LOC103693069对BMSCs缺氧性凋亡的作用研究

Abstract

Objective

To investigate the effect of LOC103693069 on hypoxic apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs).

Methods

BMSCs from 1-week-old Sprague Dawley rat bone marrow were isolated, cultured, and passaged by the whole bone marrow adherent culture method. After identification of adipogenic, chondrogenic, and osteogenic differentiation, the 3rd generation cells were treated with hypoxia under 5%O₂, 1%O₂, and anaerobic conditions. After 48 hours, the cell viability, apoptosis, and apoptosis-related proteins [hypoxia inducible factor 1α (HIF-1α), Caspase-3, B cell lymphoma/leukemia 2 (Bcl-2)] expressions were detected, and normal BMSCs were used as controls. Based on the research results, the concentration group with the most obvious apoptosis was selected and used for subsequent experiments. After 48 hours of hypoxia treatment, BMSCs were taken and analyzed by gene chip and real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) to screen the most significantly down-regulated gene and construct their high-expression, low-expression, and negative control lentiviruses; BMSCs were transfected with the different lentiviruses, respectively. After qRT-PCR detection confirmed that the transfection was successful, the BMSCs were treated with hypoxia for 48 hours to observe the cell viability and the expressions of apoptosis-related proteins.

Results

After cell viability, apoptosis, and apoptosis-related proteins were detected, cell apoptosis was the most significant under anaerobic conditions after 48 hours. The above indicators were significantly different from other groups (P<0.05), and this group was used for treatment conditions for subsequent experiments. Gene chip analysis showed that after 48 hours of hypoxia treatment, AC125847.1, LOC102547753, AABR07017208.2, and LOC103693069 were significantly down-regulated in BMSCs, and the expressions of LOC103693069 was the most significant down-regulation detected by qRT-PCR (P<0.05). It was selected to construct lentivirus and transfect BMSCs. Afterwards, qRT-PCR detection showed the successful transfection into the cells. After hypoxia treatment, the apoptosis rate and the expressions of apoptosis-related proteins of BMSCs overexpressed by the gene were significantly reduced (P<0.05).

Conclusion

LOC103693069 can relieve the hypoxic apoptosis of BMSCs.

近年来， BMSCs移植治疗缺血缺氧性疾病的体外研究已较多，并取得一定进展，但体内移植疗效尚不确切。有研究发现外源性BMSCs移植至体内后，在缺氧环境中会发生大量凋亡，严重影响了修复作用的发挥^[1-2]。如何抑制BMSCs缺氧性凋亡成为亟待解决的问题，学者们提出了缺氧预处理、改善线粒体功能、清除活性氧等方法来抑制细胞凋亡，但效果均不理想^[3-4]。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是长度超过200个核苷酸的非编码 RNA，研究表明其对BMSCs基因表达具有广泛调控作用^[5-6]，在缺血缺氧相关疾病中对细胞增殖、凋亡具有重要调控作用^[7]。本研究以大鼠BMSCs为研究对象，筛选缺氧处理后下调最明显基因，并构建慢病毒转染BMSCs，观察细胞活性，探讨其对BMSCs缺氧性凋亡的影响，以期为调控BMSCs缺氧性凋亡提供新思路。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及主要试剂、仪器

1周龄SD大鼠30只，雌雄不限，体质量10～20 g，由贵州医科大学实验动物中心提供。

L-DMEM 培养基、FBS、青链霉素、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO 公司，美国）；成软骨、成脂、成骨诱导培养基（Cyagen 公司，美国）；AnnexinⅤ/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡检测试剂盒（BD 公司，美国）；一步法逆转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技术有限公司）；油红O染液、阿利新蓝染液、ALP染液（北京索莱宝科技有限公司）；低氧诱导因子 1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、B细胞淋巴瘤/白血病基因2（B cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2）抗体（Abcam公司，美国）；线粒体膜电位检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）。

CO₂培养箱（Thermo公司，美国）；倒置荧光显微镜（Olympus公司，日本）；激光共聚焦显微镜（Leica公司，德国）；PCR仪（Eppendorf公司，德国）；LightCycler R 480Ⅱ型实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）仪（Roche 公司，瑞士）；NanoDrop2000c微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；多功能酶标仪（EnSpire 公司，新加坡）。

1.2. BMSCs分离培养及鉴定

30只SD大鼠腹腔注射1%戊巴比妥溶液麻醉后，取双侧股骨及胫骨，采用L-DMEM 培养基冲洗骨髓至培养皿中；以离心半径15 cm、1 000 r/min 离心5 min；弃上清液，取5 mL 含 10%FBS的L-DMEM完全培养基重悬后接种于25 cm²培养瓶中，于37℃、5%CO₂条件下培养，2～3 d后首次全量换液，以后每3天换液1次。待细胞长满瓶底80%左右，予0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA进行传代。取第3代细胞诱导分化2周后，经油红O、阿利新蓝和ALP染色鉴定具有成脂、成软骨和成骨分化潜能，培养细胞为BMSCs。取第3代BMSCs进行后续实验。

1.3. BMSCs缺氧模型制备及观测

1.3.1. 实验分组及模型制备方法

将BMSCs随机分为4组：对照组、5%O₂组（5%CO₂、90%N₂和5%O₂）、1%O₂组（5%CO₂、94%N₂和1%O₂）和无氧组（5%CO₂、95%N₂）。其中，对照组为正常培养细胞；各缺氧培养组采用细胞缺氧培养箱，通过气体监测器设置对应CO₂、N₂、O₂浓度培养，模拟体内缺氧条件^[8]。

1.3.2. 观测指标

① CCK-8法检测细胞活性：取BMSCs调整为浓度 1×10⁵个/mL的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μL。按上述方法分组（每组3个复孔）并培养48 h后，倒置荧光显微镜下观察细胞形态，按CCK-8试剂盒操作说明采用酶标仪测定各孔450 nm处吸光度（A）值。

② 线粒体膜电位检测：取BMSCs调整为浓度1×10⁷个/mL的细胞悬液，接种于共聚焦培养皿，每孔1 mL。按上述方法分组（每组3个复孔）并培养48 h后，PBS洗涤3遍。取100 μL 10倍培养缓冲液加900 μL灭菌去离子水稀释，预热至37℃后吸取500 μL加入1 μL JC-1，涡旋混匀配成JC-1工作液。取500 μL，JC-1工作液将细胞均匀悬浮，37℃、5%CO₂培养箱孵育30 min，PBS洗涤3遍；激光共聚焦显微镜下采集荧光，凋亡细胞呈绿色荧光，正常细胞呈红色荧光。Image J软件计算红/绿荧光比值，表示细胞凋亡情况。

③ 流式细胞仪检测：取BMSCs调整为浓度5×10⁴个/mL的细胞悬液，接种于T25培养瓶，待细胞长满瓶底70%，按上述方法分组并培养48 h。以不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化细胞后，以离心半径15 cm、1 000 r/min离心5 min，加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，然后依次加入5 μL AnnexinⅤ、5 μL PI，室温避光孵育5 min，轻轻涡旋细胞并室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

④ Western blot检测：参照流式细胞仪检测方法取细胞分组及培养48 h后，加入含1%蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，将蛋白与上样缓冲液混匀、加热，PAGE 凝胶电泳。用电转移仪将蛋白转移至PVDF膜，置于封闭液。加入一抗（HIF-1α、Caspase-3、Bcl-2）4℃孵育过夜，二抗孵育2 h；ECL 化学发光显影。以β-actin作为内参，目的条带与内参条带的灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。实验重复3次。

结合上述观测结果，选择细胞凋亡最明显的浓度组进行后续实验。

1.4. 缺氧BMSCs目标基因筛选及分析

1.4.1. 缺氧BMSCs基因差异分析

取经筛选浓度缺氧处理48 h的BMSCs，通过基因芯片进行基因筛选，由上海吉凯基因科技有限公司完成。然后检索Gene Expression Omnibus（GEO）数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），获得与BMSCs相关的微阵列。采用Limma 包分析BMSCs表达芯片，通过差异倍数（fold-change，FC）选择差异表达基因，筛选标准为|log2 FC|>2和P<0.05。采用pheatmap构建差异基因热图。

1.4.2. qRT-PCR检测

对筛选出的表达下调基因进行qRT-PCR分析，选择下调程度最大基因。取BMSCs按1.3.1方法分组并培养48 h，分别提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳测定总RNA量。采用miRNA逆转录试剂盒合成cDNA，65℃加热5 min使逆转录酶失活。目的基因和GAPDH引物由上海生工生物科技有限公司合成。反应条件：95℃ 预变性3 min；95℃变性 3 s、60℃退火30 s，共45个循环。采用2^−ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.5. 目的基因对BMSCs缺氧性凋亡的作用

1.5.1. 目的基因慢病毒构建

筛选的目的基因慢病毒由上海吉凯基因科技有限公司构建，包括高表达、低表达以及阴性对照。

1.5.2. 目的基因慢病毒转染BMSCs观测

实验分为4组：正常对照组、阴性对照组、高表达组及低表达组。取第3代BMSCs用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，以离心半径15 cm、1 000 r/min离心5 min，重悬调整为细胞浓度为1×10⁵个/mL的细胞悬液；接种于25 cm²培养瓶中，每瓶5 mL。正常对照组不作特殊处理。阴性对照组、高表达组、低表达组分别加入相应的慢病毒原液100 μL以及Polybrane稀释液100 μL，混匀后于37℃、5%CO₂培养条件下培养；10 h后根据细胞状态更换L-DMEM 完全培养基，以后每2～3 天常规换液1次。

转染4～5 d弃原培养基，加入含2 μg/mL嘌呤霉素的L-DMEM完全培养基加压筛选24 h；随后，将嘌呤霉素浓度减至1 μg/mL维持筛选，传3代得到稳定株。qRT-PCR检测目的基因表达水平，观察其是否转染成功。

明确转染成功后，将上述各组细胞按照筛选的缺氧条件培养48 h后，参照1.3.2方法观测目的基因转染对细胞活性及相关蛋白表达的影响。

1.6. 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。

2. 结果

2.1. 缺氧诱导BMSCs凋亡观测

培养48 h，倒置荧光显微镜下观察对照组及5%O₂组细胞呈长梭形，生长状态良好；1%O₂组、无氧组细胞部分老化、凋亡，边缘毛糙，折光性差。CCK-8法检测示，对照组、5%O₂组、1%O₂组、无氧组A值分别为2.00±0.02、1.92±0.02、1.39±0.03、0.64±0.03；线粒体膜电位检测示，红/绿荧光比值分别为1.00±0.01、0.85±0.02、0.70±0.02、0.40±0.03；流式细胞仪检测示，细胞凋亡率分别为3.27%±0.03%、3.32%±0.02%、42.1%±0.56%、70.2%±1.02%；Western blot检测示，随O₂浓度降低，HIF-1α和Caspase-3蛋白相对表达量逐渐上升，Bcl-2蛋白相对表达量下降。见图1～4。

图 1.

Observation of cell morphology under different hypoxic conditions by inverted fluorescene microscope (×100)

倒置荧光显微镜观察不同缺氧条件下细胞形态（×100）

a. 对照组；b. 5%O₂组；c. 1%O₂组；d. 无氧组

a. Control group; b. 5%O₂ group; c. 1%O₂ group; d. Anaerobic condition group

图 4.

HIF-1α, Caspase-3, and Bcl-2 protein expressions under different hypoxic conditions detected by Western blot assay

Western blot检测不同缺氧条件下细胞HIF-1α、Caspase-3及Bcl-2蛋白表达情况

a. 电泳图　Mr：相对分子质量　1：对照组　2：5%O₂组　3：1%O₂组　4：无氧组；b. 目的蛋白相对表达量

a. Electrophoresis graph　Mr: Relative molecular mass　1: Control group 2: 5%O₂ group　3: 1%O₂ group　4: Anaerobic condition group; b. Relative expressions of target proteins

图 2.

Observation of fluorescence expression under different hypoxic conditions by laser confocal microscope (×100)

激光共聚焦显微镜下观察不同缺氧条件下细胞荧光表达（×100）

从左至右分别为红色荧光（正常细胞）、绿色荧光（凋亡细胞）、DAPI以及重叠图片　a. 对照组；b. 5%O₂组；c. 1%O₂组；d. 无氧组

From left to right for red fluorescence (normal cells), green fluorescence (apoptotic cells), DAPI, and overlapping images, respectively　a. Control group; b. 5%O₂ group; c. 1%O₂ group; d. Anaerobic condition group

图 3.

Cell apoptosis under different hypoxic conditions by flow cytometry

流式细胞仪检测不同缺氧条件下细胞凋亡情况

a. 对照组；b. 5%O₂组；c. 1%O₂组；d. 无氧组

a. Control group; b. 5%O₂ group; c. 1%O₂ group; d. Anaerobic condition group

无氧组上述指标与其他组比较，差异均有统计学意义（P<0.05），故选择以该浓度培养48 h的BMSCs进行后续实验。

2.2. 缺氧BMSCs目标基因筛选及分析

基因芯片分析示，缺氧处理后BMSCs中AC125847.1、LOC102547753、AABR07017208.2、LOC103693069明显下调。qRT-PCR检测示，LOC103693069表达下调最明显，且随着缺氧程度加重，其表达也呈持续下调趋势（P<0.05），说明LOC103693069参与调控BMSCs缺氧性凋亡。见图5。

图 5.

Heat map analysis of target gene screening and qRT-PCR verification

目标基因筛选热图及qRT-PCR验证

a. 差异基因表达热图；b. qRT-PCR结果

a. Differential gene expression heat map; b. qRT-PCR results

2.3. 目的基因对BMSCs缺氧性凋亡的作用

2.3.1. 慢病毒转染后qRT-PCR检测

与正常对照组比较，慢病毒转染后高表达组LOC103693069上调（14.23±1.21）倍，低表达组下调（9.22±1.14）倍，提示目的基因成功转染至细胞。

2.3.2. 缺氧处理观测

倒置荧光显微镜下观察见低表达组细胞大量凋亡，高表达组凋亡情况较之减少。正常对照组、阴性对照组、高表达组及低表达组CCK-8法检测示A值分别为0.64±0.02、0.61±0.02、0.97±0.03、0.56±0.01；线粒体膜电位检测红/绿荧光比值分别为0.50±0.01、0.51±0.02、0.85±0.03、0.39±0.01；流式细胞仪检测细胞凋亡率分别为60.30%±1.51%、64.00%±2.03%、41.00%±0.97%、72.60%±2.35%；Western blot检测Caspase-3蛋白相对表达量分别为1.00±0.02、0.90±0.01、0.41±0.01、0.81±0.01，Bcl-2蛋白相对表达量分别为0.19±0.01、0.15±0.01、0.78±0.02、0.36±0.01。上述检测指标组间差异均有统计学意义（P<0.05）。见图6、7。

图 6.

Target protein expression of BMSCs transfected with LOC103693069 lentivirus by Western blot

LOC103693069基因慢病毒转染BMSCs后Western blot检测目的蛋白表达

Mr：相对分子质量　1：正常对照组　2：阴性对照组　3：高表达组　4：低表达组

Mr: Relative molecular mass　1: Normal control group 2: Negative control group 3: High-expression group 4: Low-expression group

图 7.

Observation of BMSCs transfected with LOC103693069 lentivirus

LOC103693069基因慢病毒转染BMSCs观测

a. 倒置荧光显微镜观察（×100）　从左至右分别为正常对照组、阴性对照组、高表达组、低表达组；b. 流式细胞仪检测 　从左至右分别为正常对照组、阴性对照组、高表达组、低表达组；c. 激光共聚焦显微镜观察（×100）　从左至右分别为红色荧光（正常细胞）、绿色荧光（凋亡细胞）、DAPI以及重叠图片　从上至下分别为正常对照组、阴性对照组、高表达组、低表达组

a. Inverted fluorescence microscope observation (×100)　From left to right for normal control group, negative control group, high-expression group, and low-expression group, respectively; b. Flow cytometry detection　From left to right for normal control group, negative control group, high-expression group, and low-expression group, respectively; c. Laser confocal microscope observation (×100)　From left to right for red fluorescence (normal cells), green fluorescence (apoptotic cells), DAPI, and overlapping images, respectively　From top to bottom for normal control group, negative control group, high-expression group, and low-expression group, respectively

缺氧处理后，低表达组细胞凋亡率较阴性对照组增高，线粒体膜电位呈低红、高绿荧光，HIF-1α和Caspase-3蛋白表达上调、Bcl-2蛋白表达下调；而高表达组逆转了上述结果，细胞凋亡率低于其他组，促进了BMSCs在缺氧条件下的存活。

3. 讨论

本研究中通过体外模拟缺氧处理BMSCs，发现细胞大量凋亡，细胞活性明显降低，线粒体膜电位下降，HIF-1α和Caspase-3蛋白相对表达量上调，Bcl-2蛋白相对表达量下调。与既往研究报道的体外缺氧处理后BMSCs大量凋亡、凋亡相关蛋白表达增加结论^[7]一致。然而，目前尚无最佳的改善BMSCs缺氧性凋亡方法，主要有调控活性氧、改善线粒体膜电位、调控HIF-1α表达等，但具体效果尚不确切^[8-9]。因此，寻找有效的抗BMSCs缺氧性凋亡方法具有重要意义。

近年来，随着对LncRNA研究的深入，越来越多证据表明以往被认为是结构不完整、无功能的LncRNA，在机体多种生物学作用中发挥了强大调控作用，为改善BMSCs缺氧性凋亡提供了一种新思路和方法，也成为该领域的研究热点。我们采用基因芯片检测了缺氧凋亡BMSCs的相关基因表达，进一步行qRT-PCR验证，最终确定LOC103693069在缺氧后表达下调最显著，且随着缺氧程度加重持续下调。有研究发现在缺氧状态下LncRNA表达异常，且在细胞功能调节中起着重要作用^[10-15]。结合上述研究结果提示LOC103693069与BMSCs缺氧性凋亡密切相关。

LncRNA属于非编码基因，其功能涉及细胞凋亡、增殖、分化、代谢等多个生物过程，特别是调控基因表达，越来越受到重视。研究显示LncRNA H19通过抑制MAPK信号通路，促进肝癌细胞凋亡^[12]；LncRNA CASC9通过稳定Nrf2的负调控因子miR-383-5P来减少Nrf2，从而在脊髓损伤神经元增殖中起关键调节作用^[13]；LncRNA RN7SK通过抑制巨噬细胞形成基因的转录，来调控巨噬细胞极化和先天免疫反应^[14]；LncRNA HOTTIP通过与多嘧啶束结合蛋白1相互作用，促进K-H型剪接调节蛋白水平，从而促进骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移^[15]。同样，我们在BMSCs缺氧模型中通过LncRNA芯片分析筛选得到LOC103693069与BMSCs缺氧性凋亡密切相关，过表达LOC103693069并缺氧处理后，BMSCs凋亡率和凋亡相关蛋白表达明显降低，当下调LOC103693069时BMSCs凋亡率增加，相关凋亡蛋白表达上调，表明了过表达LOC103693069可抑制BMSCs缺氧性凋亡。综上述，本研究证实了LOC103693069可改善 BMSCs的缺氧性凋亡。

利益冲突　所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道

伦理声明　研究方案经贵州医科大学实验动物伦理委员会批准（2101122）；实验动物使用许可证号：SYXK（黔）2018-0001

作者贡献声明　王川负责实验设计、实施及文章撰写；王涛参与实验设计与实施；谢志鸿负责数据整理和统计分析；颜杨林、邱汗柯参与实验细胞的提取和培养；彭吾训、张飞负责实验设计与评估以及文章审阅

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（81860387、81902226、82060397）

National Natural Science Foundation of China (81860387, 81902226, 82060397)