨修复和再生方面具有巨大的潜力。

图 1. FNA在骨再生领域的应用.

Fig 1 Application of FNA in bone regeneration

虽然FNA已被报道在骨再生领域具有巨大潜力，但FNA在骨组织修复和再生中的应用仍然具有挑战性。许多研究仍处于初级阶段，迫切需要进一步的探索才能实际应用。在未来可能需要通过精细调整其结构，在组成、结构、生物功能以及骨愈合过程中结合仿生特性和生物功能的新策略，完全实现组合模拟，为原位骨再生创造真实的模拟微环境，可以赋予FNA更有效和更好的骨再生能力。

专家简介

林云锋，教授，博士生导师，中国共产党党员。口腔疾病研究国家重点实验室副主任、四川大学华西口腔医院颌面外科一级专家、四川大学华西医学中心副主任、四川大学生物医学工程学院副院长。入选科技部中青年科技创新领军人才、教育部新世纪优秀人才，获中国青年科技奖、教育部自然科学二等奖、教育部科技进步二等奖、全国百篇优秀博士论文等。担任Bone Research等4种SCI杂志执行主编或副主编，主编8本英文专著。主持国家重点研发计划课题、国家自然科学基金、万人计划特殊支持经费、四川省青年科技创新团队、教育部优秀博士学位论文专项基金、新世纪优秀人才支持计划等课题。发表通信/第一作者SCI论文156篇。其中F1000推荐论文3篇，ESI高被引论文12篇，封面论文16篇。主要从事框架核酸纳米材料在基因和药物传递方面研究。

Funding Statement

[基金项目] 国家重点研发计划（2019YFA0110600）；国家自然科学基金（81970916，81671031）

Supported by: National Key R&D Program of China (2019YFA0110600); National Natural Science Foundation of China (81970916, 81671031).