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Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery logoLink to Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery
. 2022 Jan;36(1):102–110. [Article in Chinese] doi: 10.7507/1002-1892.202107108

环指蛋白11调控Akt信号通路促进BMSCs成骨分化的机制研究

Mechanism of ring finger protein 11 regulating Akt signaling pathway to promote osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

雯 邓 1, 婷 龙 2, 英 杜 3,*
PMCID: PMC8844614  PMID: 35038807

Abstract

目的

研究BMSCs成骨分化过程中环指蛋白11（ring finger protein 11，RNF11）对Akt信号通路的调节作用，为进一步阐明BMSCs成骨分化机制和用于临床治疗提供思路。

方法

从健康人体新鲜骨髓中分离培养BMSCs并传代，取第4代细胞经流式细胞术，成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定后用于实验。BMSCs成骨诱导分化培养0～14 d，通过茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度，并用Western blot法检测RNF11蛋白表达。取第4代BMSCs，分为空白对照组（A组）、空载慢病毒（Lv-NC）组（B组）和敲低RNF11（Lv-ShRNF11）组（C组），成骨诱导分化培养0～14 d，采用Western blot检测RNF11蛋白表达，茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度，14 d实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）检测BMSCs成骨标志物Runx2、骨钙素（osteocalcin，OCN）及骨桥蛋白（osteopontin，OPN）的mRNA相对表达量；采用Western blot检测Akt、Smad1/5/8及β-catenin信号通路蛋白相对表达量，以磷酸化前后比值表示。为研究RNF11对Akt信号通路的影响机制，取第4代BMSCs分为Lv-NC转染组（A1组）、Lv-ShRNF11转染组（B1组）和添加Akt信号通路激活剂SC79的Lv-ShRNF11转染组（C1组），14 d时采用Western blot检测RNF11和Akt信号通路蛋白相对表达量，茜素红染色、ALP染色及qRT-PCR检测成骨相关指标。

结果

流式细胞术及成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定显示分离培养细胞为BMSCs。RNF11蛋白相对表达量随成骨分化时间延长而逐渐增加（P<0.05）；下调RNF11后，茜素红和ALP染色示C组相较于A、B组BMSCs成骨分化程度降低，qRT-PCR检测示Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量减少（P<0.05）。随成骨分化时间延长，RNF11与Akt信号通路蛋白相对表达量均上升（P<0.05）。下调RNF11后，C组相较于A、B组，其Akt信号通路蛋白相对表达量显著降低（P<0.05），而对Smad1/5/8以及β-catenin信号通路蛋白相对表达量无明显影响（P>0.05）。B1、C1组相较于A1组，其RNF11蛋白相对表达量减少（P<0.05），B1组相较于A1、C1组，其Akt信号通路蛋白相对表达量降低（P<0.05）；茜素红与ALP染色示C1组BMSCs成骨分化程度稍低于A1组（P>0.05），而明显高于B1组（P<0.05）；qRT-PCR检测示C1组Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量稍低于A1组（P>0.05），而明显高于B1组（P<0.05）。

结论

RNF11通过正向调控Akt信号通路激活水平促进BMSCs向成骨细胞分化。RNF11可作为提高BMSCs修复骨缺损疗效以及治疗骨代谢病的潜在靶点。

Keywords: BMSCs, 成骨分化, 环指蛋白11, Akt信号通路, 组织工程骨, 骨缺损修复

骨缺损是骨科常见疾病之一，其治疗手段主要有自体骨、同种异体骨或人工骨移植修复，但自体骨移植取材较复杂且增加了患者痛苦，同种异体骨移植存在免疫排斥、疾病传播等问题，人工骨移植优点较多，但也存在诸多局限[1-2]。组织工程骨技术是骨缺损治疗的主要发展方向。MSCs是一种在体内分布广泛、来源丰富的多能祖细胞，免疫原性低，具有成脂、成软骨和成骨多向分化潜能[1-3]。在附着于生物材料的情况下，MSCs可快速分化为成骨细胞，形成膜内骨[4-5]，不仅极大程度解决了免疫排斥问题，还可以结合3D打印技术实现精准、可控的骨缺损修复[6-7]。Maruyama等[8-9]研究还发现，MSCs与免疫细胞共同参与骨愈合的炎症阶段，相互拮抗以调节骨愈合过程。然而，调控MSCs成骨分化的分子机制尚未完全阐明，阻碍了临床上基于MSCs的骨缺损细胞疗法进一步发展[1]。因此，有必要进一步阐明MSCs成骨分化的分子调控机制。

Akt是PI3K的下游效应分子，PI3K/Akt信号通路在细胞增殖、分化、凋亡过程中起着重要作用，尤其是软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞和脂肪细胞[10]。PI3K/Akt信号通路的活化有助于抑制骨质疏松[11]。Peng等[12]发现当敲除Akt1和Akt2基因时，小鼠会表现出严重的生长发育障碍，包括骨骼发育迟缓、皮肤发育不全、骨骼肌萎缩和成脂障碍。环指蛋白11（ring finger protein 11，RNF11）是环指蛋白家族中的重要成员之一，由154个氨基酸构成，在生物进化过程中有高度保守性[13-15]。RNF11在生物体内发挥重要作用，包括细胞中的物质运输、信号传导以及肿瘤发生等[16]，其通过E3泛素连接酶属性参与多种生理及病理过程[14，17-19]。既往研究已发现RNF11在骨骼中表达丰度很高[20]，但其在骨骼发育中的作用却鲜有研究。本研究通过敲低RNF11在BMSCs中的表达后，检测Akt信号通路蛋白的表达，探讨RNF11如何参与调控BMSCs成骨分化过程。

1. 材料与方法

1.1. 主要试剂与仪器

健康人体新鲜骨髓样品由志愿者捐赠。293T细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）。DMEM培养基（HyClone公司，美国）；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore公司，德国）；Trizol（Invitrogen公司，美国）；重组慢病毒载体（上海吉凯基因医学科技股份有限公司）；PrimeScript Ⅱ cDNA合成试剂盒（D6210A）（Takara公司，日本）；茜素红（上海中乔新舟生物科技有限公司）；阿利新蓝、ALP、油红O染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。Merinton MA1000显微分光光度计（北京美林恒通仪器有限公司）；LightCycler480 PCR system（Roche公司，瑞士）；Immobilon Western Chemiluminescent辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）底物曝光（Millipore公司，德国）；Coulter流式细胞仪系统（Beckman Coulter公司，美国）；石蜡切片机、石蜡包埋机（Leica公司，德国）。

1.2. BMSCs分离、培养及鉴定

1.2.1. BMSCs分离培养

取健康人体新鲜骨髓样品，分离、纯化后接种至12孔板，使用含10%FBS的DMEM培养基进行重悬和培养（培养条件为37℃、5%CO2），每3天更换1次培养液。当细胞融合度达90%左右时进行传代，取第4代细胞进行以下实验。

1.2.2. BMSCs鉴定

① 流式细胞术：取获得的第4代细胞与抗CD14、CD45、HLA-DR、CD29、CD44、CD105抗体于4℃下孵育30 min，然后离心洗涤细胞，通过流式细胞仪系统进行分析。② BMSCs分化潜能检测：取获得的第4代细胞，行成骨、成软骨及成脂诱导分化14 d后，分别行茜素红染色、阿利新蓝染色和油红O染色观察。

1.3. RNF11在BMSCs成骨分化过程中的表达

1.3.1. BMSCs成骨分化规律

于BMSCs成骨诱导分化0、3、7、10、14 d，分别行茜素红染色［以562 nm处吸光度（A）值作为阳性染色钙结节数量］和ALP染色（检测ALP活性）定量检测，观察BMSCs的成骨分化规律。

1.3.2. Western blot检测RNF11在BMSCs成骨分化过程中的表达

于BMSCs成骨诱导分化第0、3、7、10、14天，使用RIPA裂解BMSCs，提取细胞裂解液，于4℃以离心半径20 cm、12 000 r/min离心30 min，然后加入Loading buffer混匀煮沸。用等量蛋白质上样至10%SDS-PAGE中，电泳分离，再转印至PVDF膜，加入5%脱脂奶粉封闭1 h；加入GAPDH、RNF11一抗（1∶1 000）孵育过夜，TBST洗涤3次；用HRP偶联的二抗（1∶3 000）室温孵育1 h，TBST洗涤3次；最后用Immobilon Western Chemiluminescent HRP底物曝光检测RNF11蛋白相对表达量。

1.4. 下调RNF11对BMSCs体外成骨分化能力的影响

1.4.1. 实验分组

取第4代BMSCs，分为空白对照组（A组）、空载慢病毒（Lv-NC）组（B组）和敲低RNF11（Lv-ShRNF11）组（C组）。A组不作任何处理，B、C组细胞分别转染慢病毒Lv-NC和Lv-ShRNF11。慢病毒转染方法：选一段最佳敲除序列构建慢病毒载体，然后通过转染将质粒包装至293T细胞中；转染72 h后以离心半径20 cm、12 000 r/min离心30 min，将含有慢病毒的上清液转移至另一管中并浓缩；将浓缩液与聚丙烯添加至BMSCs中孵育24 h，然后将培养基更换为成骨诱导分化培养基。

1.4.2. 观测指标

① 各组成骨诱导分化3、7、10、14 d，同上法采用Western blot检测RNF11蛋白表达，茜素红染色定量检测阳性钙结节数量，ALP染色检测ALP活性。② 实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）检测：各组成骨诱导分化14 d去除培养基，加入1 mL Trizol裂解细胞，室温孵育5 min，Trizol提取细胞RNA，用Merinton MA1000显微分光光度计在260 nm和280 nm处测量A值，用PrimeScript Ⅱ cDNA合成试剂盒（D6210A）生成cDNA模板，然后用LightCycler480 PCR system进行qRT-PCR检测，以GAPDH为内参，采用2−ΔΔCt法计算BMSCs成骨标志物Runx2、骨钙素（osteocalcin，OCN）及骨桥蛋白（osteopontin，OPN）的mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表 1.

Primer sequences of qRT-PCR genes

qRT-PCR各基因引物序列

基因
Gene 		引物序列（5'→3'）
Primer sequence (5'→3')
上游
Forward 		下游
Reverse
GAPDH GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT CTCCTTAATGTCACGCACGAT
Runx2 TCAACGATCTGAGATTTGTGGG GGGGAGGATTTGTGAAGACGG
OCN CACTCCTCGCCCTATTGGC CCCTCCTGCTTGGACACAAAG
OPN GAAGTTTCGCAGACCTGACAT GTATGCACCATTCAACTCCTCG
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1.5. RNF11对Akt信号通路的影响

1.5.1. RNF11与Akt信号通路蛋白相对表达量在BMSCs成骨分化过程中的表达

取第4代BMSCs行成骨诱导分化培养，培养0、7、14 d时，同上法采用Western blot检测RNF11及Akt信号通路蛋白相对表达量，后者以磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）/Akt比值表示。

1.5.2. 下调RNF11对Akt信号通路的影响

同1.4.1方法分组，于各组成骨诱导分化培养14 d，采用Western blot检测β-catenin、Akt及Smad1/5/8信号通路蛋白相对表达量，分别以p-β-catenin/β-catenin、p-Akt/Akt、p-Smad1/Smad1比值表示。

1.6. RNF11对Akt信号通路的影响机制

1.6.1. 实验分组

取第4代BMSCs，分为Lv-NC转染组（A1组）、Lv-ShRNF11转染组（B1组）和添加Akt信号通路激活剂SC79（3 μg/mL）的Lv-ShRNF11转染组（C1组）。慢病毒转染方法同1.4.1。转染后各组行成骨诱导分化。

1.6.2. 观测指标

各组成骨诱导分化14 d，同上法采用Western blot检测RNF11和Akt信号通路蛋白相对表达量，茜素红染色定量检测阳性钙结节数量，ALP染色检测ALP活性，qRT-PCR检测Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量。

1.7. 统计学方法

采用SPSS22.0统计软件进行分析。计量资料均符合正态分布，以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。

2. 结果

2.1. BMSCs鉴定

流式细胞术检测示，所培养细胞表面标志物CD14、CD45、HLA-DR表达呈阴性，而CD29、CD44及CD105表达呈阳性，与MSCs表面标志物表达模式一致。见图1。成骨诱导分化14 d后茜素红染色可见红色钙结节，成软骨诱导分化14 d阿利新蓝染色可见深蓝色结节，成脂诱导分化14 d油红O染色可见红色脂滴。见图2。提示分离获得的细胞为BMSCs。

图 1.

Identification of BMSCs by flow cytometry

BMSCs流式细胞术鉴定

a. CD14；b. CD45；c. HLA-DR；d. CD29；e. CD44；f. CD105

a. CD14;   b. CD45;   c. HLA-DR;   d. CD29;   e. CD44;   f. CD105

图 1

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图 2.

Identification of multipotential differentiation of BMSCs

BMSCs各向分化潜能鉴定

a. 茜素红染色（×40）；b. 阿尔新蓝染色（×100）；c. 油红O染色（×40）

a. Alizarin red staining (×40); b. Alcian blue staining (×100); c. Oil red O staining (×40)

图 2

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2.2. RNF11在BMSCs成骨分化过程中的表达

随BMSCs成骨诱导分化时间延长，茜素红染色阳性钙结节数量和ALP活性均逐渐增加，成熟程度逐渐上升，各时间点间差异均有统计学意义（P<0.05），符合MSCs成骨的一般规律。见图3、4。Western blot检测示，随BMSCs成骨诱导分化时间延长，RNF11蛋白相对表达量亦呈逐渐增加趋势，各时间点间差异均有统计学意义（P<0.05），提示RNF11可能参与了BMSCs成骨分化过程。见图5。

图 3.

Observation on the osteogenic differentiation regularity of BMSCs (×40)

BMSCs成骨分化规律观察（×40）

从左至右分别为培养0、3、7、10、14 d　a. 茜素红染色；b. ALP染色

From left to right for cultured 0, 3, 7, 10, and 14 days a. Alizarin red staining; b. ALP staining

图 3

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图 4.

Quantitative detection of BMSCs osteogenesis

BMSCs成骨分化定量检测

a. 茜素红染色；b. ALP活性

a. Alizarin red staining; b. ALP activity

图 4

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图 5.

Expression of RNF11 during BMSCs osteogenesis detected by Western blot

Western blot检测RNF11在BMSCs成骨分化过程中的表达

a. 电泳图　Mr：相对分子质量　1：0 d　2：3 d　3：7 d 4：10 d　5：14 d；b. RNF11蛋白相对表达量

a. Electrophoresis　Mr: Relative molecular weight　1: 0 day　2: 3 days　3: 7 days　4: 10 days　5: 14 days; b. RNF11 protein relative expression

图 5

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2.3. 下调RNF11对BMSCs体外成骨分化能力的影响

各组成骨诱导分化14 d检测示，C组RNF11蛋白相对表达量、阳性钙结节数量、ALP活性及Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量均显著低于A、B组，差异均有统计学意义（P<0.05）。提示下调BMSCs中RNF11表达将抑制其成骨分化能力。见图6、7。

图 6.

The influence of knockdown RNF11 on osteogenic differentiation of BMSCsin vitro

下调RNF11对BMSCs体外成骨分化能力的影响

a. Western blot检测电泳图　Mr：相对分子质量　1：A组　2：B组　3：C组；b. 茜素红染色（×40）　从左至右依次为A、B、C组；c. ALP染色（×40）　从左至右依次为A、B、C组

a. Electrophoresis of Western blot　Mr: Relative molecular weight　1: Group A　2: Group B　3: Group C; b. Alizarin red staining (×40) 　From left to right for groups A, B, and C, respectively; c. ALP staining (×40) 　From left to right for groups A, B, and C, respectively

图 6

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图 7.

Quantitative analysis of the influence of knockdown RNF11 on osteogenic differentiation of BMSCsin vitro

下调RNF11对BMSCs体外成骨分化能力影响定量分析

*P<0.05　a. RNF11蛋白相对表达量；b. 茜素红染色；c. ALP活性；d～f. qRT-PCR检测Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量

*P<0.05　a. RNF11 protein relative expression; b. Alizarin red staining; c. ALP activity; d-f. Relative expressions of Runx2, OCN, and OPN mRNA detected by qRT-PCR

图 7

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2.4. RNF11对Akt信号通路的影响

随BMSCs成骨诱导分化时间延长，RNF11与Akt信号通路蛋白相对表达量均逐渐增加，各时间点间差异有统计学意义（P<0.05）。见图8。

图 8.

Western blot detection of RNF11 and Akt signaling pathway protein expressions before and after osteogenic differentiation

Western blot检测成骨分化前后RNF11与Akt信号通路蛋白表达

a. 电泳图　Mr：相对分子质量　1：0 d　2：7 d　3：14 d；b. RNF11蛋白相对表达量；c. Akt信号通路蛋白相对表达量

a. Electrophoresis　Mr: Relative molecular weight　1: 0 day　2: 7 days　3: 14 days; b. RNF11 protein relative expression; c. Relative protein expression of Akt signaling pathway

图 8

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下调RNF11实验中，各组β-catenin及Smad1/5/8信号通路蛋白相对表达量差异均无统计学意义（P>0.05）；C组Akt信号通路蛋白相对表达量显著低于A、B组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图9。提示RNF11可能是通过影响Akt信号通路激活来参与BMSCs的体外成骨分化过程。

图 9.

The influence of knockdown RNF11 on Akt signaling pathway

下调RNF11对Akt信号通路的影响

a. Western blot检测电泳图　Mr：相对分子质量　1：A组　2：B组　3：C组；b～d. 分别为β-catenin、Akt、Smad1/5/8信号通路蛋白相对表达量　 *P<0.05

a. Electrophoresis of Western blot　Mr: Relative molecular weight 1: Group A　2: Group B　3: Group C; b-d. Protein relative expressions of β-catenin, Akt, and Smad1/5/8 signaling pathway, respectively*P<0.05

图 9

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2.5. RNF11对Akt信号通路的影响机制

B1、C1组RNF11蛋白相对表达量显著低于A1组，差异有统计学意义（P<0.05）；B1、C1组间差异无统计学意义（P>0.05）。与A1、C1组比较，B1组Akt信号通路蛋白相对表达量、阳性钙结节数量、ALP活性及成骨标志物Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量均显著下调，差异有统计学意义（P<0.05）；添加了SC79的C1组可逆转上述效果，与A1组比较上述指标差异均无统计学意义（P>0.05）。见图10、11。提示RNF11可能通过激活Akt信号通路促进BMSCs成骨分化。

图 10.

The influence of activating Akt signaling pathway on osteogen

激活Akt信号通路对下调RNF11后BMSCs成骨分化的影响

a. Western blot检测电泳图　Mr：相对分子质量　1：A1组　2：B1组　3：C1组；b. 茜素红染色（×40）　从左至右依次为A1、B1、C1组；c. ALP染色（×40）　从左至右依次为A1、B1、C1组

a. Electrophoresis of Western blot　Mr: Relative molecular weight　1: Group A1　2: Group B1　3: Group C1; b. Alizarin red staining (×40)　From left to right for groups A1, B1, and C1, respectively; c. ALP staining (×40)　From left to right for groups A1, B1, and C1, respectively

图 10

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图 11.

Quantitative analysis of the influence of activating Akt signaling pathway on osteogenic differentiation of BMSCs after knockdown RNF11

激活Akt信号通路对下调RNF11后BMSCs成骨分化影响的定量分析

*P<0.05　a. RNF11蛋白相对表达量；b. Akt信号通路蛋白相对表达量；c. 茜素红染色；d. ALP活性；e～g. qRT-PCR检测Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量

*P<0.05　a. Relative protein expression of RNF11; b. Relative protein expression of Akt signaling pathway; c. Alizarin red staining; d. ALP activity; e-g. Relative expressions of Runx2, OCN, and OPN mRNA detected by qRT-PCR

图 11

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3. 讨论

组织工程骨技术修复骨缺损虽然目前仍在研究阶段，但有极大临床应用前景。BMSCs作为组织工程骨的三大要素之一，研究其成骨分化过程的调控因子和机制一直是此领域的热点。

RNF11是环指蛋白家族中的重要成员之一，通过PY基序结合HECT型E3泛素连接酶Smurf2和AIP4，介导多种细胞蛋白的降解[21]。尽管已有研究表明RNF11减少或功能受损可能与神经退行性疾病有关[22-23]，但与BMSCs成骨分化相关研究较少。Gao等[20]在研究成骨机制过程中发现，在小鼠成骨发育的体外模型中，胚胎成骨过程中最早阶段表达的转录因子Est1能够结合RNF11的启动子，且RNF11水平与成骨分化程度成正相关，但并未深入研究。本研究中，我们发现RNF11在BMSCs成骨分化过程中表达明显上调，且与之成正相关；以慢病毒构建敲低RNF11的BMSCs模型，茜素红、ALP染色示C组成骨分化程度低于A、B组，提示RNF11参与BMSCs成骨分化过程，与Gao等的研究结果一致。

为进一步探究RNF11如何影响BMSCs成骨分化，分别检测A、B、C组与BMSCs成骨分化密切相关的Akt、Smad1/5/8、β-catenin信号通路的激活水平[24]。Western blot结果显示，相较于A、B组，C组的Akt信号通路显著受抑制，而对Smad1/5/8和β-catenin信号通路激活水平无明显影响，且RNF11蛋白表达和Akt信号通路激活水平均与BMSCs成骨分化程度成正相关。提示在此过程中两者可能共同发挥作用。为探究两者的关系，我们在实验中添加Akt信号通路激活剂SC79[25]，茜素红、ALP染色以及对成骨标志物Runx2、OCN及OPN mRNA的定量分析结果显示，C1组成骨分化水平略低于A1组，但明显高于B1组。分析原因可能是RNF11在BMSCs分化过程中通过激活Akt信号通路表达来促进成骨分化，成骨细胞合成大量Runx2、OCN及OPN，因此下调RNF11时，Akt信号通路激活受抑制，成骨分化水平降低；添加SC79使Akt信号通路激活水平升高后，成骨分化水平重新升高，但激活不完全，因而略低于A1组。

RNF11在机体还具有抑制炎症反应的作用。据报道，由A20-TAX1BP1-Itch-RNF11共同构成的A20泛素编辑酶复合物能够下调NF-κB信号通路，确保炎症反应的短暂性，其中RNF11的PPXY基序负责招募Itch到TAX1BP1形成A20泛素编辑酶复合物[26]。由此推断，若将RNF11运用到BMSCs对骨缺损的临床治疗中，可能有一定抗炎作用，能减轻机体损伤，减少其他抗炎药物的使用，但有待进一步实验研究明确。

近年有很多关于Akt信号通路调控成骨分化的分子机制研究。Zhao等[27]研究显示巨噬细胞MSR1通过激活Akt信号通路促进BMSCs成骨分化，Yang等[28]研究表明miRNA-21通过激活Akt信号通路促进BMSCs成骨分化来促进犬颌面骨再生。提示Akt信号通路调控成骨分化受到多种因素的共同作用，分子间相互协同，共同完成骨修复过程。

综上述，本研究结果表明RNF11通过正向调控Akt信号通路激活水平促进BMSCs向成骨细胞分化。但本研究也存在不足之处：首先，实验采用离体培养的BMSCs，未在动物体内验证，可能会造成实验结果偏倚，也无法验证将其运用于机体时是否会对其他系统产生影响。第二，未探究在病理条件下RNF11对BMSCs的成骨分化作用是否会受影响。第三，未探究RNF11在BMSCs成骨分化其他重要过程中的作用，如破骨细胞形成、炎症等。以上不足有待进一步研究完善。

作者贡献：邓雯负责研究设计、数据收集整理、统计分析；龙婷负责论文撰写；杜英负责对文章的知识性内容作批评性审阅。

利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。

机构伦理问题：研究方案经郑州大学生命科学伦理审查委员会批准。

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Articles from Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery are provided here courtesy of Sichuan University

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