母婴分离诱导子代抑郁大鼠肠道氨基酸代谢失调

Abstract

Objective:

To investigate the intestinal amino acids pathway in depression-like offspring rats induced by maternal separation.

Methods:

Sprague-Dawley (SD) female rats were randomly divided into a control group ( n=8) and a maternal separation group ( n=8). After normal delivery, the maternal rats were separated from offsprings for 14 consecutive days and 3 h per day in maternal separation group; while rats in the control group was received no interventions in postpartum. Depression-like behaviors of offspring rats were evaluated using the sucrose preference test, novelty suppressed feeding test, and forced swimming test. Amino acid analyzer was used to detect the changes of amino acid contents in the small intestine, and the expressions of alanine-serine-cysteine transporter 2 (ASCT2), solute carrier superfamily 6 member 19 (B ⁰AT1) and L-type amino acid transporter 1(LAT1) were detected by Western blot.

Results:

The weight of the offspring rats in the maternal separation group was significantly lower than that of the control group at 21 and 28 d ( t=4.925 and 5.766, all P<0.01). Compared with the control group, the percentage of sucrose preference of the offspring rats in the maternal separation group was significantly reduced ( t=2.709, P<0.05), and the feeding latency was significantly prolonged ( t=–13.431, P<0.01). The immobility time in FST of maternal separation group was significantly longer ( t=–3.616, P<0.01).Increased concentration of aspartic acid ( t=–6.672, P<0.01) and down-regulation of glutamine ( t=3.107, P<0.01) and glycine ( t=9.781, P<0.01) were observed in maternal separation group. Western blot analysis revealed that the protein expressions of ASCT2 ( t=6.734, P<0.01) and B ⁰AT1 ( t=9.015, P<0.01) in maternal separation group were reduced, while the expression of LAT1 was increased ( t=–8.942, P<0.01).

Conclusion:

Maternal separation can induce the depression-like behavior in offspring rats; the amino acid contents and the amino acid transporter expression in the small intestine are reduced, which may be related to depression-like behavior induced by maternal separation.

丙氨酸–丝氨酸–半胱氨酸转运蛋白（alanine-serine-cysteine transporter，ASCT）;溶质载体超家族6成员19（solute carrier superfamily 6 member 19，SLC6A19，BAT1）;L 型氨基酸转运蛋白（L-type amino acid transporter，LAT）;放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）;聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）;N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）;

抑郁症是全球最常见的精神疾病之一，具有易反复发作、发病率高等特点 ^[1] 。据世界卫生组织预测，到 2030 年抑郁症将变成全球首要的致残疾病 ^[2] 。关于抑郁症的研究，以往更多聚焦在中枢神经系统，而 Gianaros 等 ^[3] 研究认为抑郁症不只是单纯的脑功能受损，更可能出现全身性临床表现，如体重下降、消化紊乱及易疲劳等 ^[4] 。因此，外周系统功能紊乱可能成为探索抑郁症发病的一个途径。有研究发现，慢性不可预知性温和刺激模型诱导的抑郁大鼠小肠中氨基酸代谢紊乱，其中谷氨酰胺和甘氨酸的浓度降低，天冬氨酸浓度升高，同时中性氨基酸转运蛋白ASCT2、LAT1和B ⁰AT1也发生了变化 ^[5] 。Rhee等 ^[6] 在2009 年首次提出肠–脑轴，认为肠道和大脑存在复杂的相互作用，大脑的情感中心与肠道功能关联，抑郁症和胃肠疾病可能有较高的共发率 ^[7] 。早期生活应激事件（如母爱剥夺、父母离异或忽视等）可使成年后生命个体精神类疾病的发病率增加，如抑郁、焦虑、认知功能障碍等 ^{[ 8- 9]} 。经历过早年虐待的人群产生抑郁的比例高达67% ^[10] 。因此，探讨子代抑郁行为的发生意义重大。本研究通过母婴分离建立子鼠抑郁模型，观察子鼠的体重及行为学的变化，检测子鼠小肠组织中氨基酸浓度及相关中性氨基酸转运蛋白的改变，进一步阐明母婴分离诱导的子代抑郁样行为与肠道氨基酸功能的关系，从而为母婴分离诱导子代抑郁的干预提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验动物和材料

SD 健康雌性大鼠（240~260 g）20只由西安交通大学医学院动物中心提供。动物福利和所有实验方案均按照我国《实验动物管理条例》进行。磺基水杨酸为上海邦景实业有限公司产品； L-8900型高速全自动氨基酸分析仪为日本日立高新技术公司产品；RIPA 裂解液为康为世纪公司产品；5×上样缓冲液为西安晶彩生物科技有限公司产品；制胶试剂盒为上海索莱宝生物科技有限 公司产品；化学发光试剂盒为美国 Millipore 公司产品；ASCT2 抗体、LAT1 抗体和 B ⁰AT1 抗体为美国 Abcam 公司产品；β-actin 抗体为陕西先锋生物科技有限公司产品。

1.2建立子鼠抑郁模型

通过母婴早期分离诱导子鼠抑郁 ^[11] 。将母鼠随机分为对照组和母婴分离组各 8 只，受孕后单笼喂养。子鼠出生当天为第 0 天，母婴分离组分别于第 1~14 天进行母鼠与子鼠分离，每天将子鼠移至孵育箱分离3 h，连续14 d。对照组不进行任何干预。实验期间正常喂养，自由饮食饮水。从子鼠出生至实验结束，每周测定子鼠的体重。

1.3子鼠行为学实验

1.3.1糖水偏好实验测量子鼠的快感缺乏行为

给予子鼠 1%蔗糖溶液和自来水，适应24 h。第 2 天，在实验前子鼠禁食禁水3 h，向每笼大鼠提供 1 瓶 1%蔗糖溶液和 1 瓶自来水（体积相近），1 h后称量并记录蔗糖和自来水的消耗量。将蔗糖和自来水对调位置，1 h后称量并记录其各自的消耗量。糖水偏好百分比（%）=蔗糖溶液消耗量/（自来水消耗量+蔗糖溶液消耗量）×100%。

1.3.2新奇抑制摄食实验评估子鼠的行为紧张度

将子鼠放入 42 cm × 31 cm × 20 cm 的实验箱中。在箱子中央的白纸上放一粒鼠粮，将禁食24 h的子鼠单独放于箱子的角落。记录子鼠第一次吃到鼠粮的时间（即摄食潜伏期），记录时间为5 min。

1.3.3强迫游泳实验测量子鼠的绝望状态

新奇抑制摄食实验结束后，将子鼠置于高50 cm、直径20 cm、水深40 cm的圆柱形塑料桶中，水温为24 ℃左右。摄像机拍摄6 min，记录后4 min内子鼠在水中的不动时间。

1.4高速全自动氨基酸分析仪检测子鼠小肠组织中 20 种氨基酸浓度

行为学实验结束后，在子鼠腹腔注射20%氨基甲酸乙酯（1~2 mL/100 g）进行麻醉，解剖收集远端小肠组织，于–80 ℃冰箱保存备用。精确称量一段远端小肠组织，加入10倍量的等渗氯化钠溶液充分匀浆，吸取匀浆液，按体积比1∶1加入5%磺基水杨酸，振荡混匀，离心，汲取上清液，用高速全自动氨基酸分析仪测定其中20 种氨基酸的浓度。

1.5蛋白质印迹法检测小肠组织中 ASCT2、 BAT1、LAT1 蛋白表达

根据 RIPA 裂解液试剂盒说明书提取子鼠小肠蛋白质，定量，然后加入 5×上样缓冲液，煮沸变性3~5 min。根据制胶试剂盒配制聚丙烯酰胺凝胶电泳的 10%凝胶，加样。溴酚蓝指示剂显示距离分离胶底部约2 cm时停止电泳，根据标准带指示进行裁胶，然后转移至 PVDF 膜上，PVDF 膜用脱脂奶粉封闭2 h，与 ASCT2（1∶1000）、B ⁰AT1（1∶500）、LAT1（1∶1000）抗体 4 ℃ 过夜孵育。次日，所有膜清洗后，与辣根过氧化物酶标记的二抗进行孵育。最后用化学发光试剂盒发光显色。用 Quantity One 软件对蛋白条带进行定量，以各条带与内参β-actin 的比值作为蛋白相对表达量。

1.6统计学方法

采用 SPSS 18.0 软件进行统计分析。计量数据采用均数±标准差（ $\overline{x}\pm s$ ）表示，组间比较采用独立样本 t检验， P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1母婴分离对子鼠体重和行为学实验结果的影响

对照组子鼠出生时（第 0 天）平均体重为（5.15±0.44）g，第7、14、21、28天子鼠的体重分别为（16.47±0.85）、（30.04±1.88）、（50.63± 1.85）、（91.63±2.13）g；母婴分离组子鼠出生时（第 0 天）平均体重为（5.01±0.27）g，第 7、14、 21、28天子鼠体重分别为（16.38±0.63）、（28.62±2.22）、（46.12±1.81）、（84.87±2.53）g，其中第21和28天体重较对照组减轻（ t=4.925和5.766，均 P<0.01）。结果提示，母婴分离导致子鼠体重减轻、生长缓慢。

糖水偏好实验结果显示，对照组子鼠糖水偏好百分比为（70.37±11.27）%，而母婴分离组为（54.88±11.61）%，差异有统计学意义（ t=2.709， P<0.05）。新奇抑制摄食实验中，对照组子鼠摄食潜伏期为（98.62±11.88）s，而母婴分离组摄食潜伏期为（188.13±14.63）s，两者差异有统计学意义（ t=–13.431， P<0.01）。强迫游泳实验中，对照组子鼠不动时间为（136.88±19.07）s，而母婴分离组为（181.25±29.00）s，两者差异有统计学意义（ t=–3.616， P<0.01）。结果提示，母婴分离诱导子鼠产生抑郁样行为。

2.2母婴分离对子鼠小肠中20种氨基酸浓度的影响

与对照组比较，母婴分离组子鼠小肠中天冬氨酸浓度增加（ P<0.01），谷氨酰胺和甘氨酸浓度减小（均 P<0.01），见 表 1。结果提示，母婴分离导致子鼠小肠中氨基酸浓度改变。

表 1 母婴分离对子鼠小肠中氨基酸浓度的影响

Table 1 Effect of maternal separation on the concentration of amino acids in the small intestine of offspring rats

（ $\overline{x}\pm s$ ，ng/mg）

组别	n	天冬氨酸	谷氨酸	天冬酰胺	丝氨酸	谷氨酰胺	苏氨酸	精氨酸
母婴分离组	8	129±13	107±18	365±14	522±22	138±18	480±31	1470±227
对照组	8	81±16	120±8	379±16	545±32	179±32	508±21	1676±162
t值	—	−6.672	1.848	1.843	1.675	3.107	2.081	2.095
P值	—	<0.01	>0.05	>0.05	>0.05	<0.01	>0.05	>0.05
组别	n	丙氨酸	脯氨酸	甘氨酸	缬氨酸	蛋氨酸	异亮氨酸	亮氨酸
母婴分离组	8	841±18	3525±246	270±21	632±36	213±23	403±39	804±24
对照组	8	865±28	3470±271	376±22	663±24	231±16	436±31	785±17
t值	—	2.018	−0.425	9.781	2.024	1.797	1.837	−1.805
P值	—	>0.05	>0.05	<0.01	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05
组别	n	苯丙氨酸	赖氨酸	组氨酸	酪氨酸	色氨酸	半胱氨酸
母婴分离组	8	432±34	161±9	30.6±2.8	51.9±2.4	51±4	147±6
对照组	8	459±20	155±9	33.9±3.3	54.8±3.7	47±4	142±5
t值	—	1.952	−1.305	2.125	1.901	−2.066	−2.001
P值	—	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05	>0.05

“—”：无相关数据.

2.3母婴分离对子鼠小肠中氨基酸转运蛋白表达的影响

对照组 ASCT2、B ⁰AT1、LAT1 蛋白相对表达水平分别为 1.11±0.20、1.17±0.13、0.29± 0.09。而母婴分离组 ASCT2、B ⁰AT1 蛋白相对表达水平分别为 0.60±0.08、0.69±0.08，较对照组减少（ t = 6.734 、 9.015，均 P<0.01）；LAT1蛋白相对表达水平为0.82±0.14，较对照组增加（ t= –8.942， P<0.01），见 图 1。结果提示，母婴分离可改变子鼠小肠中氨基酸转运蛋白的表达。

图 1 .

子代大鼠小肠中 ASCT2、LAT1、B ⁰AT1 蛋白表达电泳图ASCT2：丙氨酸–丝氨酸–半胱氨酸转运蛋白 2；BAT1：溶质载体超家族6成员19；LAT1：L 型氨基酸转运蛋白 1.

3讨论

抑郁症是目前较常见的情绪综合障碍的体现，临床以情绪低落、行为迟缓、意志力减退、食欲低下、体重下降等为典型症状。早期的不良经历会影响后期的行为、认知等发育过程，也使生长发育较同年龄段缓慢。本研究采用经典的母婴分离模型，模拟生命早期生活压力下幼儿的成长发育环境。动物模型研究结果显示，经历长期母婴分离应激可使大鼠的体重生长发育落后于同龄大鼠 ^{[ 16- 17]} 。然而，也有研究表明，子鼠出生后前两周经历母婴分离可能不会影响其体重 ^[18] ，但青春期母婴分离会刺激其中脑边缘多巴胺功能发生紊乱，对食物产生快感缺乏，引起体重减轻 ^[19] 。这可能与动物的种类、食物刺激等因素有关。本文资料显示，经历母婴分离应激可使子鼠的体重较同期子鼠减轻、糖水偏好百分比减小、快感缺失。新奇摄食抑制实验用于评估大鼠在新环境中的主动摄食及行为紧张度，抑郁会延长摄食潜伏期，母婴分离子鼠摄食潜伏期延长。强迫游泳实验中，母婴分离子鼠不动时间延长，表现出抑郁状态下的绝望行为。上述结果表明母婴分离诱导 1 月龄子鼠产生抑郁样行为。

抑郁是全身代谢紊乱的疾病 ^[20] ，以往研究多关注中枢神经系统的氨基酸代谢紊乱 ^[21] ，而氨基酸的主要来源和吸收的主要部位是小肠 ^[22] 。ASCT2、LAT1、B ⁰AT1 参与小肠谷氨酰胺和甘氨酸的摄取转运过程。B ⁰AT1 和 ASCT2可吸收饮食中的谷氨酰胺 ^[23] ，有研究发现小鼠小肠中缺失B ⁰AT1 可清除谷氨酰胺钠的依赖性摄取，同时可减少近 50%葡萄糖的摄入，体重也有所下降 ^[24] 。本研究中，母婴分离后子鼠体重的降低很可能与 B ⁰AT1 的低表达有关。ASCT2 的表达常见于肠上皮细胞 ^[25] ，可介导谷氨酰胺的交换摄取过程 ^[26] 。LAT1 可置换膜表面的部分氨基酸，如谷氨酰胺 ^[27] 。母婴分离的子鼠 LAT1 表达升高，可能会降低小肠对谷氨酰胺的摄取。甘氨酸由B ⁰AT1在肠黏膜上皮细胞中转运，通过 ASCT2 在空肠中介导甘氨酸由顶端膜进入 ^[28] 。有研究结果显示，在慢性不可预知性温和应激大鼠抑郁模型中，大鼠海马组织的甘氨酸水平降低，尿液中损失增加，可能缘于其小肠吸收减少 ^[5] 。本研究发现了小肠中天冬氨酸浓度增加，但未进一步证明其转运通路的变化过程。有研究发现天冬氨酸是一种介导肠神经调节的调节剂，可能通过 NMDA 受体的激活来调节肠道功能 ^[29] 。因此推测，天冬氨酸可能通过 NMDA 受体神经信号通路来介导抑郁症的肠道症状。以往的研究大多是围绕慢性不可预知性温和刺激或单纯应激导致的抑郁，研究对象主要是本代大鼠。为了拓宽多种模型下对抑郁状态全身氨基酸代谢的认识，本研究设计母婴分离模型诱导子鼠产生抑郁，探索母婴分离诱导对子鼠肠道氨基酸功能的影响。结果显示，母婴分离诱导子鼠小肠中的天冬氨酸浓度升高，谷氨酰胺和甘氨酸浓度降低，进一步检测相应转运蛋白的表达发现ASCT2 和 B ⁰AT1 表达水平降低，而 LAT1 的表达升高。

综上，母婴分离可诱导子鼠产生抑郁行为，同时其小肠氨基酸浓度发生变化，肠道氨基酸转运蛋白表达改变，提示肠道氨基酸功能失调与母婴分离诱导的抑郁样行为可能相关，但其机制有待进一步研究探明。

[编者按]近年来流行病学研究认为早期生活应激事件可使成年后个体精神类疾病的发病率增加，比如抑郁、焦虑、认知功能障碍等。本文采用母婴分离模型研究子代大鼠的抑郁样行为，探讨母婴分离是否导致子代抑郁和焦虑样行为，以及影响小肠内氨基酸浓度及转运功能的变化，从肠-脑轴角度探讨发病机制，有较好的学术意义。研究结果显示小肠天冬氨酸浓度增高，谷氨酰胺和甘氨酸浓度降低，表明肠道氨基酸功能失调可能与抑郁样行为相关；提示今后对子代抑郁的相关氨基酸干预治疗可能是一个研究思路。当然，该研究尚不能明确肠道中性氨基酸转运体ASCT2、B ⁰AT1、LAT1蛋白及氨基酸浓度等在肠-脑轴中的作用机制，下一步可以通过相关蛋白的上调或下调研究，以及探讨与肠道微生态及短链脂肪酸的表达关系等，进一步验证氨基酸转运体在母婴分离导致子代抑郁和焦虑样行为中的肠-脑轴作用机制。

COMPETING INTERESTS

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

西安市科技计划[2019114613YX001SF040（7）]