雪莲有效成分对高原缺氧小鼠心脑组织 的保护作用

Abstract

Objective:

To investigate the active compounds from Saussurea involucrata on the heart and brain of mice at simulated high altitude.

Methods:

Fifty healthy male adult BALB/c mice were randomly divided into normal control group, hypoxic model group, acetazolamide group, petroleum ether extract of Saussurea involucrata (PESI) group and octacosan group with 10 mice in each group. Acetazolamide group, PESI group and octacosan group were treated with acetazolamide (200 mg/kg), PESI (200 mg/kg) or octacosan (100 mg/kg) by single tail vein injection, respectively. Except normal control group, the mice were exposed to a simulated high altitude of 6000 m for 8 h in an animal decompression chamber. After the mice were sacrificed by cervical dislocation, the heart and brain were histologically observed by HE staining; superoxide dismutase (SOD) activity, total anti-oxidant capacity (T-AOC) and the content of malondialdehyde (MDA) in plasma, heart and brain tissues were detected by WST-1 method, ABTS method and TBA method, respectively; lactic acid and lactate dehydrogenase (LDH) activity in plasma, heart and brain tissues were detected by colorimetric method and microwell plate method, respectively; ATP content and ATPase activity in heart and brain tissues were detected by colorimetric method.

Results:

PESI and octacosane significantly attenuated the pathological damages of heart and brain tissue at simulated high altitude; increased SOD activity, T-AOC and LDH activity, and decreased the contents of MDA and lactic acid in plasma, heart and brain tissues; increased the content of ATP in heart and brain tissues; increased the activities of Na ⁺-K ⁺ ATPase, Mg ²⁺ ATPase, Ca ²⁺ ATPase and Ca ²⁺-Mg ²⁺ ATPase in myocardial tissue; and increased the activities of Mg ²⁺ ATPase, Ca ²⁺-Mg ²⁺ ATPase in brain tissue.

Conclusion:

PESI and octacosan exert anti-hypoxic activity by improving the antioxidant capacity, reducing the free radical levels, promoting the anaerobic fermentation, and alleviating the energy deficiency and metabolic disorders caused by hypoxia in mice.

大苞雪莲石油醚部位（petroleum ether extract of ，PESI）;乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）;超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）;总抗氧化能力（total anti-oxidant capacity，T-AOC）;苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin staining，HE染色）;

急性高原反应包括急性高原病、高原脑水肿和高原肺水肿，严重影响高原旅游、地方经济建设和部队战斗力 ^{[ 1- 3]} 。目前急性高原病的发病机制研究已取得丰硕成果 ^{[ 4- 5]} ，预防和治疗急性高原病的手段和方法很多，但研制不良反应小、疗效确切的新型抗高原缺氧药物仍具有重要的军事和社会意义 ^{[ 1- 3]} 。本团队前期采用小鼠常压密闭缺氧模型，从20多种西北高原特色植物药材中筛选发现大苞雪莲具有显著的高原缺氧活性，通过植化提取、分离和筛选确定了其有效部位为石油醚部位，并分离得到10种单体化合物，其中4种单体化合物抗高原缺氧活性均高于乙酰唑胺，尤以二十八烷（octacosane）的活性最高 ^{[ 6- 7]} 。通过筛选确定PESI和二十八烷的最佳给药剂量分别为200 mg/kg和100 mg/kg ^[8] ，两者均能有效调节缺氧小鼠的物质代谢，降低基础代谢水平，保证机体生存所需的能量 ^[9] 。本研究拟探索PESI和二十八烷对自由基氧化损伤和能量代谢的影响，以期阐明其抗缺氧作用机制，为抗高原缺氧新药研发提供理论依据。

1材料与方法

1.1动物、试剂与仪器

50只无特定病原体健康雄性BABL/c小鼠（体重为18~22 g）购于兰州生物制品有限公司动物实验中心（合格证号14-002）。PESI和二十八烷的提取方法参照文献 [7]，实验前称取适量，加入适量吐温-80，边研磨边加蒸馏水，分别配制成20 mg/mL和10 mg/mL的混悬液 ^{[ 8- 9]} 。乙酰唑胺（批号20100216）为武汉远城科技发展有限公司产品；乳酸测试盒、丙二醛测定试剂盒、LDH测试盒、SOD试剂盒、T-AOC测试盒、ATP含量测定试剂盒、ATP酶试剂盒和总蛋白定量测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品；血糖测试盒（批号20110714）为四川迈克科技有限公司产品；盐酸及其余试剂均为国产分析纯。FLYDWC50-ⅡA型低压低氧动物实验舱为中航贵州风雷航空军械有限责任公司产品；TG16-W微量高速离心机为湘仪离心机仪器有限公司产品；BP210S电子天平为德国Sartorius公司产品；HP8453二级管阵列紫外 - 可见分光光度计为美国惠普公司产品。

1.2动物分组及处理

小鼠经适应性饲养3 d后，随机分为健康对照组、模型对照组、乙酰唑胺组、PESI组和二十八烷组，每组10只。乙酰唑胺组、PESI组和二十八烷组分别给予单次尾静脉注射乙酰唑胺200 mg/kg、PESI 200 mg/kg和二十八烷100 mg/kg。给药20 min后，除健康对照组外，将各组小鼠同时放入低压低氧动物舱，模拟上升至海拔6000 m，维持8 h后，降至当地海拔高度。

实验废弃物及动物尸体等按照《医疗废物管理条例》要求进行无害化处理；实验中严格遵守国家科技部《关于善待实验动物的指导性意见》，尽可能减少对动物的伤害。

1.3HE染色观察高原缺氧小鼠心肌和脑组织显微结构的变化

打开舱门，每组迅速取出5只小鼠，断头处死，剥出大脑和心脏，置于10%甲醛溶液中固定，制成石蜡切片，HE染色后用光学显微镜观察。

1.4氧化应激及能量代谢相关指标测定

各组迅速取剩余5只小鼠，处死，心脏采血，枸橼酸钠抗凝，离心后取血浆，低温保存备用；同时解剖小鼠，分别取心脏和大脑，制成10%组织匀浆液。采用WST-1法检测SOD活性；采用ABTS法检测T-AOC；采用硫代巴比妥酸法检测丙二醛含量；采用微板法检测LDH活性；采用比色法分别检测乳酸含量、ATP含量和ATP酶活性。以上操作均按试剂盒说明书进行。

1.5统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。正态分布的计量数据以均数±标准差（ $\overline{x}\pm s$ ）表示，组间比较采用  t  检验， P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1PESI和二十八烷对高原缺氧小鼠心肌和脑组织显微结构的影响

健康对照组心肌组织无肿胀现象，细胞排列整齐，界限清晰，形态结构完好无损，细胞核染色均匀，心肌纤维组织排列有序，结构层次分明；模型对照组心肌组织细胞界限不完整，层次不清，可见不同程度的水肿、溶解坏死、空泡变性及间质水肿，细胞核变形，有核固缩现象，并出现核链情况，结构层次纹理混乱；乙酰唑胺组心肌组织结构较清晰，水肿程度减轻，界限较完整，溶解坏死和空泡变性减少，细胞核有核固缩现象，组织纤维纹理较整齐；PESI组心肌组织形态较模型对照组的结构清晰，与乙酰唑胺组接近，心肌细胞水肿程度有所减轻，结构清晰，细胞核染色较均匀，核固缩现象也有所减轻，组织纤维纹理较整齐；二十八烷组心肌组织形态与PESI组相似。见 图1。结果提示，PESI和二十八烷可明显减轻急性高原小鼠心肌组织细胞形态的缺氧损伤。

图 1 .

各组心肌和脑组织光学显微镜下表现（HE染色）与健康对照组比较，模型对照组心肌组织细胞排列散乱，可见不同程度的水肿、空泡变性、核固缩现象，并出现核链情况，而乙酰唑胺组、PESI组和二十八烷组结构清晰，损伤情况有所减轻.与健康对照组比较，模型对照组脑组织细胞排列稀疏，界限不清，可见明显水肿现象、血管扩张、空泡变性、核固缩现象，而乙酰唑胺组、PESI组和二十八烷组损伤情况有所减轻. PESI：大苞雪莲石油醚部位. 标尺=200 μm.

健康对照组脑组织没有水肿，细胞排列紧密，形态结构完好无损，界限完整，细胞核着色均匀，结构层次分明，与细胞质界限清晰，细胞膜圆滑平整；模型对照组脑组织较健康对照组有明显水肿现象，脑细胞肿胀变圆，血管扩张，微血管周围有渗出，细胞排列稀疏，界限不清，空泡化现象严重，细胞核变形，有的细胞核出现核固缩，与细胞质界限不清晰，细胞膜有破裂现象；乙酰唑胺组脑组织水肿程度与模型对照组相比有所减轻，脑细胞和血管周围肿胀情况也有所减轻，细胞界限较清晰，排列较紧密，结构层次较整齐，细胞核界限较清晰，细胞质空泡化现象减轻；PESI组脑组织水肿程度较模型对照组和乙酰唑胺组轻，脑细胞和血管周围肿胀程度减轻，脑细胞界限较清晰，排列也较为整齐，细胞核与细胞质界限较清晰，细胞质空泡化现象减轻；二十八烷组脑组织整体情况与PESI组相似。见 图1。结果提示，PESI和二十八烷可明显减轻急性高原小鼠脑组织细胞形态的缺氧损伤。

2.2PESI和二十八烷对高原缺氧小鼠自由基代谢的影响

与健康对照组比较，模型对照组血浆、心肌和脑组织中SOD活性均降低（均 P<0.01）；PESI组和二十八烷组SOD活性均高于模型对照组（均 P<0.01），其中PESI组血浆SOD活性和二十八烷组脑组织SOD活性与健康对照组差异无统计学意义（均 P>0.05）。与健康对照组比较，模型对照组血浆、心肌和脑组织丙二醛含量均升高（均 P<0.01）；PESI组和二十八烷组丙二醛含量均低于模型对照组（均 P<0.01），与健康对照组差异均无统计学意义（除二十八烷组心肌组织丙二醛含量外，均 P>0.05）。与健康对照组比较，模型对照组血浆、心肌和脑组织T-AOC均降低（均 P<0.01）；PESI组和二十八烷组的T-AOC均高于模型对照组（均 P<0.05），其中PESI组与健康对照组差异无统计学意义（均 P>0.05）。见 表1。上述结果提示，PESI和二十八烷可显著减少机体在缺氧状态下的自由基损伤，提高机体在缺氧状态下的抗氧化能力。

表 1 各组血浆、心肌和脑组织中SOD活性、丙二醛含量和T-AOC比较

Table 1 SOD activities, malondialdehyde contents and T-AOC in plasma, myocardium and brain tissue of mice in each group

( $\overline{x}\pm s$ , n=10)

组 别	SOD活性		丙二醛含量		T-AOC
血浆 （U/mL）	心肌组织 （U/mg）	脑组织 （U/mg）		血浆 （nmol/mL）	心肌组织 （nmol/mg）	脑组织 （nmol/mg）		血浆 （U/mL）	心肌组织 （U/mg）	脑组织 （U/mg）
健 康对照组	155 ± 10	376 ± 22	165 ± 12		3.55 ± 0.41	3.44 ± 0.72	3.06 ± 0.37		11.14±2.63	1.56±0.21	2.21±0.23
模 型对照组	98 ± 19 **	190 ± 23 **	98 ± 16 **		5.70 ± 0.62 **	5.13 ± 0.64 **	4.30 ± 0.42 **		5.63±1.30 **	1.11±0.09 **	1.83±0.24 **
乙 酰唑胺组	120 ± 14 **#	270 ± 25 **##	164 ± 22 ##		3.98 ± 0.55 ##	4.28 ± 0.73 *#	3.27 ± 0.45 ##		7.53±1.94 **#	1.30±0.20 *#	2.68±0.26 **##
PESI组	160 ± 19 ##	254 ± 22 **##	183 ± 18 **##		3.27 ± 0.28 ##	3.98 ± 0.77 ##	3.12 ± 0.23 ##		10.43±2.46 ##	1.37±0.21 ##	2.20±0.21 ##
二 十八烷组	139 ± 12 **##	229 ± 24 **##	159 ± 21 ##		3.70 ± 0.47 ##	4.28 ± 0.78 *##	3.25 ± 0.33 ##		7.46±1.04 **#	1.23±0.14 **#	2.03±0.12 *#

与健康对照组比较， ^* P<0.05， ^** P<0.01；与模型对照组比较， ^# P<0.05， ^## P<0.01. PESI：大苞雪莲石油醚部位；SOD:超氧化物歧化酶；T-AOC：总抗氧化能力.

2.3PESI和二十八烷对高原缺氧小鼠能量代谢的影响

2.3.1PESI和二十八烷对高原缺氧小鼠血浆、心肌和脑组织乳酸含量和LDH活性的影响

与健康对照组比较，模型对照组血浆和脑组织中乳酸含量增加（均 P<0.01），而心肌组织中乳酸含量无显著变化（ P>0.05）；乙酰唑胺组、PESI组 和二十八烷组血浆、心肌和脑组织中乳酸含量均低于模型对照组（均 P<0.05）。与健康对照组比较，模型对照组血浆和脑组织中LDH活性降低（均 P<0.05），而心肌组织中LDH活性无显著变化（ P>0.05）；乙酰唑胺组、PESI组和二十八烷组血浆、心肌组织和脑组织中LDH活性均高于模型对照组（均 P<0.01）。见 表2。上述结果提示，PESI和二十八烷可通过提高LDH活性减少缺氧状态下血浆、心肌和脑组织中的乳酸堆积，促进细胞无氧酵解。

表 2 各组血浆、心肌和脑组织中乳酸含量和LDH活性比较

Table 2 Lactic acid contents and LDH activity in plasma, myocardium and brain tissue of mice in each group simulated high altitude

( $\overline{x}\pm s$ , n=10)

组 别	乳酸含量		LDH活性
血浆（mmol/L）	心肌组织（mmol/g）	脑组织（mmol/g）		血浆（U/L）	心肌组织（U/g）	脑组织（U/g）
健康对照组	1.32 ± 0.42	1.47 ± 0.11	0.52 ± 0.08		3565 ± 205	1595 ± 176	5588 ± 292
模型对照组	5.03 ± 0.37 **	1.55 ± 0.15	0.75 ± 0.06 **		2814 ± 228 **	1746 ± 148	5928 ± 288 *
乙酰唑胺组	3.61 ± 0.68 **##	1.18 ± 0.17 **##	0.65 ± 0.11 **#		3258 ± 173 **##	1344 ± 106 **##	5333 ± 230 *##
PESI组	3.19 ± 0.51 **##	1.07 ± 0.21 **##	0.59 ± 0.09 **##		3340 ± 177 *##	1204 ± 138 **##	5202 ± 278 **##
二十八烷组	3.10 ± 0.43 **##	1.13 ± 0.18 **##	0.67 ± 0.10 **#		3151 ± 180 **##	1247 ± 102 **##	5254 ± 276 *##

与健康对照组比较， ^* P<0.05， ^** P<0.01；与模型对照组比较， ^# P<0.05， ^## P<0.01. PESI：大苞雪莲石油醚部位；LDH：乳酸脱氢酶.

2.3.2PESI和二十八烷对高原缺氧小鼠心肌和脑组织ATP含量及ATP酶活性的影响

与健康对照组比较，模型对照组小鼠心肌和脑组织中ATP含量均降低（均 P<0.01）；乙酰唑胺组、PESI组和二十八烷组心肌和脑组织中ATP含量均高于模型对照组（均 P<0.05）。与健康对照组比较，模型对照组心肌组织中镁ATP酶和钙镁ATP酶活性均降低（均 P<0.05），而钠钾ATP酶和钙ATP酶活性无显著变化（均 P>0.05）；乙酰唑胺组、PESI组和二十八烷组四种酶活性均高于模型对照组（均 P<0.05）。与健康对照组比较，模型对照组脑组织中ATP酶除钠钾ATP酶外，其他三种酶活性均较健康对照组降低（均 P<0.05）；PESI组和二十八烷组镁ATP酶和钙镁ATP酶活性均高于模型对照组（均 P<0.05），而钠钾ATP酶和钙ATP酶活性与模型对照组差异无统计学意义（均 P>0.05）；乙酰唑胺组仅镁ATP酶高于模型对照组（ P<0.05）。见 表3。上述结果提示，PESI和二十八烷可显著升高急性高原小鼠心肌和脑组织中的ATP含量和ATP酶活性，保护心肌组织细胞膜上各种ATP酶的功能，缓解缺氧所致能量缺乏和代谢障碍。

表 3 各组心肌和脑组织ATP含量及ATP酶活性比较

Table 3 ATP content and ATPase activities in myocardium and brain tissue of mice in each group

( $\overline{x}\pm s$ , n=10)

组 别	ATP含量 （μmol/g）		钠钾ATP酶活性 （μmol·mg –1·h –1）		镁ATP酶活性 （μmol·mg –1·h –1）
心肌组织		脑组织		心肌组织		脑组织		心肌组织
健康对照组	286 ± 42		248± 35		3.85 ± 0.67		3.93 ±0 .46		2.64 ± 0.57
模型对照组	190 ± 27 **		132± 27 **		3.36 ± 0.52		3.62 ± 0.32		2.02 ± 0.62 *
乙酰唑胺组	236± 47 *#		224± 28 ##		4.02 ± 0.63 #		3.68 ± 0.51		3.35 ± 0.45 **##
PESI组	295± 53 ##		220± 36 ##		4.13 ± 0.43 ##		3.79 ± 0.33		3.26 ± 0.48 **##
二十八烷组	304± 47 ##		226± 23 ##		4.32 ± 0.79 ##		3.70 ± 0.47		3.77 ± 0.51 **##
组 别	镁ATP酶活性 （μmol·mg –1·h –1）		钙ATP酶活性 （μmol·mg –1·h –1）		钙镁ATP酶活性 （μmol·mgt –1·h –1）
脑组织		心肌组织		脑组织		心肌组织		脑组织
健康对照组	1.91 ± 0.47		2.86 ± 0.63		1.87 ± 0.42		2.63 ± 0.61		3.78 ± 0.53
模型对照组	1.46 ± 0.27 *		2.35 ± 0.45		1.48 ± 0.28 *		2.03 ± 0.57 *		3.27 ± 0.41 *
乙酰唑胺组	1.80 ± 0.35 #		2.97 ± 0.76 #		1.45 ± 0.36 *		3.03 ± 0.43 ##		3.42 ± 0.20
PESI组	1.82 ± 0.38 #		2.89 ± 0.52 #		1.54 ± 0.17 *		3.08 ± 0.56 ##		3.71 ± 0.28 #
二十八烷组	1.88 ± 0.32 ##		3.05 ± 0.73 #		1.52 ± 0.16 *		3.12 ± 0.88 ##		3.69 ± 0.33 #

与健康对照组比较， ^* P<0.05， ^** P<0.01；与模型对照组比较， ^# P<0.05， ^## P<0.01. PESI：大苞雪莲石油醚部位.

3讨论

心和脑是机体耗氧量最大的器官，急性高原缺氧对心脑组织细胞的损伤也最为严重。氧供应不足时，机体为了保证生存所需能量，就会增强糖酵解，导致乳酸堆积，同时无氧呼吸产生大量超氧阴离子，使脂质过氧化、酶失活、核酸交联或氧化，从而严重影响组织功能，造成机体损伤 ^{[ 10- 13]} 。本研究通过组织病理学观察发现，小鼠急性高原缺氧8 h后心肌和大脑组织细胞形态发生明显变化，细胞明显水肿，血管普遍扩张，微血管周围有渗出，细胞质内出现空泡变性，细胞核染色不均匀，并且有核固缩和核链现象。与模型对照组比较，PESI组和二十八烷组心肌和大脑组织细胞形态的缺氧损伤情况均明显减轻，组织细胞结构较清晰，细胞排列也较为整齐，水肿程度明显减轻，细胞核染色比较均匀，核固缩程度减轻，细胞核与细胞质界限较清晰，细胞质空泡化现象减轻。

缺氧损伤的主要机制之一就是自由基损伤，检测与缺氧相关的自由基代谢指标对研究抗缺氧药物的机制至关重要。在正常条件下，机体内的部分氧可还原成羟自由基和超氧阴离子自由基等，而氧自由基随时又可以被体内的SOD等抗氧化物酶清除，两者处于动态平衡之中 ^[14] 。在缺氧环境下，机体内的自由基代谢因缺氧而发生紊乱，导致自由基的含量异常增高，引起脂质过氧化，其中过氧化产物丙二醛具有损伤生物大分子和细胞膜结构的作用，最终导致氧化 - 抗氧化系统功能失衡，因此通过检测丙二醛含量可反映机体氧化性损伤的程度 ^[15] 。而机体的抗氧化能力防御体系有酶促和非酶促两个体系，T-AOC可从总体上反映机体清除自由基的能力。本文资料显示，当小鼠暴露于模拟海拔6000 m高原缺氧环境8 h后，模型组的血浆、心肌和脑组织中SOD活性和T-AOC均明显下降，而丙二醛含量明显上升，说明在急性高原缺氧条件下，机体的抗氧化系统被破坏，活性氧自由基大量蓄积，导致机体组织细胞受到损伤。而预先用PESI和二十八烷处理的小鼠心肌和脑组织SOD活性没有下降，丙二醛含量没有明显上升，说明两者能有效降低自由基损伤，提高机体在缺氧状态下的抗氧化能力。

能量代谢是机体维持生命和功能的基础 ^[16] 。机体在氧气充足的状态下，能将葡萄糖、氨基酸和脂肪完全氧化，生成二氧化碳和水，并释放能量。在无氧条件下，机体能量主要来自糖酵解，导致乳酸堆积。心脏和大脑耗氧最多，因而缺氧时间过长会造成这两个重要器官中乳酸的堆积，导致代谢性酸中毒。LDH和乳酸是反映机体糖酵解的重要指标，乳酸既是糖酵解的产物，又是糖异生的原料。LDH使乳酸脱氢生成丙酮酸，便于利用乳酸的转化和解除代谢性酸中毒。LDH和乳酸可以敏感地反映机体的能量代谢。本文资料显示，PESI和二十八烷可通过提高血浆、心肌和脑组织中LDH活性而减少高原缺氧小鼠的乳酸堆积，提高乳酸的代谢转化，促进细胞无氧酵解。

ATP是体内最重要的能量载体，同时对维持细胞膜电位和膜的完整性具有重要意义。钠钾ATP酶、钙ATP酶、镁ATP酶和钙镁ATP酶对维持细胞内外的离子交换过程起重要作用，检测这四种ATP酶的活性能准确反映组织损伤恢复能力和代谢紊乱情况 ^[17] 。本文资料显示，高原缺氧小鼠心肌和脑组织中的ATP含量均大幅度下降，钠钾ATP酶、钙ATP酶、镁ATP酶和钙镁ATP酶的活性也都有下降趋势，而尾静脉注射PESI和二十八烷后小鼠心肌和脑组织中ATP含量下降幅度较小，且ATP酶活性变化幅度较模型对照组小，可见PESI和二十八烷能缓解缺氧所致能量缺乏和代谢障碍，并保护细胞膜上各种ATP酶的功能。

综上所述，PESI及其有效成分二十八烷能减轻急性高原缺氧对小鼠大脑和心肌组织损伤，能通过提高机体抗氧化能力，降低自由基损伤；促进细胞无氧酵解，提高乳酸代谢转化；缓解缺氧所致能量缺乏和代谢障碍，保护细胞膜上各种ATP酶的功能，从而进一步提高机体的缺氧耐受力。

COMPETING INTERESTS

所有作者均声明不存在利益冲突

Funding Statement

国家自然科学基金（81571847，81872796）；军队后勤科研计划（CWH17J010，CLB18J028）