牙龈卟啉单胞菌上调钙结合蛋白1促进牙龈上皮细胞增殖

Abstract

Objective

This study aims to investigate the effect of calbindin 1 on the proliferation and apoptosis of gingival epithelial cells affected by Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) in vitro.

Methods

A model of P. gingivalis infecting CA9-22 was established in vitro. At 24 h after infection, the expression of calbindin 1 (CALB1) was detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, Western blot, and immunofluorescence analyses. The expression of CALB1 was further inhibited by RNA interference. Cell proliferation was detected by BrdU analysis, and cell apoptosis was detected by caspase 3 activity. The expression of MDM2 and p53 was detected by Western blot analysis.

Results

P. gingivalis infection upregulated the expression of CALB1 in CA9-22 cells with multiplicity-dependent manner. CALB1 promoted the proliferation of CA9-22 cells, increased the expression of MDM2, and inhibited the expression of p53. Inhibiting CALB1 expression did not affect the inhibitory effect of P. gingivalis infection on CA9-22 apoptosis.

Conclusion

P. gingivalis infection can promote the proliferation of CA9-22 cells by increasing CALB1 expression. The related mechanism may be associated with MDM2-p53.

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）约占口腔癌的90%[1]。吸烟、酒精和病毒感染（如人乳头瘤病毒）是OSCC的独立危险因素[2]–[3]，但仍有15%的病例病因不明[4]。近年来，牙周致病菌被认定为OSCC的一个独立危险因素[3]。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）是牙周关键致病菌。Katz等[5]研究发现，P. gingivalis在口腔鳞状细胞癌组织中的检出量显著高于正常牙龈组织。P. gingivalis能够促进牙龈上皮细胞增殖，抑制凋亡，并诱导上皮—间充质转化，促进肿瘤的发生、发展[6]。细胞增殖是细胞通过分裂，使细胞数目增多，并将遗传信息传给子代细胞，细胞过度增殖则会导致恶性肿瘤。因此，探究P. gingivalis促进牙龈上皮细胞增殖的机制具有重要意义。

钙结合蛋白1（calbindin 1，CALB1）和钙结合蛋白2（calbindin 2，CALB2）同是EF-手型家族的钙结合蛋白[7]。CALB1在谷氨酸受体激活后可调节钙离子内流，在正常骨细胞、成骨细胞和多巴胺能神经元[8]–[10]以及骨肉瘤细胞U2OS、非小细胞肺癌细胞和卵巢癌细胞等肿瘤细胞[11]–[13]中抑制多种促凋亡信号通路诱导的细胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，在细胞凋亡中起着不可替代的作用，常用于测定细胞凋亡[14]。CALB1能够调节肿瘤抑制蛋白p53。在卵巢癌细胞中，CALB1可作用MDM2，促进p53与MDM2的相互作用，导致p53蛋白降解[12]。p53蛋白水平及其转录活性受到MDM2调控，而MDM2的基因表达受到p53调控，形成负反馈通路[15]。目前P. gingivalis对CALB1表达的影响尚无报道。CALB2首次在视网膜中被发现，由视网膜神经节细胞亚群、暗斑和水平细胞表达[16]。CALB2在皮肤表皮细胞和皮肤腺上皮表达，并受到甲状腺激素紊乱的显著影响[17]。成人Malassez上皮亚群中也有表达，是成釉细胞瘤上皮、子宫内膜间质细胞和间皮细胞标志物[18]–[21]。本研究用CA9-22细胞体外模拟牙龈上皮细胞，探究P. gingivalis感染对CA9-22中CALB1表达的影响，以及CALB1在P. gingivalis影响细胞增殖和细胞凋亡中的作用，并初步探讨其相关机制。

1. 材料和方法

1.1. 实验材料

P. gingivalis ATCC 33277、P. gingivalis W83、戈登链球菌（Streptococcus gordonii, S. gordonii）DL1由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。CA9-22细胞株购买自商城北纳创联生物科技有限公司。胰蛋白胨大豆肉汤培养基、脑心浸液培养基、高容量逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应 （quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）试剂、Taqman探针（Thermo Fisher Scientific公司，美国），DMEM培养基、胎牛血清（Gibco公司，美国），CALB1抗体、MDM2抗体、p53抗体、GAPDH抗体（CST公司，美国），Trizol（Invitrogen公司，美国），RNAeasy plus试剂盒（Qiagen公司，德国），LipoJet转染试剂（SignaGen公司，美国），5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）细胞增殖酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（Abcam公司，英国），细胞凋亡荧光底物（EnzChek公司，美国），RIPA缓冲液（Roche公司，美国），BCA蛋白定量试剂盒、电化学发光试剂（Invitrogen公司，美国）。

1.2. 实验设计及分组

1）探究P. gingivalis感染对CA9-22细胞CAL-B1表达的影响。①P. gingivalis感染对CA9-22细胞CALB1、CALB2 mRNA表达的影响。实验分为未感染组、P. gingivalis ATCC 33277感染组、P. gingivalis W83感染组、S. gordonii DL1感染组，采用qPCR法检测CALB1、CALB2 mRNA表达。②P. gingivalis感染对CA9-22细胞CALB1 蛋白表达的影响。实验分为对照组和P. gingivalis ATCC 33277感染组[包括感染复数（multiplicity of infection，MOI）10、50、100三亚组]，采用免疫印迹法检测CALB1蛋白表达。③大肠杆菌LPS对CA9-22细胞CALB1表达的影响，实验分为未处理组和大肠杆菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）处理组，采用qPCR法检测CALB1 mRNA表达。

2）探究CALB1基因对P. gingivalis ATCC 33277感染时CA9-22细胞增殖和凋亡的影响。细胞增殖实验分为未感染siRNA-Con组（未感染+siRNA沉默空白基因）、P. gingivalis感染siRNA-Con组（P. gingivalis感染+siRNA沉默空白基因）、未感染siRNA-CALB1组（未感染+siRNA沉默CALB1基因）、P. gingivalis感染siRNA-CALB1组（P. gingivalis感染+siRNA沉默CALB1基因），采用BrdU进行细胞增殖分析。细胞凋亡实验时分为未感染组、P. gingivalis感染组、P. gingivalis感染siRNA-Con组、P. gingivalis感染siRNA-CALB1组，采用Caspase-3活性测定法分析细胞凋亡情况。

3）探究CALB1基因对MDM2和p53蛋白表达的影响。实验分为未感染siRNA-Con组、P. gingivalis感染siRNA-Con组、未感染siRNA-CALB1组、P. gingivalis感染siRNA-CALB1组，其中P. gingivalis感染组中均为P. gingivalis ATCC 33277感染。采用免疫印迹法检测MDM2、p53蛋白表达。

1.3. 细菌和细胞培养

P. gingivalis培养在胰蛋白胨大豆肉汤培养基补充酵母提取物（1 mg·mL⁻¹）、氯高铁血红素（5 µg·mL⁻¹）和维生素K （1 µg·mL⁻¹）中，37 °C厌氧培养；S. gordonii培养在脑心浸液培养基中，37 °C厌氧培养。

使用含10%胎牛血清和1%双抗（青霉素/链霉素）的DMEM培养基，将CA9-22细胞培养于5%CO₂、37 °C恒温条件下。隔日换液，2~3 d后使用胰蛋白酶消化贴壁细胞，DMEM终止消化并离心后，重悬接种于培养皿中进行细胞传代。

将细胞培养至约80%时，采用MOI 10、50、100的细菌刺激1 h，然后更换新鲜DMEM培养基继续培养23 h，收集细胞用于实验[22]。

1.4. qPCR

Trizol法提取细胞总RNA后，进一步采用RNAeasy plus试剂盒纯化RNA。使用高容量逆转录试剂盒将RNA（2 µg）反转录为cDNA后进行qPCR。将加好样品的96孔板放在ABI Stepone Plus型荧光定量PCR仪进行反应。引物序列：CALB1上游5′-ATGGCAGAATCCCACCTGCA-3′，下游5′-CTAGTTATCCCCAGCACAGAG-3′；CALB2上游5′-CCTGCACCTGGCCGAGCTGACG-3′，下游5′-GCTGGAGCCCACGTGCTGCCTG-3′；GAPDH上游5′-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游5′-CTCTTGTGCTCTTGCTGGG-3′。设置PCR循环条件：95 °C 10 min，95 °C 15 s，60 °C 15 s，共40个循环。自动计算阈值，每个反应体系中荧光信号达到设定阈值经历的循环数为循环阈值（Ct）。使用2^ΔΔCt法对CALB1和CALB2基因的表达进行相对定量分析。

1.5. RNA干扰

细胞生长到约60%时，通过Lipojet转染试剂将siRNA转染至CA9-22细胞，转染24 h后，更换细胞培养基并加入细菌刺激24 h。收集细胞，qPCR检测目标基因敲除情况。

1.6. 免疫印迹法

使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液冰上充分裂解细胞，低温离心后取上清，采用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量。配置12%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，电泳转膜后，使用5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭1 h后，分别加入CALB1、MDM2、p53及GAPDH兔抗人一抗，4 °C过夜。TBST洗膜3次后加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔二抗，室温孵育1 h再次TBST洗膜3次，电化学发光法（electrochemiluminescence，ECL）显色。

1.7. 免疫荧光法

CA9-22细胞在腔室载玻片上生长至60%时，采用P. gingivalis ATCC 33277（MOI=100）刺激细胞24 h，磷酸盐缓冲液洗涤3次，4%多聚甲醛固定，Triton X-100通透后，使用2%BSA封闭45 min，加入CALB1兔抗人一抗孵育1 h，洗涤后将样本分别与Alexa Fluor 488标记的羊抗兔二抗和Texas Red™-X鬼笔环肽共孵育1 h，最后使用含DAPI染料的中性树脂封片。通过Leica SP8共聚焦显微镜对样本进行扫描，并采集图像。

1.8. BrdU细胞增殖分析

在P. gingivalis ATCC 33277（MOI=100）感染结束前2 h，用10 µmol·L⁻¹ BrdU标记CA9-22细胞。磷酸盐缓冲液清洗2次后用70%乙醇固定细胞30 min，磷酸盐缓冲液再次清洗后进行染色。用过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG孵育细胞30 min，磷酸盐缓冲液清洗后用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺过氧化物酶底物室温避光孵育30 min。加入终止液，检测OD_{450 nm}。

1.9. Caspase-3活性测定

将1 µg·mL⁻¹喜树碱（camptothecin，CAM）加入CA9-22细胞培养液中诱导细胞凋亡4 h。 P. gingivalis感染组加入P. gingivalis ATCC 33277（MOI=100）培养24 h，收集、裂解细胞后，通过Enz-Chek Caspase-3分析试剂盒检测Caspase-3活性。

1.10. 统计学分析

采用GraphPad Prism V8软件对数据进行AN-OVA和Tukey多重比较检验。

2. 结果

2.1. P. gingivalis感染促进CA9-22细胞CALB1的表达

qPCR实验结果显示，与未感染组相比，P. gingivalis ATCC 33277感染组和P. gingivalis W83感染组CA9-22细胞中CALB1表达升高，差异有统计学意义（P<0.05）；S. gordonii DL1感染组CALB1表达无明显变化。与未感染组相比，P. gingivalis感染组和S. gordonii感染组CA9-22细胞中CALB2表达均无明显变化（图1A）。与未处理组相比，大肠杆菌LPS处理组CA9-22细胞中CALB1表达升高（图1B）。

图 1. qPCR检测CA9-22细胞中CALB1和CALB2的表达.

Fig 1 Detecting the expression of CALB1 and CALB2 in CA9-22 cells by qPCR

A：P. gingivalis和S. gordonii感染对CALB1和CALB2 mRNA表达的影响；B：大肠杆菌LPS对CALB1 mRNA表达的影响。与对照组相比，****P<0.000 1，N.S.为差异没有统计学意义。

免疫印迹法检测CA9-22细胞中CALB1蛋白表达结果显示，与对照组相比，P. gingivalis ATCC 33277感染组CA9-22细胞中CALB1表达升高，各条带呈MOI依赖性（图2A、B）。免疫荧光检测显示，P. gingivalis ATCC 33277感染组中CALB1蛋白荧光较对照组更明显（图2C）。

图 2. CA9-22细胞中CALB1蛋白表达.

Fig 2 Expressions of CALB1 in CA9-22 cells

A：免疫印迹；B：蛋白表达定量分析；C：免疫荧光。

2.2. CALB1影响P. gingivalis诱导的CA9-22细胞增殖

BrdU实验结果见图3A。与未感染siRNA-Con组相比，P. gingivalis感染siRNA-Con组的吸光度值增加；与未感染siRNA-CALB1组相比，P. gingivalis感染siRNA-Con组的吸光度值无明显变化。可见，P. gingivalis ATCC 33277感染促进了CA9-22细胞增殖，而降低CALB1的表达后可抑制P. gingivalis ATCC 33277对CA9-22细胞增殖的促进作用。

图 3. CALB1基因对P. gingivalis感染时CA9-22细胞增殖和凋亡的影响.

Fig 3 The effects of CALB1 on proliferation and apoptosis of CA9-22 infected with P. gingivalis

A：CALB1基因对P. gingivalis感染时CA9-22细胞增殖的影响；与未感染siRNA-Con组相比，****P<0.000 1。B：CALB1基因对P. gingivalis感染时CA9-22细胞凋亡的影响；与未感染组相比，****P<0.000 1，N.S.为差异没有统计学意义。

细胞凋亡实验结果见图3B。与未感染组相比，P. gingivalis感染组，P. gingivalis感染siRNA-Con组和P. gingivalis感染siRNA-CALB1组中CA9-22细胞Caspase 3活性均明显降低（P<0.00 1）；与P. gingivalis感染siRNA-Con组相比，P. gingivalis感染siRNA-CALB1组CA9-22细胞Caspase 3活性无明显变化。可见，下调CALB1表达不影响P. gingivalis感染对CA9-22凋亡的抑制作用。

2.3. CALB1通过MDM2-p53途径调控细胞增殖

免疫印迹法和蛋白表达定量分析检测结果见图4。与未感染组相比，P. gingivalis感染后CA9-22细胞MDM2表达升高，p53表达降低。与P. gingivalis感染siRNA-Con组相比，P. gingivalis感染siRNA-CALB1组CA9-22细胞MDM2表达降低，p53表达升高。

图 4. CALB1对CA9-22细胞中MDM2和p53表达的影响.

Fig 4 The effects of CALB1 on the expression of MDM2 and p53 in CA9-22

A：免疫印迹，1、2、3、4分别为未感染siRNA-Con组、未感染siRNA-CALB1组、P. gingivalis感染siRNA-Con组、P. gingivalis感染siRNA-CALB1组；B：蛋白表达定量分析，横坐标中1、2、3、4分别为未感染siRNA-Con组、未感染siRNA-CALB1组、P. gingivalis感染siRNA-Con组、P. gingivalis感染siRNA-CALB1组。

3. 讨论

P. gingivalis是牙周关键致病菌，可内化于上皮细胞，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，诱导上皮—间充质转化，引发细胞异常迁移，被认为是P. gingivalis引起上皮细胞功能紊乱的重要原因[6]。钙结合蛋白是一种对钙离子有高度亲和性的蛋白质，通过钙离子信号传导，调控细胞活动[23]。本课题从qPCR、免疫印迹、免疫荧光和RNA干扰等多个角度进行研究，结果表明P. gingivalis感染可导致CA9-22细胞CALB1表达显著增加，而降低CALB1的表达，可以显著抑制P. gingivalis诱导的细胞增殖，其机制可能与MDM2-p53途径有关。

钙结合蛋白作为细胞第二信使系统的重要成分，参与调控细胞增殖和细胞凋亡等多种细胞活动。研究[13]表明，CALB1表达下调后，骨肉瘤U2OS细胞增殖被显著抑制，细胞凋亡被促进。本研究发现，P. gingivalis感染对CA9-22细胞中CALB2的表达无显著影响，但可导致CALB1表达显著上调，并促进细胞增殖。降低CALB1表达会显著抑制P. gingivalis诱导的细胞增殖。这表明CALB1在P. gingivalis促进CA9-22细胞增殖过程中发挥重要作用。在细胞凋亡方面，本研究发现，P. gingivalis可以抑制CAM诱导的CA9-22凋亡，但下调CALB1表达对CA9-22细胞凋亡无显著影响，这提示P. gingivalis对CA9-22细胞凋亡的抑制作用不依赖于CALB1。

肿瘤抑制蛋白p53参与细胞增殖、代谢、衰老和凋亡等过程的大量基因的主转录调节因子，在预防细胞恶变中发挥重要作用。P. gingivalis的LPS可异常调节p53，并通过影响其下游炎性基因的表达，促进细胞增殖[24]。P. gingivalis的FimA菌毛蛋白可以降低p53水平，加速原代牙龈上皮细胞的细胞周期进展，促进细胞增殖[25]。p53的稳定性和活性受CHK2、Aurora A、CK1δ、CK1ε等激酶的影响。在P. gingivalis感染的牙龈上皮细胞中，这些激酶被抑制，进而影响P53的活性[26]–[27]。由此可见，P. gingivalis可以通过调节p53促进细胞增殖。MDM2不仅可与p53的反式激活结构域结合抑制p53[28]，也可以通过E3泛素连接酶的作用，将p53经泛素途径降解[12]。Cao等[12]通过蛋白质体外结合实验研究发现，在卵巢癌细胞中，CALB1可与内源性MDM2结合，促进MDM2和p53的相互作用，抑制p53。本研究免疫印迹法结果显示，P. gingivalis感染的CA9-22细胞中MDM2表达升高而p53表达降低；当降低CALB1表达后，MDM2表达降低，而p53表达升高，表明P. gingivalis感染促进CALB1表达，CALB1可能作为辅助激活因子通过影响MDM2-p53进而促进CA9-22细胞增殖。

综上所述，P. gingivalis可以通过上调CALB1的表达诱导CA9-22细胞增殖，其机制可能与MDM2-p53通路有关。本研究结果为P. gingivalis促进上皮功能紊乱机制的研究提供了新的靶点和思路。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金（81600871）

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81600871).