严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)核酸检测试剂盒临床诊断效能评估

Abstract

目的

了解三种严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）核酸检测试剂盒的检测效果及临床诊断效能。

方法

采集40例临床诊断为2019冠状病毒病（COVID-19）和16例非COVID-19住院患者的咽拭子样本。采用湖南圣湘生物科技有限公司（以下简称“圣湘公司”）、硕世生物科技股份有限公司（以下简称“硕世公司”）、深圳华大基因股份有限公司（以下简称“华大基因”）SARS-CoV-2核酸RT-PCR检测试剂盒检测上述样本并分析其敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和Kappa值。比较一步裂解法和磁珠法、两种不同核酸提取仪（圣湘公司Natch CS S12C全自动核酸提取系统和西安天隆科技有限公司NP968-C核酸提取仪）磁珠法提取咽拭子样本中病毒核酸的效果及其RT-PCR检测结果的阳性符合率、阴性符合率、总符合率及Kappa值。

结果

圣湘公司试剂盒检测SARS-CoV-2核酸的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和Kappa值分别为95.00%、87.50%、95.00%、87.50%和0.825，硕世公司试剂盒分别为90.00%、87.50%、94.74%、77.78%和0.747，华大基因试剂盒分别为82.50%、81.25%、91.67%、65.00%和0.593。一步裂解法和磁珠法提取的病毒核酸检测结果阳性符合率、阴性符合率、总符合率和Kappa值分别为95.24%、100.00%、96.43%、0.909，但一步裂解法仅耗时25 min，而磁珠法需180 min。两种不同核酸提取仪磁珠法提取的RNA检测结果阳性符合率、阴性符合率、总符合率和Kappa值分别为85.00%、100.00%、89.29%和0.764。

结论

圣湘公司试剂盒检测SARS-CoV-2核酸效果略优于其他两家公司试剂盒。一步裂解法提取咽拭子样本中总RNA具有操作简单、省时和检测结果符合率较高的优点。

2019年12月以来，湖北省武汉市及我国其他地区陆续发现严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引起的2019冠状病毒病(coronavirus disease 2019，COVID-19)病例。目前COVID-19已被纳入我国乙类传染病，并采取甲类传染病的预防和控制措施。SARS-CoV-2归类于β属冠状病毒，核酸为不分节段的单正链RNA，其核苷酸序列与一种蝙蝠冠状病毒的同源性达到90 %以上 ^{[ 1]} 。目前已知能感染人的冠状病毒有6种：α属人冠状病毒229E和NL63、β属人冠状病毒OC43和HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV) ^{[ 2- 3]} 。冠状病毒有包膜，包膜上有S蛋白形成的刺突，可用于病毒分型，N蛋白连接RNA，其基因是目前检测病毒的主要靶点之一 ^{[ 4]} 。

COVID-19患者鼻或咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、外周血、粪便等标本可用于检测SARS-CoV-2核酸 ^{[ 5]} 。其中，呼吸道或血液标本中检出SARS-CoV-2核酸是临床确诊COVID-19的依据，连续两次病毒核酸检测阴性是患者出院的标准之一 ^{[ 6]} 。通常采用实时荧光定量RT-PCR检测SARS-CoV-2核酸 ^{[ 7]} ，开放读码框1ab(open reading frame 1ab， ORF1ab )和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein， N)基因是主要检测靶点 ^{[ 8]} 。病毒核酸检测具有快速、早期、敏感、特异等优势，但检测结果的准确性还受到样本类型与质量、试剂性能、实验操作以及不同疾病阶段等因素影响 ^{[ 9]} 。尤其对临床诊断困难的病例更应严格控制RT-PCR检测的准确性。本研究采用不同RT-PCR试剂盒检测了临床诊断为COVID-19患者的咽拭子样本，了解其优缺点以及需改进之处, 以期为临床使用提供参考。

1 资料与方法

1.1 样本及来源

采集湖北省鄂州市中心医院2020年2月17至21日临床诊断为COVID-19的40例住院患者的咽拭子样本，其中男性24例，女性16例，年龄31~76岁。另采集16例非COVID-19住院患者的咽拭子标本，其中男性5例，女性11例，年龄28~73岁。样本采集及使用获医院伦理委员会批准，并获患者知情同意。

1.2 检测试剂

选取湖南圣湘生物科技有限公司(以下简称“圣湘公司”)新型冠状病毒核酸快速检测试剂盒(PCR荧光探针法，批号2020003)、硕世生物科技股份有限公司(以下简称“硕世公司”)新型冠状病毒(2019)核酸检测试剂盒(双重荧光PCR法，批号20200108)和深圳华大基因股份有限公司(以下简称“华大基因”)新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法，批号6020200106)。

1.3 检测方法

检测人员严格按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》(卫办医政发〔2020〕194号) ^{[ 10]} 、《新型冠状病毒实验室生物安全指南(第二版)》(国卫办科教函〔2020〕70号) ^{[ 11]} 、《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第四版)》 ^{[ 12]} 进行实验操作和生物安全防护。

1.3.1 总RNA提取

采用圣湘公司Natch CS S12C全自动核酸提取系统和西安天隆科技有限公司(以下简称“天隆公司”)NP968-C核酸提取仪提取咽拭子样本中的总RNA。

1.3.2 核酸扩增

采用赛默飞世尔公司扩增仪(QuantStudio ^TM 5 Real-Time PCR System)，根据不同厂家试剂盒说明书设置反应程序进行扩增检测并对检测结果进行阴性或阳性判定。

1.3.3 质量控制

每批样本检测时均设置3个阴性对照和1个阳性对照，每次检测的阴性和阳性对照符合要求时样本检测结果有效，否则无效。

1.4 统计学方法

对56例患者咽拭子标本检测结果进行分析，统计敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、总符合率并计算Kappa值，评估不同检测试剂盒的检测效果及其临床诊断价值。

2 结果

2.1 不同试剂盒基本情况比较

不同检测试剂盒的基本情况和技术指标见 表 1。圣湘公司和硕世公司试剂盒检测的靶基因均为 ORF1ab 和 N基因，华大基因试剂盒检测的靶基因为 ORF1ab 基因。圣湘公司和华大基因试剂盒有内标，硕世公司则无内标。3种试剂盒均可用磁珠法提取总RNA，圣湘公司还可用一步裂解法提取总RNA。3种试剂盒RNA上样量、Ct值、扩增温度、循环数以及结果判断稍有差异。

表1 三种SARS-CoV-2核酸检测试剂盒的基本情况和技术指标

Table 1 Basic information and technique index of three test kits for SARS-CoV-2 nucleic acid detection

试剂盒	靶基因	核酸提取	加样量(μL)	扩增温度和循环数	结果判断	最低检测限(拷贝数/mL)	内标
阳性	阴性
圣湘公司	ORF1ab/N	磁珠法一步裂解法	10 20	60 ℃ 45个循环	S型扩增曲线 Ct值≤40	Ct值>40	200	有
硕世公司	ORF1ab/N	磁珠法	5	55 ℃ 45个循环	S型扩增曲线 Ct值≤35	Ct值>38	1000	无
华大基因	ORF1ab	磁珠法	10	60 ℃ 40个循环	S型扩增曲线 Ct值≤38	不呈S型曲线且无Ct值	100	有

  SARS-CoV-2：严重急性呼吸综合征冠状病毒2；Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数.

2.2 三种试剂盒临床诊断效能评估

40例COVID-19患者和16例非COVID-19患者咽拭子样本检测结果显示，圣湘公司试剂盒检测的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、Kappa值分别为95.00 %、87.50 %、95.00 %、87.50 %、0.825，硕世公司试剂盒分别为90.00 %、87.50 %、94.74 %、77.78 %、0.747，华大基因试剂盒分别为82.50 %、81.25 %、91.67 %、65.00 %、0.593( 表 2)。结果提示，圣湘公司试剂盒检测SARS-CoV-2 RNA的能力略优于其他两种检测试剂盒。

表2 三种SARS-CoV-2核酸检测试剂盒的临床诊断效能

Table 2 Diagnosis efficacy of three test kits for SARS-CoV-2 nucleic acid detection

试剂盒	COVID-19样本( n=40)		非COVID-19样本( n=16)
阳 性	阴 性	阳 性	阴 性
圣湘公司	38	2		2	14
硕世公司	36	4		2	14
华大基因	33	7		3	13

  SARS-CoV-2：严重急性呼吸综合征冠状病毒2；COVID-19：2019冠状病毒病.

2.3 一步裂解法与磁珠法提取总RNA效果及其对检测结果的影响

采用圣湘公司配套的全自动核酸提取仪，分别用一步裂解法和磁珠法提取40例COVID-19患者和16例非COVID-19患者咽拭子样本总RNA，然后用该公司病毒核酸快速检测试剂盒检测，结果显示阳性符合率、阴性符合率、总符合率和Kappa值分别为95.24 %、100.00 %、96.43 %和0.909( 表 3)。采用一步裂解法耗时25 min，但磁珠法耗时180 min，二者差异明显。结果提示，一步裂解法与磁珠法有较高的符合率和重复性，但一步裂解法更加省时。

表3 一步裂解法与磁珠法检测效果比较

Table 3 Results of one-step cleavage and magnetic bead methods

总RNA提取方法	COVID-19样本( n=40)		非COVID-19样本( n=16)
阳 性	阴 性	阳 性	阴 性
一步裂解法	40	0		2	14
磁珠法	38	2		2	14

  COVID-19：2019冠状病毒病.

2.4 不同核酸提取仪对检测效果的影响

圣湘公司核酸提取仪磁珠法提取40例COVID-19和16例非COVID-19患者咽拭子样本中总RNA全程耗时180 min，天隆公司核酸提取仪磁珠法全程耗时30~40 min。两种不同核酸提取仪提取的总RNA采用圣湘公司的试剂盒检测结果显示，其阳性符合率、阴性符合率、总符合率和Kappa值分别为85.00 %、100.00 %、89.29 %和0.764( 表 4)。结果提示，圣湘公司和天隆公司核酸提取仪具有较好的符合率和一致性。

表4 不同核酸提取仪对检测效果的影响

Table 4 The influence of different nucleic acid extractors on the detection

核酸提取仪	COVID-19样本( n=40)		非COVID-19样本( n=16)
阳 性	阴 性	阳 性	阴 性
圣湘公司	38	2		2	14
天隆公司	33	7		1	15

  COVID-19：2019冠状病毒病.

3 讨论

本研究采用3种试剂盒检测COVID-19和非COVID-19患者咽拭子样本结果显示，圣湘公司试剂盒的敏感度为95.00 %，高于硕世公司试剂盒的90.00 %和华大基因试剂盒的82.50 %；圣湘公司试剂盒特异度为87.50 %，等同于硕世公司试剂盒但优于华大基因试剂盒的81.25 %；圣湘公司试剂盒阳性预测值为95.00 %，优于硕世公司试剂盒的94.74 %和华大基因试剂盒的91.67 %；圣湘公司试剂盒阴性预测值为87.50 %，优于硕世公司试剂盒的77.78 %和华大基因试剂盒的65.00 %；圣湘公司试剂盒Kappa值为0.825，优于硕世公司试剂盒的0.747和华大基因公司试剂盒的0.593。上述实验数据显示，圣湘公司试剂盒检测SARS-CoV-2 RNA的能力略优于其他两种检测试剂盒。

除上述三种试剂盒临床诊断效能评估，此次研究还采用圣湘公司配套全自动核酸提取仪分别按照一步裂解法和磁珠法提取COVID-19和非COVID-19患者咽拭子样本总RNA，并用该公司病毒核酸检测试剂盒检测。结果显示，两者阳性符合率为95.24 %、阴性符合率为100 %、总符合率为96.43 %、Kappa值为0.909，表明一步裂解法与磁珠法有较高的符合率和重复性，但一步裂解法明显省时且操作简单，能快速大批量提取总RNA。此外，分别采用圣湘公司和天隆公司提取COVID-19和非COVID-19患者咽拭子样本中的总RNA，然后用同种试剂盒检测结果显示，两者阳性符合率、阴性符合率、总符合率和Kappa值分别为85.00 %、100 %、89.29 %和0.764，具有较好的符合率和一致性。

样本质量是决定病原体检测的关键因素之一，SARS-CoV-2核酸检测亦是如此 ^{[ 13]} 。COVID-19患者实验室检查指标中存在外周血白细胞总数正常或减低及淋巴细胞计数减少等改变，但病变主要在下呼吸道，理论上应该用深部痰液或肺泡灌洗液等下呼吸道标本进行检测 ^{[ 5]} 。由于医院感染控制、操作难易和普及性等原因，实际上多使用鼻咽或口咽拭子，取材时推荐使用尼龙植绒拭子，其表面有细小毛刷有利于样本采集，口咽部取材时拭子应越过舌根到咽后壁及扁桃体隐窝、侧壁等处反复擦拭3~5次，可多收集表面黏膜细胞，也可对同一患者采取多个不同部位样本合并送检，如口咽拭子与双侧鼻咽拭子，有助于提高检测效果 ^{[ 14]} 。

综上所述，开展SARS-CoV-2检测的实验室采购检测试剂盒时，应结合自身实验室设施、标本量及人员配置，合理选择试剂盒品牌及其检测方法，尽可能提前对几种检测试剂盒进行比较，根据检测结果与临床的相符性，选择适合本实验室的试剂。我们通过三种SARS-CoV-2核酸检测试剂盒基本情况和技术参数分析以及检测效果比较，发现圣湘公司的试剂盒略优于其他两家公司的试剂盒，更省时省力，可以提高实验室检测工作的效率，比较适合医疗机构较大批量样本的SARS-CoV-2筛查。