全自动荧光免疫分析仪在新生儿葡萄糖 -6-磷酸脱氢酶缺乏症筛查中的应用

Abstract

目的：

分析全自动荧光免疫分析仪（GSP分析仪）检测新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症的性能。

方法：

应用GSP分析仪检测国家卫生健康委临床检验中心室间质量评价质控品和G6PD试剂盒（荧光分析法）的低、高质控品，计算准确度和精密度。采用GSP分析仪和半自动荧光免疫分析仪（1420分析仪）同步检测2622例新生儿筛查标本和41例确诊患儿的标本，分析检测结果的相关性和一致性；采用GSP分析仪和1420分析仪检测漂浮和未漂浮标本各78例，比较检测结果差异；采用1420分析仪和GSP分析仪分别检测2017年1月至2018年12月1 100 384名新生儿筛查标本及2019年1月至2020年12月855 856名新生儿筛查标本，比较两种仪器的筛查效能。对目前使用的切值（26 U/dL）的合理性进行评估，并通过百分位数法，以第99.1百分位建立GSP分析仪筛查G6PD缺乏症的新切值。

结果：

GSP分析仪检测5个不同浓度室间质控品的检测值与靶值的相对偏倚为0.71%~4.23%，检测G6PD测定试剂盒质控品的批内精密度为4.34%~4.91%，批间精密度为0.85%~2.12%，总变异系数为5.44%~5.72%，均符合实验要求。GSP分析仪和1420分析仪检测的G6PD活性存在明显的正相关（ r=0.740， P<0.01），均能筛查出41例确诊患儿，筛查的一致性较好（ Kappa=0.945）。1420分析仪检测漂浮干血斑中的G6PD活性明显低于未漂浮干血斑中的G6PD活性（ P<0.05），而GSP分析仪检测漂浮和未漂浮干血斑中的G6PD活性差异无统计学意义（ P>0.05）。GSP分析仪和1420分析仪筛查G6PD缺乏症的敏感度均为100.00%，且特异度均在99.80%以上。与1420分析仪比较，GSP分析仪筛查G6PD缺乏症的阳性预测值、初筛阳性率和诊断率均上升，假阳性率下降（均 P<0.01）。根据人群第99.1百分位建立新切值，男性为26.1 U/dL，女性为29.1 U/dL。

结论：

GSP分析仪检测性能良好，筛查效率高，更有利于疾病的检出，可用于临床新生儿G6PD缺乏症的大规模筛查。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）;6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-phosphogluconate dehydrogenase，6PGD）;

G6PD缺乏症是由G6PD缺乏导致的一种遗传病，在氧化应激、食物或药物等条件下可诱发非免疫性溶血，部分重型患儿可发生新生儿期重度高胆红素血症，造成不可逆脑损伤甚至危及患儿的生命 ^[1] 。G6PD缺乏症及早诊断可避免疾病发作，因此多数国家和地区将该病列入新生儿筛查项目。筛查时常规使用半自动荧光免疫分析仪。但是，因干血斑存在漂浮现象，影响酶活性检测，因此须在检测前手工去除漂浮干血斑，这工作量极大。此外，半自动荧光免疫分析仪还易受环境温度、湿度和操作人员技术等外部因素的干扰。全自动荧光免疫分析仪实现了标本前处理的自动化，可同时检测多个项目，样本通量高达26块96孔板，在新生儿疾病筛查中具有明显的优势。本研究拟通过评估全自动荧光免疫分析仪在G6PD缺乏症筛查中的性能，探索其在新生儿G6PD缺乏症筛查中应用的价值。

1对象与方法

1.1对象

收集2017年1月至2020年12月浙江省新生儿筛查中心1 956 240名新生儿（男性1 029 588名，女性926 652名）的干血斑。1 956 240名新生儿中，8444例为G6PD缺乏症确诊病例。标本采集和检测均经浙江大学医学院附属儿童医院伦理委员会审查（2018-IRB-077），筛查前家长签署知情同意书。

1.2仪器及试剂

半自动荧光免疫分析仪（1420-020，以下简称1420分析仪）、全自动荧光免疫分析仪（2021-0010，以下简称GSP分析仪）、Panthera-Puncher ^TM  9干血斑打孔仪及G6PD测定试剂盒（荧光分析法）均为美国PerkinElmer公司产品；Hiachi 7180型全自动生化分析仪为日本株式会社日立高新技术公司产品；G6PD检测试剂盒（比值法）为广州科方生物技术股份有限公司产品。

1.3标本采集

按照《新生儿疾病筛查技术规范（2010年版）》 ^[2] ，新生儿出生满72 h且充分哺乳6次后采集足跟血3滴，避光室温自然干燥制成干血斑后通过冷链物流递送至浙江省新生儿疾病筛查中心实验室集中检测。

1.4筛查方法

2017年1月至2018年12月采用1420分析仪检测（1 100 384份新生儿标本），切值为2.6 U/gHb。2019年1月至2020年12月采用GSP分析仪检测（855 856份新生儿标本），切值为26 U/dL。G6PD和6PGD采用全自动生化分析仪检测，比值低于1.10为阳性。

1.5G6PD缺乏症诊断标准

初筛阳性且复查满足以下任意1条即可诊断G6PD缺乏症 ^[3] ：①G6PD活性仍然下降，G6PD/6PGD<1.10，和/或 G6PD基因男性半合子、女性复合杂合/纯合或女性杂合致病性突变；②G6PD活性持续下降，和/或 G6PD基因男性半合子、女性复合杂合/纯合或女性杂合致病性突变。

1.6GSP分析仪检测性能验证

1.6.1准确度

参考美国临床和实验室标准协会EP15-A2文件 ^[4] ，采用GSP分析仪测定国家卫生健康委临床检验中心室间质量评价质控品，计算各浓度水平质控品的检测平均值与靶值的偏倚，室间质控可接受水平为相对偏倚绝对值不超过30%。

1.6.2精密度

参考美国临床和实验室标准协会EP05-A2文件 ^[5] ，采用GSP分析仪对G6PD测定试剂盒（荧光分析法）低、高浓度质控品进行精密度检测，每天对低、高浓度质控品重复检测3次，连续检测5 d，汇总检测值，计算批内精密度、批间精密度和总变异系数，若三者均比厂家声明的参考值小则认为符合实验要求。

1.6.3与1420分析仪检测结果的相关性和一致性

选取2018年12月的新生儿筛查标本（2622份）及确诊标本（41份），分别用GSP分析仪和1420分析仪检测，比较检测结果的相关性及筛查结果的一致性。

1.7筛查效能评价

1.7.1漂浮和未漂浮干血斑检测的准确度

从筛查标本中挑选漂浮、未漂浮标本各78份，分别用GSP分析仪和1420分析仪检测G6PD活性。

1.7.2筛查效率

比较GSP分析仪和1420分析仪对G6PD缺乏症的初筛阳性率、诊断率、假阳性率、阳性预测值、敏感度和特异度等指标。

1.8GSP分析仪检测切值评估

参考《关于临床实验室如何确定和建立生物参考区间的标准与指南》（CLSI-C28-A2:2000）中的方法对85万名新生儿筛查标本G6PD活性进行百分位法分析，结合《新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症筛查与诊断实验室检测技术专家共识》，对目前使用的切值（26 U/dL）的合理性进行评估，采用第99.1百分位建立GSP分析仪筛查G6PD缺乏症的新切值 ^{[ 6- 7]} 。

1.9统计学方法

采用R语言和SPSS 24.0软件进行统计学分析。计量资料服从正态分布用均数±标准差（ $\overline{x}\pm s$ ）表示，组间比较采用两独立样本 t检验；计数资料采用例数或百分比表示，组间比较采用 χ ²检验。GSP分析仪和1420分析仪检测结果的相关性采用Pearson线性相关性分析，筛查结果的一致性采用 Kappa分析。 P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1GSP分析仪的检测性能

GSP分析仪检测5个不同浓度室间质控品的检测值与靶值的相对偏倚为0.71%~4.23%，检测G6PD测定试剂盒质控品的批内精密度为4.34%~4.91%，批间精密度为0.85%~2.12%，总变异系数为5.44%~5.72%。结果提示，GSP分析仪检测的准确度和精密度均符合检测要求。

2.2GSP分析仪和1420分析仪检测结果的相关性和一致性

用GSP分析仪与1420分析仪检测得到的G6PD活性呈明显正相关（ r=0.740， P<0.01），两种方法均能全部筛查出41例确诊患儿，筛查的一致性较好（ Kappa=0.945），见 表1。

表 1 GSP分析仪与1420分析仪筛查G6PD缺乏症的一致性分析

Table 1 Consistency analysis of G6PD deficiency screening by GSP analyzer and 1420 analyzer

GSP分析仪	1420分析仪	合计
阳性	阴性
阳性	53	2	55
阴性	4	2604	2608
合计	57	2606	2663

G6PD：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶.

2.3两种分析仪检测漂浮和未漂浮干血斑中G6PD结果比较

采用1420分析仪检测漂浮干血斑和未漂浮干血斑中的G6PD活性分别为（5.42±0.65）U/gHb和（6.19±0.49）U/gHb，差异有统计学意义（ t  = 8.554， P<0.05）；采用GSP分析仪检测漂浮干血斑和未漂浮干血斑中的G6PD活性分别为（70.76±7.76）U/dL和（71.52±7.35）U/dL，差异无统计学意义（ t=0.627， P>0.05），提示GSP分析仪可以更准确地检测漂浮干血斑中的G6PD活性。

2.4两种分析仪对G6PD缺乏症的筛查效率比较

GSP分析仪和1420分析仪筛查G6PD缺乏症的敏感度均为100.00%，且特异度均在99.80%以上，但GSP分析仪筛查G6PD缺乏症的阳性预测值、初筛阳性率和诊断率均高于1420分析仪，假阳性率低于1420分析仪（均 P<0.01），见 表2。结果提示，GSP分析仪对G6PD缺乏症的筛查效率更高。

表 2 GSP分析仪与1420分析仪对G6PD缺乏症的筛查效率比较

Table 2 G6PD deficiency screening efficiency of GSP analyzer and 1420 analyzer

筛查方法	n	初筛阳性例数	初筛阳性率（%）	诊断例数	诊断率（%）	假阳性率（%）	阳性预测值（%）	敏感度（%）	特异度（%）
1420分析仪
男性	579 993	5104	0.88	3973	0.69	0.20	77.84	100.00	99.80
女性	520 391	1349	0.26	501	0.10	0.18	37.14	100.00	99.84
合计	1 100 384	6453	0.59	4474	0.41	0.18	69.33	100.00	99.82
GSP分析仪
男性	449 595	4017	0.89	3340	0.74 **	0.15 **	83.15 **	100.00	99.85
女性	406 261	1378	0.34 **	630	0.16 **	0.16 **	45.72 **	100.00	99.82
合计	855 856	5395	0.63 **	3970	0.46 **	0.17 **	73.59 **	100.00	99.83

与1420分析仪筛查结果比较， ^** P<0.01.

2.5GSP分析仪检测新切值选择

按照初始切值26 U/dL，男性患儿与正常人群的区分度较好，而女性患儿存在部分漏筛；以第99.1百分位制定新切值，男性为26.1 U/dL，女性为29.1 U/dL，可更好地避免漏筛（ 图1）。

图 1 .

GSP分析仪检测男性和女性标本中G6PD活性的分布A：男性标本筛查结果；B：女性标本筛查结果. G6PD：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶.

3讨论

GSP分析仪是一种全新的新生儿筛查分析仪。与半自动荧光免疫分析仪相比，GSP分析仪可通过增加吸光度监控设置以防止因标本丢失和洗脱不全所致的漏筛，筛查性能有所提升；通过使用新的铕螯合物以排除乙二胺四乙酸、柠檬酸盐等对检测的干扰 ^[8] ；极大缩短了检测时间，全面实现了自动化，有效解决了手工操作低效率的缺点，提高了新生儿疾病筛查的效率。

De Castro等 ^[9] 应用GSP分析仪检测促甲状腺激素、17-羟孕酮和免疫反应性胰蛋白酶相应试剂盒的低、高质控品，显示批内和批间精密度分别为6.0%~14.2%和4.4%~13.9%；Fingerhut等 ^[8] 应用GSP分析仪检测促甲状腺激素、17-羟孕酮、免疫反应性胰蛋白酶、总T4和半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶活性相应试剂盒的低、高质控品，显示批内和批间精密度分别为2.5%~8.9%和5.7%~11.0%，平均回收率为97.8%~107.1%；国内对苯丙氨酸的检测发现，美国疾病预防控制中心质控品检测值与靶值的相对偏倚为–6.7%~19.2%，低、高质控品总变异系数分别为7.5%和7.4% ^[10] 。上述研究结果表明，GSP分析仪精密度和准确度较高，检测值稳定。GSP分析仪与1420分析仪同步检测临床G6PD确诊样本，检测值一致性较高 ^[11] 。本研究应用GSP分析仪检测G6PD，发现不同浓度质控品的检测值与靶值相对偏倚绝对值均在5%内，批内精密度为4.34%~4.91%，批间精密度为0.85%~2.12%，总变异系数为5.44%~5.72%；与1420分析仪同步检测G6PD筛查和确诊样本，发现检测结果具有较高的一致性。

阳性预测值和假阳性率是衡量新生儿疾病筛查效率非常重要的指标。采用WST-8、生物传感器和自动紫外酶解法检测G6PD活性，敏感度、特异度、阳性预测值分别为55%、98%、71%，19%、99%、59%和85.7%、99.2%、85.7% ^{[ 12- 13]} 。本文资料显示，GSP分析仪检测G6PD敏感度和特异度均较高，分别为100.00%和99.83%。与1420分析仪相比，GSP分析仪检测G6PD缺乏症的假阳性率有所下降，阳性预测值提高至73.59%。GSP分析仪增设恒温、恒湿的试剂仓，减少检测过程中温度、湿度等因素的影响，从而降低假阳性率；增加洗脱控制系统，避免因洗脱不全所致的假阳性 ^{[ 14- 15]} 。此外，G6PD活性检测的准确性易受干血斑漂浮影响，尤其在夏季干血斑漂浮率可达50%以上，导致荧光值明显偏低，造成假阳性率升高。GSP分析仪采用最新的多位点检测技术，即检测板孔中9个不同位置点的荧光值，选取最低的两个值计算得最终检测值，可有效降低干血斑漂浮对检测值的影响。

G6PD缺乏症是伴X连锁的不完全显性遗传病，女性杂合子酶活性变化范围较大，可以表现为正常、中度缺乏和重度缺乏 ^[16] 。国外前瞻性研究结果表明，G6PD女性杂合子患儿发生新生儿高胆红素血症的风险高于正常儿童，相对危险度达2.26，而女性杂合子患儿可通过早期干预起到很好的预防作用 ^{[ 17- 18]} 。Ainoon等 ^[19] 采用半定量荧光斑点法和定量法同步检测G6PD，两种方法的疾病检出率分别为3.28%和7.17%，出现这种差异的主要原因是定量法女性杂合子检出率达53%，远高于半定量荧光斑点法的7.5%。本文资料显示，与1420分析仪相比，采用GSP分析仪检测G6PD缺乏症的诊断率升高0.05%，其中男性升高0.05%，女性升高0.06%。虽选取的研究对象非同一人群，但因本研究样本量较大，可忽略人群差异对结果的影响，因此GSP分析仪更有利于G6PD缺乏症患儿的检出。目前，多数实验室采用1420分析仪检测G6PD，切值为2.10~2.60 U/gHb，部分女性杂合子患儿存在漏筛，有必要根据性别对G6PD切值进行区分和优化 ^[3] 。Fu等 ^[20] 应用荧光斑点法结合基因检测G6PD，调整男性切值为2.2 U/gHb，女性为1.6 U/gHb，女性杂合子患儿为2.8 U/gHb。与原切值相比，调整后女性杂合子患儿可增加43.75%的诊断率。Miao等 ^[21] 应用定量法和基因检测G6PD，将男性切值由2.1 U/gHb调整为2.35 U/gHb，检测敏感度提高至99.1%，男性患儿的检出率提高5%；女性切值由2.1 U/gHb调整为2.55 U/gHb，检测敏感度提高至97.6%，21%的女性杂合子患儿被检出。本文资料对不同性别人群样本中G6PD活性的分布进行分析发现，男性和女性确诊样本的G6PD活性存在差异，采用同一切值，女性杂合子患儿可能存在漏筛。根据本文资料的G6PD活性分布，建议将女性的切值从26 U/dL调整为29.1 U/dL，可减少女性杂合子患儿漏筛，后续需要扩大筛查样本进一步对此进行验证。

综上所述，GSP分析仪检测性能良好，筛查效率高，自动化程度高，通量大，可用于临床新生儿G6PD缺乏症的大规模筛查，适当提高女性切值可在一定程度减少女性患儿的漏筛。

COMPETING INTERESTS

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

国家重点研发计划（2018YFC1002204）