孕期多种低剂量化学物质暴露诱发子代炎症状态和自闭症样行为的实验研究

Abstract

Objective:

To investigate the effects of maternal exposure to 13 chemicals mixture (CM) during pregnancy on pregnancy outcome and health status of maternal/offspring mice.

Methods:

C57BL/6 pregnant mice were given drinking water containing carbaryl 0.0075 mg/kg, dimethoate 0.001 mg/kg, glyphosate 0.5 mg/kg, methomyl 0.0025 mg/kg, methyl parathion 0.003 mg/kg, triadimefon 0.03 mg/kg, aspartame 40 mg/kg, sodium benzoate 5 mg/kg, calcium disodium ethylene diamine tetra-acetate 2.5 mg/kg, ethylparaben 10 mg/kg, butylparaben 0.5 mg/kg, bisphenol A 0.004 mg/kg and acacia gum 34 mg/kg. The effects of CM exposure on pregnancy outcome, health status of dams/offspring, levels of circulating inflammatory cytokines in dams/offspring and emotional related behaviors of offspring were evaluated.

Results:

CM exposure during pregnancy had no significant effect on pregnancy outcome, liver function, body weight of the dams in late pregnancy and uterine/ovarian weight after delivery, however, it led to an increase in maternal serum IFN-γ level （ P<0.05）. CM exposure during pregnancy had no significant effect on the liver function of offspring, but increased the serum IFN-γ, prefrontal cortex IFN-γ, IL-6 and TNF-α and hippocampus IFN-γ levels in the offspring（all P<0.01）. In addition, the offspring of CM group showed significant abnormal emotion-related (autism-like) behaviors in adulthood, especially in male offspring.

Conclusion:

Low dose CM exposure during pregnancy may induce inflammation status in dams/offspring, and lead to autism-like behaviors in offspring, indicating the potential effects of low dose CM exposure on human maternal and infant health.

肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）;干扰素（interferon，IFN）;天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）;丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）;白介素（interleukin，IL）;单核细胞趋化蛋白（monocyte chemotactic protein，MCP）;

在日常饮食中，人们持续暴露于多种化学物质，包括食品添加剂、食品接触材料和食品中残留农药等，如草甘膦、三唑酮、甲基对硫磷、乐果和阿斯巴甜等。许多化学物质可能通过胎盘从母亲传递给胎儿，或通过引发母体代谢、内分泌异常间接损害胚胎发育 ^[1] ，因此孕期暴露于食品添加剂、农药残留成分等化学性危险因素可引起子代发育异常。啮齿类动物研究表明，孕期暴露于超过安全剂量的单一化学毒物会引起子代发育异常，如草甘膦可诱发子代自闭症样行为和肠道菌群失调 ^[2] ；三唑酮引起子代腭裂、颅骨畸形和心血管异常 ^[3] ；甲基对硫磷可造成孕鼠的生殖系统损害，甚至导致子代在产后死亡 ^[4] 。此外，孕期暴露于日常饮食中的化学性危险因素也可造成母代自身健康损害，如乐果导致孕鼠体重减少，卵巢、子宫质量下降 ^[5] 。

尽管每种化学物质都有相应的安全剂量标准或人体可接受的每日摄入量 ^[6] ，但实验研究表明，如果暴露于多种化学物质，即便是每一种化学物质的暴露剂量都低于安全剂量标准，仍会导致不良后果 ^{[ 6- 8]} 。有研究持续12个月给予大鼠13种低剂量的化学物质混合物，以模拟人类日常饮食中的混合化学物质暴露，结果显示大鼠饮用水消耗量增加、肝功能损伤、血液中促炎性细胞因子TNF-α和IFN-γ含量显著增加 ^{[ 6- 7]} 。此外，混合化学物质暴露对大鼠的行为和中枢神经系统功能也可能产生不良影响，导致大鼠焦虑增加 ^[8] 。

上述研究所采用的暴露模式可归为两类：孕期单种化学毒物超过安全标准的暴露和非孕期多种化学物质在安全标准内混合暴露，均未涉及孕期多种化学物质在安全标准内混合暴露。针对这一科学问题，本研究评估了母鼠孕期日常饮食暴露于多种化学性危险因素对母代和子代发育的影响，希望为研究人类孕期类似暴露事件对妊娠结局和母代/子代健康状态可能产生的损害提供实验依据。

1材料与方法

1.1实验动物

30只雌性和15只雄性8周龄C57BL/6小鼠分两批购于广东省医学实验动物中心。所有动物均饲养在12 h明/暗周期（8:00—20:00/20:00—8:00）的房间内，给予充足的饲料和水。将小鼠适应性饲养1周后，于16:00按照每笼1只雄鼠和2只雌鼠饲养。每日8:00和19:00对所有雌鼠进行阴栓检查，观察到阴栓者，记为妊娠第0天，并将孕鼠单笼饲养。分娩当天子鼠日龄记为出生后0天。本研究所有操作符合广东药科大学实验动物中心的伦理学要求。

1.2化学物质、试剂和仪器

西维因、乙二胺四乙酸、对羟基苯甲酸丁酯、双酚A和阿拉伯树胶为上海易恩化学技术有限公司产品；乐果、草甘膦、三唑酮、阿斯巴甜和苯甲酸钠为上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品；灭多威和甲基对硫磷为曼哈格检测技术股份有限公司产品；对羟基苯甲酸乙酯为上海贤鼎生物科技有限公司产品；BCA蛋白定量检测试剂盒为美国Bioworld Technology有限公司产品；全自动生化分析仪为日本Arkray公司产品；Luminex试剂盒为美国Millipore公司产品。

1.3实验分组

将24只受孕的雌鼠随机分为实验1组和实验2组，每组12只。

实验1：将12只孕鼠进一步随机分为对照组和实验组，每组6只。对照组给予普通饮用水，实验组在孕期给予含低剂量混合化学物质的饮用水。分娩当天，在同一窝别的子鼠中随机选取3只雄鼠和3只雌鼠进行血清和组织细胞因子含量检测。

实验2：将12只孕鼠进一步随机分为对照组和实验组，每组6只。对照组给予普通饮用水，实验组在孕期给予含低剂量混合化学物质的饮用水，分娩当天更换为普通饮用水。分娩后56 d，在同一窝别的子鼠中随机选取1只雄鼠和1只雌鼠进行行为学实验。

1.4孕期混合化学物质暴露剂量

混合物含有下列相应剂量的化学物质（均为每日可接受摄入量）：西维因（0.0075 mg/kg）、乐果（0.001 mg/kg）、草甘膦（0.5 mg/kg）、灭多威（0.0025 mg/kg）、甲基对硫磷（0.003 mg/kg）、三唑酮（0.03 mg/kg）、阿斯巴甜（40 mg/kg）、苯甲酸钠（5 mg/kg）、乙二胺四乙酸（2.5 mg/kg）、对羟基苯甲酸乙酯（10 mg/kg）、对羟基苯甲酸丁酯（0.5 mg/kg）、双酚A（0.004 mg/kg）和阿拉伯树胶（34 mg/kg）。

由于孕鼠体重每日变化幅度较大，为了尽可能确保每日实际暴露剂量准确，将各化学物质先配制成储存液，即将各化学物质按上述剂量的1000倍共同溶于10 L饲养动物的饮用水中 ^[7] 。实验期间，每天上午8:00测定孕鼠体重和前一天饮用水的消耗体积，8:30重新配制并更换一瓶体积为20 mL的饮用水（含有13种化学物质）。以阿斯巴甜为例说明每天饮用水溶液的配制：

$$\begin{array}{cr}\frac{4\left(\text{mg}/\text{mL}\right)\times V_1\left(\text{mL}\right)}{20\left(\text{mL}\right)}=\frac{40\left(\text{mg}/\text{kg}\right)\times \text{BW}\left(\text{kg}\right)}{V_2\left(\text{mL}\right)}& \end{array}$$

其中，V ₁为当天用于配制的储存液体积，BW为当日测得每只孕鼠的体重，V ₂为前1 d实际消耗饮用水的体积。

1.5母鼠生殖系统一般健康状态评估

实验1组母鼠分娩结束后立即麻醉处死并完成心脏采血，取出母鼠双侧卵巢和子宫，清理卵巢、子宫表面结缔组织，并用磷酸盐缓冲液冲洗表面血液，再用滤纸吸干器官表面残留的磷酸盐缓冲液，随即对各器官进行称重。

1.6母鼠妊娠结局评估

记录每组每窝新生小鼠的数量，若有死胎，记录死胎的数量并计算死胎率。测量新生小鼠的身长和体重。

1.7血液和脑组织样本采集

实验1组母鼠分娩后立即给予腹腔注射10%水合氯醛麻醉，剪开胸壁，暴露心脏后经右心室采血0.5~0.8 mL。血液在室温下静置1 h后，在4000× g、4 ℃的条件下离心5 min，收集上清液，将血清储存在–80 ℃冰箱备用。

分娩当天，将新生小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，剪开胸壁，暴露心脏后经右心室采血。因每只新生小鼠可采到的血液量较少，将同一窝别、同一性别随机选出的3只新生小鼠的血液放置于同一离心管中，总体积约0.03 mL。制备和储存方法同上。在血液采集完成后，用一次性无菌胰岛素注射器装满1 mL等渗氯化钠溶液，对新生小鼠经心脏进行体循环灌注，去除脑组织血管床中的残留血液，并立即在冰上取脑，分离前额皮质和海马组织。因每只新生小鼠的前额皮质和海马的组织量较小，将同一窝别、同一性别随机选出的3只新生小鼠的前额皮质置于同一离心管中，海马组织置于另一离心管中，分别将两个脑区的组织匀浆，在12 000× g和4 ℃条件下离心30 min后取上清液，使用BCA蛋白检测试剂盒将样品的蛋白浓度调节至4.5 mg/mL，并保存在–80 ℃冰箱备用。

1.8采用全自动生化分析仪测定肝功能指标

测定小鼠血清中AST和ALT的含量。根据参考文献 [9]，将10 μL血清样品用等渗氯化钠溶液进行1∶5稀释后检测，测定结果乘以稀释倍数即为实际测值。

1.9采用Luminex试剂盒测定血清和脑组织细胞因子含量

按照Luminex试剂盒的产品说明书操作，将5 μL血清进行1∶5稀释，测定母鼠血清以及子鼠血清、前额皮质和海马中IFN-γ、IL-6、IL-12p70、TNF-α和MCP-1的含量。

1.10行为学实验

1.10.1三箱社交试验检测小鼠的社交行为

在小鼠熟悉环境后，检测小鼠靠近试验箱中装有另一只陌生小鼠的金属笼的时间，判断小鼠的社交能力。将青春期（PND56）小鼠放入试验箱中进行5 min的自由探索。适应后的小鼠被放在试验箱中间的封闭房间里，左边房间的金属笼里有一只陌生小鼠，右边房间里有一个空的金属笼。然后打开两个侧室的入口，允许测试小鼠自由探索10 min。为了评估社交能力，使用动物行为学视频分析系统记录测试小鼠与陌生小鼠互动的时间。最后，将一只新的陌生小鼠放入右边房间的金属笼中，记录测试小鼠与新小鼠互动的时间。每次测试结束后，用70%的乙醇清洗试验装置 ^[10] 。

1.10.2旷场试验检测小鼠的焦虑样行为

旷场试验在三箱社交试验结束后24 h进行。将每只小鼠单独放置在50 cm × 50 cm × 50 cm的旷场箱中，让其自由探索该装置10 min，使用动物行为学视频分析系统记录每只小鼠在旷场中央区停留的时间和进入中央区的次数。每次测试结束后，用70%的乙醇清洗试验装置 ^[10] 。

1.10.3强迫游泳试验和悬尾试验检测小鼠的抑郁样行为

强迫游泳试验在旷场试验结束1 h后进行。将小鼠分别放入直径10 cm的塑料圆柱形筒中，水深20 cm，水温（22±1）℃，从小鼠入水后计时6 min，使用动物行为学视频分析系统连续监控并记录后5 min内小鼠漂浮不动的时间。强迫游泳试验结束后，用毛巾擦干小鼠后用暖风机吹5 min，并放回笼子 ^[10] 。

悬尾试验在强迫游泳试验结束3 h后进行，将小鼠尾巴下方固定在夹子的边缘，并悬于头部离地面15 cm的位置。每只小鼠倒挂6 min，用动物行为学视频分析系统记录小鼠在后5 min内不动的时间。

在完成行为学测试后，用10%的水合氯醛过量麻醉后处死动物 ^[10] 。

1.11统计学方法

使用SPSS 26.0软件包进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ $\overline{\text{x}}\pm s$ ）描述。母代检测指标比较采用  t  检验，子代检测指标在满足正态性和方差齐性的前提下选择双因素方差分析比较各因素的主效应及其交互效应，显著性水准 α  = 0.05。进一步采用Bonferroni法进行事后检验，显著性水准 α  = 0.05。正态性检验和方差齐性检验分别采用柯尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫检验和莱文方差等同性检验，显著性水准 α  = 0.1。各指标相关性分析采用皮尔逊检验，显著性水准 α  = 0.05。

2结果

2.1孕期混合化学物质暴露对母鼠分娩前体重及分娩后子宫、卵巢质量的影响

实验组与对照组母鼠分娩前体重，分娩后子宫、卵巢质量差异均无统计学意义（均 P>0.05），见 表1。结果提示，孕期混合化学物质暴露对母鼠分娩前体重及分娩后子宫、卵巢质量无明显影响。

表 1 实验组与对照组母鼠分娩前体重和分娩后子宫、卵巢质量比较

Table 1 Comparison of body weight before delivery and uterus/ovary weight after delivery of maternal mice between two groups

（ $\overline{\text{x}}\pm s$ ，g）

组别	n	体重	子宫质量	卵巢质量
对照组	6	59.8±7.9	2.7±0.4	0.102±0.015
实验组	6	62.1±7.7	2.4±0.6	0.098±0.014
t值	—	–0.511	0.866	0.465
P值	—	>0.05	>0.05	>0.05

“—”：无相关数据.

2.2孕期混合化学物质暴露对母鼠肝功能及血清细胞因子水平的影响

实验组与对照组母鼠肝功能相关指标ALT、AST差异均无统计学意义（均 P>0.05）；与对照组比较，实验组母鼠血清中IFN-γ水平升高（ P<0.05），其他细胞因子水平与对照组差异均无统计学意义（均 P>0.05），见 表2。结果提示，孕期混合化学物质暴露增加了母鼠血清中IFN-γ的水平，而对肝功能无明显影响。

表 2 实验组与对照组母鼠肝功能和血清细胞因子检测结果比较

Table 2 Comparison of liver function and serum cytokines in maternal mice between two groups

（ $\overline{\text{x}}\pm s$ ）

组 别	n	AST（U/L）	ALT（U/L）	IFN-γ（pg/mL）	IL-6（pg/mL）	IL-12p70（pg/mL）	TNF-α（pg/mL）	MCP-1（pg/mL）
对照组	6	170±30	18.8±2.5	52±10	239±30	164±22	81±11	42±7
实验组	6	173±24	19.1±2.5	70±12	248±29	155±19	89±15	44±6
t值	—	–0.144	–0.260	–2.778	–0.473	0.782	–1.109	–0.281
P值	—	>0.05	>0.05	<0.05	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05

“—”：无相关数据.AST：天冬氨酸转氨酶；ALT：丙氨酸转氨酶；IFN：干扰素；IL：白介素；TNF：肿瘤坏死因子；MCP：单核细胞趋化蛋白.

2.3孕期混合化学物质暴露对妊娠结局及子鼠肝功能的影响

统计实验2新生小鼠的数量，并观察从出生至1周龄期间每窝新生小鼠是否有死亡。结果显示，实验组与对照组平均每窝新生小鼠数量差异无统计学意义（ P>0.05），各窝别的新生小鼠均未发生死亡；实验组与对照组新生小鼠的身长和体重差异均无统计学意义（均 P>0.05），见 表3。

表 3 实验组与对照组新生小鼠一般情况比较

Table 3 Comparison of pregnancy outcomes between two groups

（ $\overline{\text{x}}\pm s$ ）

组 别	n	每窝只数	身长（cm）	体重（g）
对照组	6	7.00±0.89	3.05±0.09	1.46±0.09
实验组	6	7.17±1.17	3.03±0.14	1.47±0.08
t值	—	–0.277	0.215	–0.178
P值	—	>0.05	>0.05	>0.05

“—”：无相关数据.

对子鼠肝功能代表性指标血清AST和ALT水平的组间差异进行双因素方差分析，结果显示孕期混合化学物质暴露处理因素及性别因素的主效应均不显著（均 P>0.05），两者之间也不存在显著的交互效应（ P>0.05），见 表4。

表 4 实验组与对照组子鼠血清肝功能指标比较

Table 4 Comparison of offspring liver function between two groups

（ $\overline{\text{x}}\pm s$ ，U/L）

组 别	性别	n	天冬氨酸转氨酶	丙氨酸转氨酶
对照组	雄性	6	186±24	22.9±2.8
雌性	6	190±29	23.6±3.0
实验组	雄性	6	187±27	22.7±2.7
雌性	6	189±22	23.1±2.6

结果提示，孕期混合化学物质暴露不影响妊娠结局及子鼠的肝功能。

2.4孕期混合化学物质暴露对子鼠血清、前额皮质和海马组织中细胞因子水平的影响

分娩当天子鼠血清各细胞因子水平双因素方差分析结果显示，孕期混合化学物质暴露在IFN-γ水平上主效应显著（ P<0.01），性别因素的主效应不显著（ P>0.05），交互效应不显著（ P>0.05）。Bonferroni法事后多重比较结果显示，实验组雄、雌性子鼠新生期血清IFN-γ水平均升高（均 P<0.05）。血清IL-6、IL-12p70、TNF-α和MCP-1水平分析结果显示，孕期混合化学物质暴露和性别这两种因素的主效应与交互效应均无统计学意义（均 P>0.05）。见 表5。

表 5 实验组与对照组子鼠血清细胞因子水平比较

Table 5 Comparison of serum levels of cytokines in offsprings between two groups

（ $\overline{\text{x}}\pm s$ ，pg/mL）

组 别	性别	n	IFN-γ	IL-6	IL-12p70	TNF-α	MCP-1
对照组	雄性	6	40.30±7.17	14.70±2.26	31.50±9.91	63.51±7.40	20.41±2.77
雌性	6	40.89±6.68	15.41±2.88	36.27±7.38	67.33±9.96	18.08±2.23
实验组	雄性	6	52.19±6.54 *	15.06±1.50	32.96±10.93	69.01±9.98	18.91±2.99
雌性	6	52.44±10.17 *	15.04±1.85	30.58±9.76	67.05±12.40	18.32±3.46
F 1值	—	—	13.609	0.000	0.291	0.400	0.285
P 1值	—	—	<0.01	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05
F 2值	—	—	0.017	0.153	0.093	0.051	1.524
P 2值	—	—	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05
F 3值	—	—	0.003	0.179	0.835	0.491	0.541
P 3值	—	—	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05

“—”：无相关数据.与对照组相同性别比较， ^* P<0.05. F ₁、 P ₁为孕期混合化学物质暴露主效应的检验结果； F ₂、 P ₂为性别主效应的检验结果； F ₃、 P ₃为孕期混合化学物质暴露与性别交互效应的检验结果.IFN：干扰素；IL：白介素；TNF：肿瘤坏死因子；MCP:单核细胞趋化蛋白.

分娩当天子鼠前额皮质中的各细胞因子水平双因素方差分析结果显示，孕期混合化学物质暴露在IFN-γ、IL-6和TNF-α水平上主效应显著（均 P<0.01），性别因素的主效应对各细胞因子的水平均不显著（均 P>0.05），孕期混合化学物质暴露和性别的交互效应对各细胞因子水平均不显著（均 P>0.05）。Bonferroni法事后多重比较结果显示，实验组雄、雌性新生期前额皮质中IFN-γ、IL-6、TNF-α水平均升高（均 P<0.05）。IL-12p70与MCP-1的分析结果显示，孕期混合化学物质暴露和性别这两种因素的主效应与交互效应均无统计学意义（均 P>0.05）。见 表6。

表 6 实验组与对照组子鼠前额皮质细胞因子水平比较

Table 6 Comparison of cytokines levels in prefrontal cortex of offsprings between two groups

（ $\overline{\text{x}}\pm s$ ，pg/mL）

组 别	性别	n	IFN-γ	IL-6	IL-12p70	TNF-α	MCP-1
对照组	雄性	6	5.59±0.98	5.53±0.82	7.24±1.66	1.99±0.44	17.27±2.62
雌性	6	5.96±0.75	5.61±1.19	7.40±1.41	1.92±0.47	17.02±2.39
实验组	雄性	6	7.34±1.04 **	7.04±1.48 *	7.81±1.27	2.87±0.40 **	17.37±2.25
雌性	6	7.41±1.16 *	7.17±1.31 *	7.12±1.64	2.63±0.57 **	17.20±2.05
F 1值	—	—	15.476	9.490	0.055	16.712	0.021
P 1值	—	—	<0.01	<0.01	>0.05	<0.01	>0.05
F 2值	—	—	0.295	0.044	0.189	0.643	0.048
P 2值	—	—	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05
F 3值	—	—	0.147	0.003	0.469	0.173	0.002
P 3值	—	—	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05

“—”：无相关数据.与对照组相同性别比较， ^* P<0.05， ^** P<0.01. F ₁、 P ₁为孕期混合化学物质暴露主效应的检验结果； F ₂、 P ₂为性别主效应的检验结果； F ₃、 P ₃为孕期混合化学物质暴露与性别交互效应的检验结果.IFN：干扰素;IL：白介素；TNF：肿瘤坏死因子；MCP：单核细胞趋化蛋白.

分娩当天子鼠海马中的各细胞因子水平双因素方差分析结果显示，孕期混合化学物质暴露在IFN-γ的水平上主效应显著（ P<0.01），性别因素的主效应不显著（ P>0.05），交互效应不显著（ P>0.05）。Bonferroni法事后多重比较结果显示，实验组雄、雌性新生期海马中IFN-γ水平均升高（均 P<0.05）。海马中IL-6、IL-12p70、TNF-α和MCP-1水平分析结果显示，孕期混合化学物质暴露和性别这两种因素的主效应与交互效应均无统计学意义（均 P>0.05）。见 表7。

表 7 实验组与对照组子鼠海马组织细胞因子水平比较

Table 7 Comparison of cytokines levels in hippocampus of offsprings between two groups

（ $\overline{\text{x}}\pm s$ ，pg/mL）

组别	性别	n	IFN-γ	IL-6	IL-12p70	TNF-α	MCP-1
对照组	雄性	6	9.65±2.05	5.40±1.17	18.99±3.00	1.91±0.26	22.82±3.32
雌性	6	10.65±2.13	5.63±1.47	18.50±2.90	1.98±0.40	23.80±5.13
实验组	雄性	6	13.75±3.05 *	5.55±0.92	17.54±3.97	1.95±0.29	23.76±3.71
雌性	6	14.71±2.85 *	5.81±1.51	17.39±3.39	1.88±0.38	22.43±5.27
F 1值	—	—	14.920	0.094	0.872	0.039	0.014
P 1值	—	—	<0.01	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05
F 2值	—	—	0.864	0.215	0.054	0.000	0.009
P 2值	—	—	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05
F 3值	—	—	0.000	0.001	0.016	0.295	0.402
P 3值	—	—	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05

“—”：无相关数据.与对照组相同性别比较， ^* P<0.05. F ₁、 P ₁为孕期混合化学物质暴露主效应的检验结果； F ₂、 P ₂为性别主效应的检验结果； F ₃、 P ₃为孕期混合化学物质暴露与性别交互效应的检验结果.IFN：干扰素；IL：白介素；TNF：肿瘤坏死因子；MCP：单核细胞趋化蛋白.

实验组子鼠血清IFN-γ水平与母鼠血清IFN-γ水平和子鼠脑内有显著性改变的细胞因子水平的相关性分析结果显示，子鼠血清IFN-γ水平与前额皮质中IFN-γ、IL-6、TNF-α及海马中IFN-γ水平呈正相关（ 图1）。

图 1 .

实验组子鼠血清IFN-γ水平与母鼠血清IFN-γ水平和子鼠脑内有显著性改变的细胞因子水平的相关性分析结果（ n=12）A：子鼠血清IFN-γ水平与母鼠血清IFN-γ水平无显著相关性；B~E：子鼠血清IFN-γ水平与前额皮质IFN-γ水平（B）、IL-6水平（C）、TNF-α水平（D）以及海马IFN-γ水平（E）成正相关.IFN：干扰素；IL：白介素；TNF：肿瘤坏死因子.

上述结果提示，孕期混合化学物质暴露对新生小鼠血清IFN-γ水平，前额皮质中IFN-γ、IL-6和TNF-α水平，以及海马中IFN-γ水平均有影响。

2.5孕期混合化学物质暴露对子鼠情绪相关的行为学试验结果的影响

三箱社交试验关于自闭样行为两个指标的统计分析表明，孕期混合化学物质暴露与性别均具有显著主效应（ P<0.05或 P<0.01），但两者不具有交互效应（均 P>0.05）。Bonferroni法事后多重比较结果显示，与对照组比较，实验组雄、雌性嗅陌生小鼠时间和嗅新小鼠时间均减少（ P<0.05或 P<0.01），见 表8。

表 8 实验组与对照组子鼠行为学试验结果比较

Table 8 Results of behavioral tests in offsprings between two groups

（ $\overline{\text{x}}\pm s$ ）

组别	性别	n	嗅陌生小鼠时间（s）	嗅新小鼠时间（s）	中央区停留时间（s）	进入中央区次数	漂浮不动时间（s）	不动时间（s）
对照组	雄性	6	162±31	173±34	54±20	15±4	114±17	144±20
雌性	6	188±28	203±24	72±14 #	22±4 ##	143±20 #	174±20 #
实验组	雄性	6	103±32 **	110±36 **	31±12 *	9±3 *	198±22 **	234±20 **
雌性	6	140±24 *#	154±25 *#	51±13 *#	14±3 **#	176±17 **	205±21 *#
F 1值	—	—	20.178	21.170	12.101	23.982	56.260	54.314
P 1值	—	—	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01	<0.01
F 2值	—	—	6.953	9.139	9.574	16.809	0.186	0.001
P 2值	—	—	<0.05	<0.01	<0.01	<0.01	>0.05	>0.05
F 3值	—	—	0.225	0.337	0.011	1.297	10.616	13.063
P 3值	—	—	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05	<0.01	<0.01

“—”：无相关数据.与对照组相同性别小鼠比较， ^* P<0.05， ^** P<0.01.与同一组别的不同性别小鼠比较， ^# P<0.05， ^## P <0.01. F ₁、 P ₁为孕期混合化学物质暴露主效应的检验结果； F ₂、 P ₂为性别主效应的检验结果； F ₃、 P ₃为孕期混合化学物质暴露与性别交互效应的检验结果.

旷场试验结果显示，孕期混合化学物质暴露与性别均具有显著的主效应（均 P<0.01），但两者不具有交互效应（均 P>0.05）。Bonferroni法事后多重比较结果显示，与对照组比较，实验组雄、雌性进入中央区的时间和进入中央区的次数均减少（ P<0.05或 P<0.01），见 表8。

强迫游泳试验结果显示，孕期混合化学物质暴露主效应显著（ P<0.01），性别因素的主效应不显著（ P>0.05），且两者具有显著交互效应（ P<0.01）。Bonferroni法事后多重比较结果显示，与对照组比较，实验组雄、雌性的漂浮不动时间均增加（均 P<0.01）。在对照组，雄性漂浮不动时间短于雌性（ P<0.05），而实验组雄性漂浮不动时间与雌性差异无统计学意义（ P>0.05），见 表8。

悬尾试验结果显示，孕期混合化学物质暴露存在显著的主效应（ P<0.01），性别因素的主效应不显著（ P>0.05），且两者具有显著交互效应（ P<0.01）。Bonferroni法事后多重比较结果显示，与对照组比较，无论是雄性还是雌性，实验组不动时间均增加（ P<0.05或 P<0.01）。在对照组，雄性不动时间短于雌性（ P<0.05），而实验组雄性不动时间较雌性增加（ P<0.05），见 表8。

上述结果提示，实验组的子鼠在成年期表现出显著的自闭症样情绪相关行为异常，且在雄性更为明显。

3讨论

孕妇在日常饮食中存在多种农药和食品添加剂成分在安全标准内的混合暴露情形，但这种暴露是否对母代/子代的健康造成损害尚未证实。本研究采用小鼠模型，证实了孕期混合化学物质暴露对子代健康状态的影响，这一发现将增进人们对孕期日常饮食中健康风险因素的认识，为进一步探究人类孕期类似暴露事件的潜在损害提供实验依据。

本实验选择自由饮水而非灌胃的方式进行混合化学物质暴露，原因如下 ^[11] ：①在自主饮食的饲养条件下，各实验动物不会同时进行摄食活动；灌胃操作本身未考虑动物进食情况，虽然灌胃给药的剂量对操作者来说更容易精准地控制，但是每只动物胃内容物含量在灌胃时很难保持较为接近的水平，从而导致化学物质灌胃之后的吸收和代谢曲线具有较大的个体差异；②对于长期慢性暴露而言，通过自由饮水途径进行的暴露对生理性消化吸收活动干扰最小，对每天各个时段的血液内化学物质及代谢物浓度的波动幅度比每天一次定时灌胃的脉冲式暴露要小，这种暴露对机体的影响更具有持续性，也更接近人类经自由饮食活动摄入的暴露模式；③灌胃操作为非自然地牵拉食管、膨胀胃壁，会引起强烈的胃痉挛反应和极度的厌恶情绪，孕期进行灌胃操作时应激伤害更严重；④对孕期尤其是孕晚期小鼠进行抓取操作有干扰发育甚至造成死胎的风险。这些因素都可能影响实验结果的准确性，后两方面也有违维护动物福利的伦理学原则。

孕期风险因素暴露研究通常会评估风险因素对妊娠相关健康事件的影响 ^{[ 3- 5]} ，代表性指标有孕期实验动物的体重、分娩后实验动物的卵巢/子宫质量、新生小鼠只数、平均身长和平均体重。有研究报道孕期小鼠暴露于单一化学毒物（如三唑酮、甲基对硫磷、乐果）时，如果暴露剂量超过安全范围，就会导致母代生殖系统损害和不良妊娠结局 ^{[ 3- 5]} 。本文资料显示，上述结果在实验组均未发生。推测母鼠孕期安全范围内的混合化学物质暴露可能不会对母代生殖系统和妊娠结局有明显影响。

肝脏是体内生化代谢及环境毒素摄入后进行代谢的核心器官。研究证实，普通成年大鼠混合化学物质暴露可导致肝功能损害 ^[6] 。毒理学研究也证实，过量的化学毒物摄入可能会造成肝脏损害 ^{[ 12- 14]} ，如在普通成年大鼠，高于安全剂量的双酚 A暴露可产生肝脏毒性作用 ^[12] 。根据这一观点，推测本研究所采用的孕期混合化学物质暴露也有可能造成母鼠或子鼠肝功能损害。因此，本研究检测了母鼠和子鼠的血清AST和ALT水平 ^{[ 6， 15]} 。结果显示，血清AST和ALT水平未发生显著变化。推测母鼠孕期安全范围内的混合化学物质暴露可能不会对自身及其子代的肝脏功能产生明显损害。

研究报道，混合化学物质暴露会升高普通成年大鼠血液中促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-α含量 ^[6] 。本文资料显示，孕期混合化学物质暴露不仅增加了母鼠血清中IFN-γ水平，而且增加了新生小鼠血清、前额皮质及海马中IFN-γ的水平。此外，实验组子鼠脑组织TNF-α和IL-6水平也呈升高趋势。本研究结果与普通成年大鼠混合化学物质暴露的文献结果类似 ^[6] ，均表明混合化学物质暴露可诱发炎症状态，提示混合化学物质暴露可能通过诱导母体炎症状态进而导致子代循环血和特定脑区组织的炎症状态。为了探究实验组母代炎症与子代炎症之间的关联，本研究对母代和子代血清中唯一发生显著改变的促炎因子IFN-γ的含量在母代和子代之间进行相关性分析，发现两者之间不存在显著相关关系。这一结果可能与促炎细胞因子无法穿透健康的胎盘屏障有关 ^[16] 。如果子代血清中的IFN-γ并非由母代血清中IFN-γ直接跨胎盘屏障而来，那么子代血清内IFN-γ升高的原因就值得思考。研究发现，孕期混合化学物质暴露处理所用的某些化学物质或代谢产物可能通过胎盘屏障 ^[17] ，提示这些化学物质或代谢产物有可能在胎盘的胎儿面或胎儿体内诱发细胞因子的释放。这为解释本研究中母鼠和子鼠血清IFN-γ水平无显著相关性的结果提供了依据。当然，母鼠与子鼠之间所受影响的关联可能具有更复杂的机制，有待更多的研究去探明。生命早期促炎因子高表达可能造成脑发育和行为的损害，尤其是自闭症相关行为 ^{[ 18- 20]} 。本研究在发现实验组子鼠情绪相关脑区 ^{[ 21- 23]} 内促炎因子高表达之后，进一步探索孕期混合化学物质暴露对子鼠成年期行为学的可能影响。结果发现，孕期混合化学物质暴露可导致子鼠自闭症样行为，这一发现提示孕期混合化学物质暴露有可能是子代发生自闭症的风险因素。

尽管有研究报道不同性别的个体在免疫反应方面存在显著差异，但多数研究认为，即便经受新生期脂多糖处理所诱发的强烈免疫激活状态，小鼠在青春期前的促炎细胞因子水平在性别间仍相似 ^{[ 24- 25]} 。本文资料显示，孕期混合化学物质暴露诱导的子鼠血液和脑的细胞因子水平改变不存在性别差异，这与多数已有研究相符。而成年期行为学表型呈现性别差异这一生理性现象已被先前的研究证实 ^{[ 6- 7]} 。有趣的是，本研究三箱社交试验和旷场试验结果表明性别因素与混合化学物质暴露因素不发生交互作用，而其余行为学检测结果表明两者发生显著的交互作用。此外，对照组行为学表型存在性别差异，与已有报道一致 ^{[ 26- 28]} 。实验组雄性子鼠行为学表现的负性变化幅度均大于雌性子鼠，提示雄性子鼠对孕期混合化学物质暴露所诱发的长期不良影响更敏感。

综上所述，模拟人类日常饮食中的孕期混合化学物质暴露模式可引起母鼠和子鼠炎症相关改变，并导致子鼠显著的自闭症样行为表型。这一研究加深了日常食物中人工化学物质对健康潜在危害的认识。尽管每种化学物质都有相应的每日可接受摄入量 ^[6] ，但如果孕期联合暴露于多种化学物质，即便是每一种化学物质的暴露剂量都符合安全剂量标准，仍有诱发子代发育异常的风险。但鉴于研究中涉及的13种化学物质在健康人群血液中的检出率并不高 ^{[ 29- 33]} ，说明每日可接受摄入量的日常暴露不会导致这些化学物质在人体内发生高水平暴露或堆积，遂本研究未进一步检测各化学物质在实验动物血液中的水平。

COMPETING INTERESTS

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

国家自然科学基金（31600836）；广东药科大学重点学科人才配套经费项目（51355093）